發(fā)酵工程無菌技術(shù)

1、發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 本章內(nèi)容本章內(nèi)容 一、概念一、概念 二、發(fā)酵工業(yè)污染的防治策略二、發(fā)酵工業(yè)污染的防治策略 三、發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)三、發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù) 四、培養(yǎng)基及設(shè)備滅菌四、培養(yǎng)基及設(shè)備滅菌 五、空氣除菌五、空氣除菌 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 一、概念一、概念: :滅菌、消毒、除菌、滅菌、消毒、除菌、防腐防腐 n滅菌滅菌(sterilization):用化學(xué)或物理方法殺死物料或設(shè)備中用化學(xué)或物理方法殺死物料或設(shè)備中 所有有生命物質(zhì)的過程。所有有生命物質(zhì)的過程。 消毒消毒(disinfection):用物理或化學(xué)方法殺死空氣、地表以用

2、物理或化學(xué)方法殺死空氣、地表以 及容器和器具表面的微生物。及容器和器具表面的微生物。 除菌除菌(degermation): 用過濾方法除去空氣或液體中的微生用過濾方法除去空氣或液體中的微生 物及其孢子。物及其孢子。 防腐防腐( (antisepsis): 用物理或化學(xué)方法殺死或抑制微生物的用物理或化學(xué)方法殺死或抑制微生物的 生長和繁殖生長和繁殖 。 n消毒與滅菌的區(qū)別消毒與滅菌的區(qū)別 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 二、發(fā)酵工業(yè)污染的防治策略二、發(fā)酵工業(yè)污染的防治策略 （一）污染的危害（一）污染的危害 （二）污染的防治（二）污染的防治 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 1.1.染菌的不良后果

3、染菌的不良后果 n消耗營養(yǎng)消耗營養(yǎng) n合成新產(chǎn)物合成新產(chǎn)物, 造成分離困難造成分離困難 n改變改變pH n分解產(chǎn)物分解產(chǎn)物 n噬菌體破壞極大噬菌體破壞極大 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 2.染菌危害的具體分析染菌危害的具體分析 （1 1）染菌對不同菌種發(fā)酵的影響）染菌對不同菌種發(fā)酵的影響 A細菌細菌 n谷氨酸：谷氨酸：發(fā)酵周期短，培養(yǎng)基不太豐富，較少 染雜菌，但噬菌體威脅大。 n肌苷：肌苷：缺陷型生產(chǎn)菌，培養(yǎng)基豐富，易染菌， 營養(yǎng)成分迅速被消耗，嚴重抑制菌生長和合成 代謝產(chǎn)物。 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) B. 霉菌霉菌 nPenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破壞， 發(fā)酵一無所獲

4、。 n檸檬酸：檸檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染 菌。 C. 酵母菌酵母菌: 易污染細菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：疫苗：無論污染的是活菌、死菌或內(nèi)外毒素， 都應(yīng)全部廢棄。 （1）染菌對不同菌種發(fā)酵的影響染菌對不同菌種發(fā)酵的影響 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) （2）染菌種類對發(fā)酵的影響染菌種類對發(fā)酵的影響 n青霉素：青霉素：怕染細短產(chǎn)氣桿菌 n鏈霉素：鏈霉素：怕染細短桿菌、假單孢桿菌和產(chǎn)氣桿 菌 n四環(huán)素：四環(huán)素：怕染雙球菌、芽孢桿菌和莢膜桿菌 n檸檬酸：檸檬酸：怕染青霉菌 n肌苷（酸）：肌苷（酸）：怕染芽孢桿菌 n谷氨酸：谷氨酸：怕染噬菌體，易造成連續(xù)污染 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵

5、工程無菌技術(shù) （3）不同發(fā)酵時期染菌對發(fā)酵的影響）不同發(fā)酵時期染菌對發(fā)酵的影響 n種子擴大時期染菌種子擴大時期染菌: : n發(fā)酵前期染菌發(fā)酵前期染菌： n發(fā)酵中期染菌：發(fā)酵中期染菌：挽救困難，應(yīng)早發(fā)現(xiàn)，快處理 ，處理方 法應(yīng)根據(jù)各種發(fā)酵的特點和具體情況來決定 抗生素發(fā)酵 檸檬酸發(fā)酵 a. 污染細菌：加大通風(fēng)，加速產(chǎn)酸，調(diào)pH3.0，抑制 細菌 b. 污染酵母：加入0.0250.035g/L CuSO4抑制酵母； 通風(fēng)加大，加速產(chǎn)酸. 滅菌后棄去 應(yīng)迅速重新滅菌，補充必要的營養(yǎng)成分，重新接種 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) c.染黃曲霉：加入另一罐將近發(fā)酵成熟的醪 液，pH下降，黃曲霉自溶。

6、n發(fā)酵后期污染發(fā)酵后期污染 n染菌量不太多，可繼續(xù)發(fā)酵 n污染嚴重，則提前放罐 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) （4）雜菌污染對發(fā)酵產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響）雜菌污染對發(fā)酵產(chǎn)物提取和產(chǎn)品質(zhì)量的影響 n絲狀菌發(fā)酵被產(chǎn)酸菌污染：絲狀菌發(fā)酵被產(chǎn)酸菌污染：pH不斷下降，菌絲 大量自溶，發(fā)酵液粘度增加，過濾困難 處理方法：將發(fā)酵液加熱后再加助濾劑助濾劑； 先加絮凝劑絮凝劑使蛋白質(zhì)凝聚后沉淀 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 1. 染菌的檢查與判斷染菌的檢查與判斷 n顯微鏡檢查法顯微鏡檢查法 鏡檢出雜菌需要一定時間 n平板劃線培養(yǎng)檢查法：菌落平板劃線培養(yǎng)檢查法：菌落 噬菌體檢查(雙層平板法)：噬菌斑 n

7、肉湯培養(yǎng)檢查法肉湯培養(yǎng)檢查法 n發(fā)酵過程的異?，F(xiàn)象判斷發(fā)酵過程的異?，F(xiàn)象判斷 nDO2水平異常變化 npH異常變化 n尾氣CO2異常變化 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 1 2 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 2. 污染原因分析污染原因分析 n主要原因：主要原因： 種子帶菌種子帶菌 無菌空氣帶菌無菌空氣帶菌 設(shè)備滲漏設(shè)備滲漏 滅菌不徹底滅菌不徹底 操作失誤操作失誤 技術(shù)管理不善技術(shù)管理不善 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) n從雜菌種類看：從雜菌種類看： n耐熱芽孢桿菌：與有關(guān) n球菌、無芽孢桿菌：與 有關(guān) n淺綠色菌落的雜菌：與水有關(guān)，即冷卻盤管 滲漏 n霉菌：與有關(guān)，即無菌室滅菌不徹底

8、或 操作問題 n酵母菌：糖液滅菌不徹底或放置時間較長 2. 污染原因分析污染原因分析 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) n從污染時間看：從污染時間看：早期污染可能與接 種操作不當有關(guān)；后期污染可能與及中間 補料有關(guān)。 n從染菌幅度看：從染菌幅度看：各個發(fā)酵罐或多數(shù)發(fā)酵罐染菌， 且所污染的是同一種雜菌，一般是空氣系統(tǒng)問 題，若個別罐連續(xù)染菌，一般是設(shè)備問題。 2. 污染原因分析污染原因分析 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 3. 預(yù)防預(yù)防 （1）種子帶菌的防治）種子帶菌的防治 n種子培養(yǎng)基滅菌徹底 n接種可靠：無菌室及設(shè)備可靠，無菌操 作可靠 n保藏可靠 （2）過濾空氣帶菌的防治）過濾空氣帶菌的

9、防治 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) （3）設(shè)備的滲漏或）設(shè)備的滲漏或“死角死角”造成的染菌及其防治造成的染菌及其防治 發(fā)酵罐的發(fā)酵罐的“死角死角” 法蘭、內(nèi)襯、接口、表頭、罐內(nèi)部件及其支撐件如攪拌軸 拉桿、聯(lián)軸器、冷卻盤管、擋板、空氣分布管及其支撐 件 口：人孔（或手孔）、排風(fēng)管接口、燈孔、視鏡口、進 料管口 發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢造成“死角” 消除方法：加強清洗并定期鏟除污垢；安裝放汽邊閥 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 污水 膿皰 罐底 發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢造成發(fā)酵罐罐底膿皰狀積垢造成“死角死角” 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 滅菌時蒸汽不易通達的滅菌時蒸汽不易通達的“死角死角”及

10、其消除方及其消除方 法法 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 管道安裝不當或配置不合理形成的管道安裝不當或配置不合理形成的“死角死角” 法蘭連接不當造成的法蘭連接不當造成的“死角死角” 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) （4）培養(yǎng)基與設(shè)備滅菌不徹底的防治）培養(yǎng)基與設(shè)備滅菌不徹底的防治 n原料性狀：大顆粒的原料過篩除去。 n實罐滅菌時，充分排除冷空氣。 n滅菌過程中產(chǎn)生的泡沫造成染菌：添加消泡 劑，防止泡沫升頂 n連消不徹底 ：最好采用自動控制裝置 n滅菌后期罐壓驟變 3. 預(yù)防預(yù)防 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 采取哪些措施能夠保持無菌發(fā)酵？采取哪些措施能夠保持無菌發(fā)酵？ n物料、培養(yǎng)基、中

11、間補料要滅菌；物料、培養(yǎng)基、中間補料要滅菌； n發(fā)酵設(shè)備及輔助設(shè)備（空氣過濾裝置、各種發(fā)發(fā)酵設(shè)備及輔助設(shè)備（空氣過濾裝置、各種發(fā) 酵罐進出口連接裝置）和管道要滅菌；酵罐進出口連接裝置）和管道要滅菌； n好氣發(fā)酵通入的空氣要除菌；好氣發(fā)酵通入的空氣要除菌； n種子無污染；接種無菌操作過關(guān)種子無污染；接種無菌操作過關(guān)； n為了保持發(fā)酵的長期無菌狀態(tài)，需維持正壓。為了保持發(fā)酵的長期無菌狀態(tài)，需維持正壓。 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 三、發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)三、發(fā)酵工業(yè)的無菌技術(shù)滅菌方法滅菌方法 n干熱滅菌法干熱滅菌法 n濕熱滅菌法濕熱滅菌法 n射線滅菌法射線滅菌法 n化學(xué)藥劑滅菌法化學(xué)藥劑滅菌法

12、 n過濾除菌法過濾除菌法 n火焰滅菌法火焰滅菌法 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 四、培養(yǎng)基及設(shè)備滅菌四、培養(yǎng)基及設(shè)備滅菌 （一）濕熱滅菌原理（一）濕熱滅菌原理 （二）分批滅菌（實罐滅菌）（二）分批滅菌（實罐滅菌） （三）連續(xù)滅菌（連消）（三）連續(xù)滅菌（連消） （四）分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較（四）分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 1. 熱阻熱阻 2. 微生物熱死定律：對數(shù)殘留定律微生物熱死定律：對數(shù)殘留定律 3.滅菌溫度和時間的選擇滅菌溫度和時間的選擇 4. 影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素 （一）濕熱滅菌原理（一）濕熱滅菌原理 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵

13、工程無菌技術(shù) 1. 熱阻熱阻 n定義：定義：微生物對熱的抵抗力稱為熱阻，即微生微生物對熱的抵抗力稱為熱阻，即微生 物在某一特定條件下（主要是溫度）的致死時物在某一特定條件下（主要是溫度）的致死時 間。間。 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 2. 微生物熱死定律：微生物熱死定律： (1) 對數(shù)殘留定律對數(shù)殘留定律 n在一定溫度下，微生物在一定溫度下，微生物受熱致死受熱致死遵循分子反應(yīng)速遵循分子反應(yīng)速 度理論，微生物受熱死亡的速率度理論，微生物受熱死亡的速率-dN/dt與任何瞬與任何瞬 間殘留的活菌數(shù)間殘留的活菌數(shù)N成正比，即成正比，即 kN dt dN kt N Nt 0 ln t N N kt

14、 0 log/303. 2 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 大腸桿菌在不同溫度下的殘留曲線大腸桿菌在不同溫度下的殘留曲線 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) (2) 非對數(shù)殘留定律非對數(shù)殘留定律 n某些微生物受熱死亡的速率不符合對數(shù)殘留定律：如一些某些微生物受熱死亡的速率不符合對數(shù)殘留定律：如一些 微生物芽孢。微生物芽孢。 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢在不同溫度下的死亡曲線嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢在不同溫度下的死亡曲線 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) (2) 非對數(shù)殘留定律非對數(shù)殘留定律 n某些微生物受熱死亡的速率不符合對數(shù)殘留定律：如一些某些微生物受熱死亡的速率不符合

15、對數(shù)殘留定律：如一些 微生物芽孢。微生物芽孢。 kR ks NR Ns ND dNR/dt=-kR NR dNs/dt =kR NR -ks Ns Nt/N0=KR/(kR-kS) ekst-ks/kR e-kRt 式中式中NR：耐熱性活芽孢數(shù)；耐熱性活芽孢數(shù)；Ns：敏感性活芽孢數(shù)敏感性活芽孢數(shù) ND：死亡的芽孢數(shù)死亡的芽孢數(shù)；kR：耐熱性芽孢的比死亡速率耐熱性芽孢的比死亡速率； ks：敏感性芽孢的比死亡速率；敏感性芽孢的比死亡速率； N0：初始活芽孢數(shù)。初始活芽孢數(shù)。 在在T相同時，對相同時，對 數(shù)與非對數(shù)定律的數(shù)與非對數(shù)定律的 滅菌時間滅菌時間 t 不同。不同。 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無

16、菌技術(shù) 3. 滅菌溫度和時間的選擇滅菌溫度和時間的選擇 n培養(yǎng)物質(zhì)受熱破壞也可看作一級反應(yīng)：培養(yǎng)物質(zhì)受熱破壞也可看作一級反應(yīng)： 式中式中C：對熱不穩(wěn)定物質(zhì)的濃度；對熱不穩(wěn)定物質(zhì)的濃度；k：分解速度常數(shù)分解速度常數(shù)； k的變化也遵循阿累尼烏斯方程：的變化也遵循阿累尼烏斯方程： 都與相應(yīng)的活化能及都與相應(yīng)的活化能及T有關(guān)有關(guān) Ck dt dC ) exp( RT E Ak )exp( RT E Ak 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 當當T1 T2 (k2/k1)/(k2/k1)=E/E1 (EE) 隨著隨著T上升，菌死亡速率增加倍數(shù)大于上升，菌死亡速率增加倍數(shù)大于 培養(yǎng)基成分分解速率增加倍數(shù)，故

17、一般培養(yǎng)基成分分解速率增加倍數(shù)，故一般 選擇高溫快速滅菌選擇高溫快速滅菌 。 3. 滅菌溫度和時間的選擇滅菌溫度和時間的選擇 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 4. 影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素 n培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基成分 n油脂、糖類及一定濃度的蛋白質(zhì)、高濃度有機油脂、糖類及一定濃度的蛋白質(zhì)、高濃度有機 物等增加微生物的耐熱性物等增加微生物的耐熱性 n低濃度（低濃度（1%-2%）NaCl對微生物有保護作用，對微生物有保護作用， 隨著濃度增加，保護作用減弱，當濃度達隨著濃度增加，保護作用減弱，當濃度達8%- 10%以上，則減弱微生物的耐熱性。以上，則減弱微生物的耐熱性。 發(fā)酵工

18、程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) npH：pH6.0-8.0，微生物最耐熱，微生物最耐熱，pH6.0，H+ 易滲入微生物細胞內(nèi)，改變細胞的生理反應(yīng)促易滲入微生物細胞內(nèi)，改變細胞的生理反應(yīng)促 使其死亡。使其死亡。培養(yǎng)基培養(yǎng)基pH愈低，滅菌所需時間愈愈低，滅菌所需時間愈 短。短。 n培養(yǎng)基的物理狀態(tài)培養(yǎng)基的物理狀態(tài) n泡沫：泡沫中的空氣形成隔熱層，對滅菌極為泡沫：泡沫中的空氣形成隔熱層，對滅菌極為 不利，可加入少量消泡劑不利，可加入少量消泡劑 。 n培養(yǎng)基中的微生物數(shù)量培養(yǎng)基中的微生物數(shù)量 4. 影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素影響培養(yǎng)基滅菌的其它因素 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 分空氣過濾器滅菌分空氣過

19、濾器滅菌 并用空氣吹干并用空氣吹干 夾套或蛇管排冷水，開啟排夾套或蛇管排冷水，開啟排 氣管閥，空氣管通蒸汽，也氣管閥，空氣管通蒸汽，也 可夾套內(nèi)通蒸汽可夾套內(nèi)通蒸汽 達達70左右左右 取樣管取樣管 放料管放料管 通蒸汽通蒸汽 120，1105pa 保溫保溫 保溫階段，凡液面以下各管保溫階段，凡液面以下各管 道都應(yīng)通蒸汽，液面上其余道都應(yīng)通蒸汽，液面上其余 各管道則應(yīng)排蒸汽，不留死各管道則應(yīng)排蒸汽，不留死 角，維持壓力、溫度恒定角，維持壓力、溫度恒定 罐壓接近空氣壓力罐壓接近空氣壓力向罐內(nèi)通無菌空氣向罐內(nèi)通無菌空氣 保溫結(jié)束，依次關(guān)閉保溫結(jié)束，依次關(guān)閉 各排汽、進汽閥門各排汽、進汽閥門 夾套或蛇

20、管中通冷水夾套或蛇管中通冷水 培養(yǎng)基降溫到所需溫度培養(yǎng)基降溫到所需溫度 （二）分批滅菌（實罐滅菌）（二）分批滅菌（實罐滅菌） 1.滅菌工藝過程滅菌工藝過程 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) n升溫、冷卻兩階段也有一定的滅菌效果，考慮升溫、冷卻兩階段也有一定的滅菌效果，考慮 到滅菌的可靠性主要在保溫階段進行，故可以到滅菌的可靠性主要在保溫階段進行，故可以 簡單地利用式簡單地利用式 (N/N0) =-kt 來粗略估算滅菌所需時間。來粗略估算滅菌所需時間。 2. 滅菌時間的估算滅菌時間的估算 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 2. 滅菌時間的估算滅菌時間的估算 n例例1：有一發(fā)酵罐內(nèi)裝：有一發(fā)酵罐內(nèi)

21、裝40m3培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基，在1210C溫度下實溫度下實 罐滅菌，原污染程度為每罐滅菌，原污染程度為每1ml有有2105個耐熱細菌芽孢，個耐熱細菌芽孢， 已知已知1210C時滅菌速度常數(shù)時滅菌速度常數(shù)k=1.8min-1，求滅菌失敗機，求滅菌失敗機 率為率為0.001時所需時間。時所需時間。 解解：N0=401062105=81012(個) Nt=0.001(個) k=1.8(min-1) (Nt/N0)=-kt t=2.303/klg(N0/Nt)=2.303/1.8lg(81015) =20.34(min) 由于升溫階段就有部分菌被殺滅，特別是當培由于升溫階段就有部分菌被殺滅，特別是當培

22、養(yǎng)基加熱至養(yǎng)基加熱至1000C以上，這個作用較為顯著，以上，這個作用較為顯著， 故實際保溫階段時間比計算值要短。故實際保溫階段時間比計算值要短。 n 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) （三）連續(xù)滅菌（連消）（三）連續(xù)滅菌（連消） n工藝流程工藝流程 n噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程 n噴射加熱連續(xù)滅菌流程噴射加熱連續(xù)滅菌流程 n薄板式換熱器連續(xù)滅菌流程薄板式換熱器連續(xù)滅菌流程 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 配料罐 連消泵 連消塔 維持罐 冷卻罐 蒸汽 蒸汽 放汽 冷卻水 無菌培養(yǎng)基 進發(fā)酵罐 噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程噴淋冷卻連續(xù)滅菌流程 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) （三）連續(xù)滅

23、菌（連消）（三）連續(xù)滅菌（連消） n滅菌時間的計算滅菌時間的計算 (Ct/C0)=kt t=2.303/klg(C0/Ct) 式中：式中：C0、Ct分別為單位體積培養(yǎng)基滅菌前、分別為單位體積培養(yǎng)基滅菌前、 后后1ml菌液的含菌數(shù)。菌液的含菌數(shù)。 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) n例例2某發(fā)酵罐內(nèi)裝某發(fā)酵罐內(nèi)裝40m3培養(yǎng)基，采用連續(xù)滅菌，培養(yǎng)基，采用連續(xù)滅菌， 滅菌溫度為滅菌溫度為1310C，原污染程度為每，原污染程度為每1ml含有含有 2105個雜菌，已知個雜菌，已知1310C時滅菌速度常數(shù)為時滅菌速度常數(shù)為 15min-1，求滅菌所需的維持時間。，求滅菌所需的維持時間。 連續(xù)滅菌時間的估

24、算連續(xù)滅菌時間的估算 解：解：C0=2105(個/ml) Ct=0.001/(40106)=2.510-11(個/ml) t=2.303/klg(C0/Ct)=2.303/15lg(2105)/(2.510-11) =2.37 min 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較 n連續(xù)滅菌的優(yōu)點：（適用于大型罐）連續(xù)滅菌的優(yōu)點：（適用于大型罐） n可采用高溫短時滅菌，營養(yǎng)成分破壞少，有可采用高溫短時滅菌，營養(yǎng)成分破壞少，有 利于提高發(fā)酵產(chǎn)率；利于提高發(fā)酵產(chǎn)率； n發(fā)酵罐利用率高；發(fā)酵罐利用率高； n蒸汽負荷均衡；蒸汽負荷均衡； n采用板式換熱器時，可節(jié)約

25、大量能量；采用板式換熱器時，可節(jié)約大量能量； n適宜采用自動控制，勞動強度?。贿m宜采用自動控制，勞動強度小； n可實現(xiàn)將耐熱性物料和不耐熱性物料在不同可實現(xiàn)將耐熱性物料和不耐熱性物料在不同 溫度下分開滅菌，減少營養(yǎng)成分的破壞。溫度下分開滅菌，減少營養(yǎng)成分的破壞。 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) n缺點：缺點： n對小型罐無優(yōu)勢，不方便，對設(shè)備要求高；對小型罐無優(yōu)勢，不方便，對設(shè)備要求高； n蒸汽波動時滅菌不徹底；蒸汽波動時滅菌不徹底； n當培養(yǎng)基中含有固體顆?；蛴休^多泡沫時，當培養(yǎng)基中含有固體顆?；蛴休^多泡沫時， 以分批滅菌好，防止滅菌不徹底。以分批滅菌好，防止滅菌不徹底。 分批滅菌與連續(xù)滅

26、菌的比較分批滅菌與連續(xù)滅菌的比較 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 五、空氣除菌五、空氣除菌 （一）概述（一）概述 （二）空氣過濾除菌流程（二）空氣過濾除菌流程 （三）空氣預(yù)處理（三）空氣預(yù)處理 （四）空氣預(yù)處理流程設(shè)計應(yīng)用舉例（四）空氣預(yù)處理流程設(shè)計應(yīng)用舉例 （五）空氣過濾介質(zhì)（五）空氣過濾介質(zhì) （六）空氣過濾除菌原理（六）空氣過濾除菌原理 （七）提高過濾除菌效率的措施（七）提高過濾除菌效率的措施 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) （一）概述（一）概述 n空氣除菌的必要性空氣除菌的必要性 以一個以一個50m3的發(fā)酵罐為例，若裝料系數(shù)為的發(fā)酵罐為例，若裝料系數(shù)為0.7，要，要 求每立方米發(fā)酵液

27、每分鐘通氣求每立方米發(fā)酵液每分鐘通氣0.8m3，培養(yǎng)周期，培養(yǎng)周期 170h，那么每個周期需通氣量，那么每個周期需通氣量2.86105 m3(500.7 0.8 170 60)，而每，而每立方米大氣立方米大氣 中約有中約有103-104個微生物。個微生物。 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) n空氣除菌方法空氣除菌方法 n輻射殺菌：超聲波、高能陰極射線，輻射殺菌：超聲波、高能陰極射線，x射線、射線、射線、射線、 射線、紫外線射線、紫外線(2265 3287 ) n加熱殺菌：加熱方法可用蒸汽、電和空氣壓縮機產(chǎn)加熱殺菌：加熱方法可用蒸汽、電和空氣壓縮機產(chǎn) 生的熱量生的熱量 n靜電除菌靜電除菌 ：常用

28、于潔凈工作臺、潔凈工作室所需無：常用于潔凈工作臺、潔凈工作室所需無 菌無塵空氣的第一次除塵，配合高效過濾器使用。菌無塵空氣的第一次除塵，配合高效過濾器使用。 n過濾除菌：采用定期滅菌的介質(zhì)來阻截流過的空氣過濾除菌：采用定期滅菌的介質(zhì)來阻截流過的空氣 所含的微生物而取得無菌空氣。常用的過濾介質(zhì)有所含的微生物而取得無菌空氣。常用的過濾介質(zhì)有 棉花、活性炭、玻璃纖維、有機合成纖維、有機和棉花、活性炭、玻璃纖維、有機合成纖維、有機和 無機燒結(jié)材料等等。無機燒結(jié)材料等等。 （一）概述（一）概述 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 1. 對空氣過濾除菌流程的要求對空氣過濾除菌流程的要求 n流程主要設(shè)備流程主

29、要設(shè)備：空氣壓縮機空氣壓縮機 、空氣過濾器空氣過濾器 附屬設(shè)備：粗過濾器、空氣冷卻器、氣液分離器、空氣貯罐、附屬設(shè)備：粗過濾器、空氣冷卻器、氣液分離器、空氣貯罐、 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) n流程的制定應(yīng)根據(jù)所在地的地理、氣候環(huán)境和設(shè)備條流程的制定應(yīng)根據(jù)所在地的地理、氣候環(huán)境和設(shè)備條 件綜合考慮件綜合考慮 n環(huán)境污染比較嚴重的地方，要考慮改變吸風(fēng)的條件；環(huán)境污染比較嚴重的地方，要考慮改變吸風(fēng)的條件； n在溫暖潮濕的南方，要加強除水設(shè)施在溫暖潮濕的南方，要加強除水設(shè)施 ； n壓縮機耗油嚴重的設(shè)備流程中則要加強消除油霧的壓縮機耗油嚴重的設(shè)備流程中則要加強消除油霧的 污染污染 ，也可采用無油

30、潤滑的往復(fù)式壓縮機；也可采用無油潤滑的往復(fù)式壓縮機； n通常要求壓縮空氣的相對濕度通常要求壓縮空氣的相對濕度=50%60%時通過過時通過過 濾器為好。濾器為好。 1. 對空氣過濾除菌流程的要求對空氣過濾除菌流程的要求 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 2. 空氣除菌流程的分析空氣除菌流程的分析 n空氣除菌系統(tǒng)包括：空氣除菌系統(tǒng)包括：冷卻、分離油水、加熱、過濾冷卻、分離油水、加熱、過濾 n幾種典型的設(shè)備流程幾種典型的設(shè)備流程 兩級冷卻、加熱除菌流程兩級冷卻、加熱除菌流程 一次冷卻、加熱除菌流程一次冷卻、加熱除菌流程 一級冷卻（將空氣冷卻至露點以上）的除菌流程一級冷卻（將空氣冷卻至露點以上）的除菌

31、流程 一次冷卻、冷熱空氣直接混合式除菌流程一次冷卻、冷熱空氣直接混合式除菌流程 一次冷卻、利用熱空氣加熱冷空氣流程一次冷卻、利用熱空氣加熱冷空氣流程 高效前置過濾空氣除菌流程高效前置過濾空氣除菌流程 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 兩級冷卻、加熱的流程圖兩級冷卻、加熱的流程圖 1-粗過濾器；粗過濾器；2-空壓機；空壓機；3-貯罐；貯罐；4，6-冷卻器；冷卻器；5-旋風(fēng)分離器；旋風(fēng)分離器；7-絲網(wǎng)分離器；絲網(wǎng)分離器； 8-加熱器；加熱器；9-過濾器過濾器 一次冷卻、加熱的流程圖一次冷卻、加熱的流程圖 1高空采風(fēng)；高空采風(fēng)；2粗過濾器；粗過濾器；3壓縮機；壓縮機；4冷卻器；冷卻器；5，6析水器；

32、析水器； 7貯罐；貯罐；8加熱器；加熱器；9空氣總過濾器；空氣總過濾器；10空氣分過濾器空氣分過濾器 一級冷卻（將空氣冷卻至露點以上）的流程圖一級冷卻（將空氣冷卻至露點以上）的流程圖 1高空采風(fēng)；高空采風(fēng)；2粗過濾器；粗過濾器；3壓縮機；壓縮機；4冷卻器；冷卻器；5冷卻器；冷卻器；6空氣空氣 總過濾器；總過濾器；7空氣分過濾器空氣分過濾器 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 一次冷卻、冷熱空氣直接混合式流程圖一次冷卻、冷熱空氣直接混合式流程圖 1-粗過濾器；粗過濾器；2-壓縮機；壓縮機；3-貯罐；貯罐；4-冷卻器；冷卻器；5-絲網(wǎng)分離器；絲網(wǎng)分離器；6-過濾器過濾器 一次冷卻、利用熱空氣加熱冷空

33、氣的流程圖一次冷卻、利用熱空氣加熱冷空氣的流程圖 1-高空采風(fēng)；高空采風(fēng)；2-粗過濾器；粗過濾器；3-壓縮機；壓縮機；4-熱交換器；熱交換器；5-冷卻器；冷卻器；6，7-析水器；析水器； 8-空氣總過濾器；空氣總過濾器；9-空氣分過濾器空氣分過濾器 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 高效前置過濾流程圖高效前置過濾流程圖 1高效前置過濾器；高效前置過濾器；2壓縮機；壓縮機；3貯罐；貯罐；4冷卻器；冷卻器；5絲網(wǎng)分離器；絲網(wǎng)分離器； 6加熱器；加熱器；7過濾器過濾器 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 空氣預(yù)處理原理空氣預(yù)處理原理 n除塵除塵(外源空氣的前處理外源空氣的前處理)：防塞，提高過濾效率和

34、 濾器壽命；措施：建吸風(fēng)塔、粗過濾器（布袋過 濾器、填料過濾器、油浴洗滌和水霧除塵裝置 等）、高效前置過濾器 n降溫：降溫：防燒傷介質(zhì)及水分蒸發(fā)嚴重，對發(fā)酵不利 n除油、除水：除油、除水：防塞（因油膜堵），防止過濾器長 菌堵塞（因水滴） n加熱：加熱：保持相對濕度 n穩(wěn)壓：穩(wěn)壓：防止壓力波動，貯罐 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 空氣壓縮和壓縮空氣的冷卻空氣壓縮和壓縮空氣的冷卻 n空氣的壓縮過程可看作絕熱過程，故壓縮后的空氣溫度與空氣的壓縮過程可看作絕熱過程，故壓縮后的空氣溫度與 被壓縮的程度有關(guān)：被壓縮的程度有關(guān)： T2=T1(P2/P1)(k-1)/k 式式中中 T1,T2壓縮前后空氣的

35、絕對溫度，壓縮前后空氣的絕對溫度，K P1,P2 壓縮前后空氣的絕對壓強，壓縮前后空氣的絕對壓強，Pa k絕熱指數(shù)，空氣為絕熱指數(shù)，空氣為1.4 若壓縮為多變過程，則可用多變指數(shù)若壓縮為多變過程，則可用多變指數(shù)m（對于（對于 空氣空氣m=1.2-1.3）代替絕熱指數(shù)）代替絕熱指數(shù)k。 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) n例例4-1：20oC的大氣被壓縮至表壓的大氣被壓縮至表壓 2.5kg/cm2時時 溫度是多少？溫度是多少？ 解：解：T1=20+273=293k P2/P1=（2.5+1.033）/1.033=3.42 m=1.3 T2=T1(P2/P1)(m-1)/m=2933.420.3/

36、1.3=389k t2=389-273=116oC 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 壓縮空氣冷卻后的除水、除油壓縮空氣冷卻后的除水、除油 （1）幾個與濕空氣相關(guān)的重要概念）幾個與濕空氣相關(guān)的重要概念 n空氣的絕對濕度：空氣的絕對濕度：1m3 濕空氣中含有的水蒸氣絕對量(kg) n空氣的相對濕度（空氣的相對濕度（）：）：空氣的絕對濕度與同溫度下飽 和絕對濕度之比值或者空氣中水蒸汽分壓與同溫度時的 飽和水蒸汽壓之比值，稱為空氣的相對濕度。 =Pw/Ps 式中 Pw空氣中水蒸氣分壓， Pa Ps同溫度下水的飽和蒸氣壓，Pa， 它可由各 類手冊中查到。 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) n空氣的濕含

37、量（空氣的濕含量（X）：）：1kg干空氣中含有的水汽量 （ kg/kg干空氣） 設(shè)Gg kg干空氣中含Gw kg水蒸汽時，則 X=Gw/Gg 又Pw/Pg=nw/ng=(Gw/Mw)/(Gg/Mg) =(Gw/Gg)(Mg/Mw) （Mw，Mg分別為水和空氣的分子量） X=Gw/Gg=(PwMw)/(PgMg)=(18/28.94)(Pw/Pg) =0.622Pw/(P-Pw) （4-1） 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) （2）與與X的關(guān)系的關(guān)系 將將Ps=Pw代入式代入式4-1中得中得 X=0.622Ps/（P-Ps） 所以，已知某一溫度所以，已知某一溫度T時時值值，便可求得便可求得X。

38、當當X一定時一定時，T1T2，導(dǎo)致導(dǎo)致12 ，則則 X1=0.6221P s1 /(P1-1P s1 ) X2=0.6222P s2 /(P2-2P s2 ) X1=X2 ，故， 2=1(P S1 /P S2 )(P2/P1) 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 當當X發(fā)生變化，即有水析出時，發(fā)生變化，即有水析出時，X降低，此時降低，此時2=100%， 定義：當定義：當=100%時，空氣中水蒸氣已飽和，此時溫度時，空氣中水蒸氣已飽和，此時溫度 稱為露點稱為露點Td。 當當TTd時，有水析出時，有水析出，X 。 當當X=0時，壓縮過程中，隨著時，壓縮過程中，隨著T，Ps，P，； 降溫過程中，隨著降

39、溫過程中，隨著T ，Ps ，P一定一定， 。 發(fā)酵工程無菌技術(shù)發(fā)酵工程無菌技術(shù) 空氣預(yù)處理流程設(shè)計空氣預(yù)處理流程設(shè)計 n例例4-2：溫度：溫度20、=85%的空氣，當壓縮至的空氣，當壓縮至 2.0kg/cm2時，溫度為時，溫度為120，求此時空氣相對濕度是多，求此時空氣相對濕度是多 少？若在壓力不變的情況下將溫度冷卻至少？若在壓力不變的情況下將溫度冷卻至40后，相后，相 對濕度又是多少？對濕度又是多少？ 已知：已知：20時時，Ps1=0.0238 kg/cm2,120時時，Ps2=2.025 kg/cm2 ，40時時，Ps3=0.0752 kg/cm2 解：解：120時，相對濕度為時，相對濕度為 40時，相對濕度為時，相對濕度為 %93. 2 033. 1 033. 3 025. 2 0238. 0 %85 1 2 2 1 12 p p p p s s %9 .78 0752. 0 025. 2 0293.