育種出發(fā)菌的分離篩選

1、第五章 育種出發(fā)菌的分離篩 選 2 向菌種保藏機(jī)構(gòu)索取有關(guān)的菌株。 菌種來源的途徑 國內(nèi)外著名的菌種保藏機(jī)構(gòu)有： CCCCM (中國微生物保藏管理委員會） ATCC (美國典型菌種保藏中心） NCTC (英國國家典型菌種保藏所) IFO (大阪發(fā)酵研究所) 2. 從一些發(fā)酵制品中分離目的菌株。容易篩選到較理想 的菌株。 3. 由自然界采集樣品中獲得。如土壤、水、動植物 體等，從中進(jìn)行分離篩選。容易發(fā)現(xiàn)新的菌株資源。 3 菌株分離與篩 選 菌株分離(separation)：是將樣品中混雜生長的各種微 生物通過分離技術(shù)區(qū)分開，獲得所需微生物的過程 。 菌株篩選(screening)：在目的菌株分離

2、的基礎(chǔ)上，結(jié) 合常規(guī)生產(chǎn)性能測定，選擇目的產(chǎn)物合成能力相對 高的菌株的過程。 4 菌株分離和 篩選 5 第一節(jié)第一節(jié) 含微生物樣品的采集含微生物樣品的采集 第二節(jié)第二節(jié) 含微生物樣品的富集培養(yǎng)含微生物樣品的富集培養(yǎng) 第三節(jié)第三節(jié) 微生物的分離微生物的分離 第四節(jié)第四節(jié) 野生菌株篩選和目的產(chǎn)物鑒定野生菌株篩選和目的產(chǎn)物鑒定 主要內(nèi)容 6 第一節(jié) 含微生物樣品的采集 7 含微生物樣品的采集 一、從土壤中采樣 1 根據(jù)土壤特點(diǎn)采集 土壤有機(jī)質(zhì)含量和通氣狀況 8 A soil profile B 堆積枯枝落葉，下部已初步分 解 腐殖質(zhì)含量高，與礦物顆粒緊 密結(jié)合形成暗色土層 物質(zhì)淋失，顏色較淺 淋濾層

3、淋移物質(zhì)在沉積層沉積， 多形成核狀、柱狀、棱狀結(jié) 構(gòu)，較緊實(shí) 土層較深，受成土因素影響 小，保持母質(zhì)特性 9 不同土壤類型 10 地理?xiàng)l件 南方土壤比北方土壤中的微生物數(shù)量和種類 都要多。 季節(jié)條件 秋季是采樣的良好季節(jié) 土壤的酸堿度 11 2 土壤中采樣的方法 選點(diǎn) 取土 裝袋 標(biāo) 記 用取樣鏟，將表層5cm左右的浮土除去，取5-25cm 處的土樣10-25g， 記錄地點(diǎn)、土壤質(zhì)地、植被名稱、時間及其他環(huán) 境條件 12 二、根據(jù)微生物生理特點(diǎn)采樣 根據(jù)微生物營養(yǎng)類型 微生物的營養(yǎng)需要和代謝類型與其生長 環(huán)境有著很大的相關(guān)性。 在篩選一些具有特殊性能的微生物時，需 根據(jù)該微生物獨(dú)特的生理特性到

4、相應(yīng)的地點(diǎn)采樣。 根據(jù)微生物的生理特性 13 局部環(huán)境條件。如：海洋、腸道、溫泉、堆肥 極端環(huán)境條件。 在絕大多數(shù)微生物所不能生長的高溫、低溫、高 酸、高堿、高鹽或高輻射強(qiáng)度的環(huán)境下，也有少數(shù)微生物 存在，這類微生物被稱為極端環(huán)境微生物。 三、特殊環(huán)境下采樣 14 第二節(jié)第二節(jié) 含微生物樣品的富集培養(yǎng)含微生物樣品的富集培養(yǎng) 15 富集(enrichment)培養(yǎng)：是在目的微生物含量較少時 ，根據(jù)微生物的生理特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一種選擇性培養(yǎng)基，并創(chuàng) 造有利的生長條件，使目的微生物在合適的環(huán)境下迅速生 長繁殖，由原來自然條件下的劣勢種變成人工環(huán)境下的優(yōu) 勢種，以利分離到所需要菌株的過程。 富集培養(yǎng)主要根據(jù)

5、微生物的碳源、氮源、pH、溫度、 需氧情況等生理因素加以控制。 16 一、控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分 二、控制培養(yǎng)條件 通過對pH、溫度及通氣量等其他一些條件的特殊 要求加以控制培養(yǎng)，達(dá)到有效的分離目的。 如 pH 細(xì)菌、放線菌：一般要求偏堿(pH7.2-7.5)， 霉菌和酵母菌：要求偏酸(pH4.5-6)。 17 三、抑制不需要的菌類 通過高溫、高壓、加入抗生素等方法減少非目的微生物 的數(shù)量，使目的微生物的比例增加，達(dá)到富集的目的。 如： 硫乙醇酸鈉造成厭氧環(huán)境，利于厭氧菌生長。 抗生素可抑制細(xì)菌生長，用于培養(yǎng)霉菌。 18 被分離的被分離的 微生物微生物 添加物質(zhì)及其濃度添加物質(zhì)及其濃度被抑制的被

6、抑制的 微生物微生物 放線菌放線菌 放線菌酮（放線菌酮（50），制霉菌素（），制霉菌素（50），環(huán)己亞氨），環(huán)己亞氨 （50），匹馬霉素（），匹馬霉素（50），丙酸鈉（），丙酸鈉（4mg） 霉菌霉菌 革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌 其他革蘭氏陽其他革蘭氏陽 性菌性菌 環(huán)己亞氨環(huán)己亞氨+多黏菌素多黏菌素+枯草菌素（各枯草菌素（各20單位），單位）， 多黏菌素多黏菌素B（5）+青霉素（青霉素（1） 細(xì)菌細(xì)菌 放線菌酮（放線菌酮（50-500），制霉菌素（），制霉菌素（100），優(yōu)洛），優(yōu)洛 殺菌素（殺菌素（30-100）（）（eu-rocidin） 霉菌、酵母菌霉菌、酵母菌 原蟲霉素（原蟲霉素（5）原生

7、動物原生動物 革蘭氏陽性菌革蘭氏陽性菌 多黏菌素多黏菌素B（5）革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌 革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌 青霉素（青霉素（1），月桂酸鈉（），月桂酸鈉（2mg）革蘭氏陽性菌革蘭氏陽性菌 酵母菌酵母菌 氯霉素（氯霉素（100），青霉素（），青霉素（20）+鏈霉素（鏈霉素（40），）， 玫瑰紅（玫瑰紅（50）+放線菌酮（放線菌酮（10） 細(xì)菌細(xì)菌 放線菌酮放線菌酮霉菌霉菌 霉菌菌霉菌菌 氯霉素（氯霉素（100），青霉素（），青霉素（20）+鏈霉素（鏈霉素（40），）， 玫瑰紅（玫瑰紅（35-67） 氯霉素（氯霉素（50）+放線菌酮（放線菌酮（10），青霉素（），青霉素（100 ） 細(xì)菌細(xì)

8、菌 細(xì)菌、酵母菌細(xì)菌、酵母菌 19 第三節(jié)第三節(jié) 微生物的分離微生物的分離 20 一、好氣微生物的分離 分離的方法很多，可分為“菌落純”和“菌株純 ”。 1 稀釋涂布法 21 2 劃線分離法 22 3 利用生化反應(yīng)進(jìn)行分離 飽浸含某種指示 劑的固體培養(yǎng)基 的濾紙片變色圈 固體培養(yǎng)基中滲入溶解性 差、可被特定菌利用的營 養(yǎng)成分，造成不透明的培 養(yǎng)基背景。菌落利用此物 質(zhì)形成透明圈。 利用某種營養(yǎng)缺陷型微生 物作為指示菌，若待篩選 菌具有將前體物轉(zhuǎn)化成營 養(yǎng)物的能力，指示菌就能 圍繞該菌生長。 待篩選的菌株能 分泌產(chǎn)生某些能 抑制指示菌生長 的物質(zhì) 指示劑直接摻入或噴灑固體 培養(yǎng)基，菌落周圍形成變

9、色 圈。如淀粉的平皿上噴上稀 碘液 23 變色圈法： 24 透明圈法 25 脂酶產(chǎn)生菌的分離： 可采用固體平板變色圈法。 甘油三丁酸脂為底物，羅丹明 B 為指示劑，觀察熒光圈； 制備維多利亞藍(lán)乳脂瓊脂培養(yǎng)基( pH 7.0 ) ，將樣品涂布 在平板上培養(yǎng)，陽性反應(yīng)由粉紅色變?yōu)樗{(lán)色。 改良雙層法：平皿底層倒一層營養(yǎng)瓊脂，把一片浸有被維 多利亞藍(lán)染色的乳脂的圓紙片鋪在上面，然后覆蓋一薄層含樣 品營養(yǎng)瓊脂，保溫培養(yǎng)，陽性反應(yīng)為藍(lán)色。 26 4 組織分離法 是從一些罹病組織或特殊組織中分離菌株的方法。 對一般患病組織的分離方法 取樣無菌水洗滌表面消毒無菌水洗滌表面 植入平板，培養(yǎng)鏡檢，分離純化 27

10、食用菌孢子分離法 a. 多孢子分離法 孢子采集裝置 28 NT-88NE NT-88NE 顯微 操作系統(tǒng) ： (NARISHIGE) 適用于各種用 途：轉(zhuǎn)基因、 遺傳工程、人 工受精、胚胎 移植、和電生 理學(xué)方面。 b. 單孢子分離法 29 5 特殊菌類環(huán)保菌的分離 在分離某類污染物或廢棄物的降解微生物時，通 常采用以該物質(zhì)為唯一碳源或氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行富集 培養(yǎng)，經(jīng)過幾個月的富集培養(yǎng)后，通過劃線或涂布的 方法進(jìn)行在分離平板上分離、篩選。 該法在分離苯胺、DDT、甲基對硫磷（MP）、石油 、甲胺磷等污染物降解菌時取得良好效果。 注意：環(huán)境污染物一般對微生物的生長有抑制作用，需 要根據(jù)不同情況設(shè)計(jì)

11、合理的篩選模型。 30 二、厭氣菌的分離 加還原劑 焦性沒食子酸法 平皿厭氣培養(yǎng)法 試管厭氣培養(yǎng)法 玻璃板隔絕空氣培養(yǎng)法 生物吸氧法 31 厭氧培養(yǎng)袋厭氧培養(yǎng)罐厭氧工作站 厭氧操作儀器 32 第四節(jié) 野生菌株篩選和目的產(chǎn)物 鑒定 33 一、初篩 定義：從大量分離到的微生物中將能合成目的產(chǎn)物 的微生物篩選出來的過程。篩選的方法有以下兩種： 1 平板篩選 用于在分離純化階段隨機(jī)挑選的菌株，用選擇性平板 進(jìn)行定性測定。 特點(diǎn)：快速，簡捷，效率高。 34 2 搖瓶發(fā)酵篩選 用于經(jīng)過定性篩選的菌種，通過搖瓶發(fā)酵進(jìn)一步測 定菌株相互之間產(chǎn)物活性的差異。 特點(diǎn)：比較接近發(fā)酵罐培養(yǎng)條件。 接種發(fā)酵制作含指示菌或底物的