植物細胞培養(yǎng)11

1、2.1 植物組織與細胞培養(yǎng)區(qū)別 組織培養(yǎng)概念：組織培養(yǎng)概念：指從機體內(nèi)取出組織或細胞，模擬機體內(nèi)生理條件，在體外進行指從機體內(nèi)取出組織或細胞，模擬機體內(nèi)生理條件，在體外進行 培養(yǎng)，使之生存或生長成組織。培養(yǎng)，使之生存或生長成組織。 細胞培養(yǎng)概念：細胞培養(yǎng)概念：植物細胞在體外條件下的存活或生長，此時細胞不再形成組織。植物細胞在體外條件下的存活或生長，此時細胞不再形成組織。 2.2 2.2 植物組織的發(fā)展簡史 l探索階段（本世紀初探索階段（本世紀初 3030年代中）年代中） 19021902年，德國植物生理學家年，德國植物生理學家HaberlancltHaberlanclt首次進行了細首次進行了細

2、 胞培養(yǎng)實驗胞培養(yǎng)實驗 奠基階段（奠基階段（3030 5050年代）年代） 19341934年，年，WhiteWhite 等用番茄根尖的組織培養(yǎng)，建立了第一等用番茄根尖的組織培養(yǎng)，建立了第一 個活躍生長的無性繁殖系。個活躍生長的無性繁殖系。 WhiteWhite正式提出植物細胞具有全能性學說，即單正式提出植物細胞具有全能性學說，即單 細胞經(jīng)過人工培養(yǎng)，通過細胞分裂能恢復完整植株。細胞經(jīng)過人工培養(yǎng)，通過細胞分裂能恢復完整植株。 19341934年，年，White White 和和WentWent 等分別發(fā)現(xiàn)等分別發(fā)現(xiàn)B B族維生素和吲哚乙族維生素和吲哚乙 酸（酸（IAAIAA）對培養(yǎng)的離體根生長

3、具有重要作用。）對培養(yǎng)的離體根生長具有重要作用。 1937-19381937-1938年，年， GautheretGautheret、NobecourtNobecourt 培養(yǎng)胡蘿卜根培養(yǎng)胡蘿卜根 和馬鈴薯的塊莖薄壁組織，獲得愈傷組織。將愈傷組織和馬鈴薯的塊莖薄壁組織，獲得愈傷組織。將愈傷組織 置于瓊脂培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，可無限發(fā)生細胞增殖。置于瓊脂培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，可無限發(fā)生細胞增殖。 White White、GautheretGautheret、Nobecourt Nobecourt 等科學家被譽為等科學家被譽為 植物組織培養(yǎng)的奠基人植物組織培養(yǎng)的奠基人 19571957年年SkoogSko

4、og和和MillerMiller提出了植物激素控制器官形提出了植物激素控制器官形 成的概念，指出通過改變培養(yǎng)基中生長素和細胞分成的概念，指出通過改變培養(yǎng)基中生長素和細胞分 裂素的比率，可以控制器官的分化，即生長素和細裂素的比率，可以控制器官的分化，即生長素和細 胞分裂素高促進根的分化，低促進莖和芽的分化。胞分裂素高促進根的分化，低促進莖和芽的分化。 19581958年，施圖爾德從胡蘿卜愈傷組織獲得單細胞，年，施圖爾德從胡蘿卜愈傷組織獲得單細胞， 并經(jīng)誘導形成了胚狀體再生了植株，是世界上首次并經(jīng)誘導形成了胚狀體再生了植株，是世界上首次 證明植物細胞的全能性。證明植物細胞的全能性。 迅速發(fā)展階段（

5、迅速發(fā)展階段（6060年代后）年代后） 1 1、原生質(zhì)體培養(yǎng)和細胞融合。、原生質(zhì)體培養(yǎng)和細胞融合。 2 2、微繁技術、微繁技術 2.3 2.3 植物組織培養(yǎng)重要概念和理論基礎 l植物組織培養(yǎng)：植物組織培養(yǎng)：在無在無 菌條件下，將離體的菌條件下，將離體的 植物器官、組織、細植物器官、組織、細 胞、胚胎、原生質(zhì)體，胞、胚胎、原生質(zhì)體， 培養(yǎng)在人工配制的培培養(yǎng)在人工配制的培 養(yǎng)基上，給予適宜的養(yǎng)基上，給予適宜的 培養(yǎng)條件，誘發(fā)產(chǎn)生培養(yǎng)條件，誘發(fā)產(chǎn)生 愈傷組織，或潛伏芽愈傷組織，或潛伏芽 等，或長成完整的植等，或長成完整的植 株，統(tǒng)稱為植物組織株，統(tǒng)稱為植物組織 培養(yǎng)培養(yǎng) 植物組織培養(yǎng)理論基礎 一、細

6、胞全能性一、細胞全能性 二二. .細胞分化細胞分化 三三. .離體培養(yǎng)中細胞的脫分化、再分化離體培養(yǎng)中細胞的脫分化、再分化 l全能性：全能性：任何有完整的細胞核的植物細胞任何有完整的細胞核的植物細胞 擁有形成一個完整植株所必需的遺傳信息，擁有形成一個完整植株所必需的遺傳信息， 理論上都能發(fā)育成為一棵植株。理論上都能發(fā)育成為一棵植株。 l 植物組織培養(yǎng)是建立在細胞具有全能性的植物組織培養(yǎng)是建立在細胞具有全能性的 理論基礎上的，除受精卵能發(fā)育成胚外，理論基礎上的，除受精卵能發(fā)育成胚外， 植物的體細胞，雌配子、雄配子體都能發(fā)植物的體細胞，雌配子、雄配子體都能發(fā) 育成胚。育成胚。 植物細胞全能性表現(xiàn)根

7、據(jù)細胞類型不同從強到弱植物細胞全能性表現(xiàn)根據(jù)細胞類型不同從強到弱: : 營養(yǎng)生長中心營養(yǎng)生長中心 形成層形成層 薄壁細胞薄壁細胞 厚壁細胞厚壁細胞( (木質(zhì)化細胞木質(zhì)化細胞) ) 特化細胞特化細胞 ( (篩管、導管細胞篩管、導管細胞) )； 根據(jù)細胞所處的組織不同從強到弱為：根據(jù)細胞所處的組織不同從強到弱為： 頂端分生組織頂端分生組織 居間分生組織居間分生組織 側生分生組織側生分生組織 薄壁組織薄壁組織( (基本組織基本組織) ) 厚角組織厚角組織 輸導組織輸導組織 厚壁組織。厚壁組織。 脫分化 再分化 外植體愈傷組織 體細胞胚 根、莖、葉 等器官 再分化時，可經(jīng)過兩條途徑 完整植株 外植體：

8、外植體：植物組織培養(yǎng)中用來進行離體無菌培養(yǎng)的離體材料，可以是器官、組植物組織培養(yǎng)中用來進行離體無菌培養(yǎng)的離體材料，可以是器官、組 織、細胞或原生質(zhì)體。織、細胞或原生質(zhì)體。 愈傷組織：愈傷組織：由外植體組織增生的細胞產(chǎn)生的一團不定型的疏散排列的薄壁細胞。由外植體組織增生的細胞產(chǎn)生的一團不定型的疏散排列的薄壁細胞。 二、細胞分化 分化：細胞的這種在形態(tài)結構和功能上發(fā)生永久性（不可逆轉性）適度變化的過程。分化：細胞的這種在形態(tài)結構和功能上發(fā)生永久性（不可逆轉性）適度變化的過程。 分化的結果導致細胞分裂能力的喪失，伴隨的是細胞的分化成熟與組織的形成，是植物根、莖、葉、花、分化的結果導致細胞分裂能力的喪

9、失，伴隨的是細胞的分化成熟與組織的形成，是植物根、莖、葉、花、 果實和種子的形成，是一個成熟植物體的出現(xiàn)。果實和種子的形成，是一個成熟植物體的出現(xiàn)。 三三. .離體培養(yǎng)中細胞的脫分化、再分化離體培養(yǎng)中細胞的脫分化、再分化 脫分化：由失去分裂能力的細胞回復到分生性狀態(tài)并進行分裂，形成無分化的脫分化：由失去分裂能力的細胞回復到分生性狀態(tài)并進行分裂，形成無分化的 細胞團即愈傷組織的現(xiàn)象。細胞團即愈傷組織的現(xiàn)象。 再分化：由無分化的愈傷組織的細胞再轉變成為具有一定結構，執(zhí)行一定生理再分化：由無分化的愈傷組織的細胞再轉變成為具有一定結構，執(zhí)行一定生理 功能的組織，構成一個完整的植物體或植物器官的現(xiàn)象功能

10、的組織，構成一個完整的植物體或植物器官的現(xiàn)象 一個已分化細胞要表達出其全能 性，就要經(jīng)過脫分化和再分化的 過程，這就是植物組織和細胞培 養(yǎng)所要達到的目的。 影響細胞脫分化、再分化的因素影響細胞脫分化、再分化的因素 A A、激素、激素 生長素能促進維管組織形成生長素能促進維管組織形成 細胞分裂素與木質(zhì)部的發(fā)生有關細胞分裂素與木質(zhì)部的發(fā)生有關 b b、蔗糖濃度、蔗糖濃度 C C、光照與溫度、光照與溫度 光照對于維管組織的分化具有促進作用，適宜的溫度對于維管組織的分化是必需的。光照對于維管組織的分化具有促進作用，適宜的溫度對于維管組織的分化是必需的。 再分化時，可經(jīng)過兩條途徑 1、器官發(fā)生途徑 2、

11、體細胞胚胎發(fā)生途徑 1、器官發(fā)生途徑 植物的離體器官的發(fā)生：植物的離體器官的發(fā)生： 培養(yǎng)條件下的組織或細胞團（愈傷組織）分化培養(yǎng)條件下的組織或細胞團（愈傷組織）分化 形成不定根、不定芽等器官的過程。形成不定根、不定芽等器官的過程。 離體培養(yǎng)中通過器官發(fā)生形成再生植株大體上離體培養(yǎng)中通過器官發(fā)生形成再生植株大體上 有四種方式：有四種方式： A: A: 先芽后根先芽后根；如小麥，蘆薈、蘋果；如小麥，蘆薈、蘋果 B: B: 先根后芽先根后芽；如枸杞、苜蓿；如枸杞、苜蓿 C:C:在愈傷組織的不同部位形成芽和根，再通過在愈傷組織的不同部位形成芽和根，再通過 維管組織的聯(lián)系形成完整植株維管組織的聯(lián)系形成完

12、整植株。如胡蘿卜、石。如胡蘿卜、石 刁柏刁柏 D:D:僅有根或芽再生，形成無芽的根或無根的芽。僅有根或芽再生，形成無芽的根或無根的芽。 器官分化的過程器官分化的過程: : 愈傷組織再分化器官一般要經(jīng)過三個生長階段愈傷組織再分化器官一般要經(jīng)過三個生長階段 1.1.外植體經(jīng)過誘導形成愈傷組織。外植體經(jīng)過誘導形成愈傷組織。 2.2.生長中心的形成。生長中心的形成。當把愈傷組織轉移到有利于有序生長的條當把愈傷組織轉移到有利于有序生長的條 件下以后，首先在若干部位成叢出現(xiàn)類似形成層的細胞群，稱件下以后，首先在若干部位成叢出現(xiàn)類似形成層的細胞群，稱 之為生長中心或擬分生組織，它們是愈傷組織形成器官的部位。

13、之為生長中心或擬分生組織，它們是愈傷組織形成器官的部位。 3.3.器官原基及器官形成。器官原基及器官形成。生長中心形成后，按照其已確立的極生長中心形成后，按照其已確立的極 性，某些細胞開始分化形成不同的器官原基，進而分化出相應性，某些細胞開始分化形成不同的器官原基，進而分化出相應 的組織和器官。的組織和器官。 愈傷組織分化不定芽 愈傷組織分化期 2、體細胞胚胎發(fā)生途徑 胚狀體發(fā)生途徑形成植株的特征胚狀體發(fā)生途徑形成植株的特征 1 1、具有兩極性、具有兩極性 細胞發(fā)育早期階段，從其相反的兩端分化出芽端與根端，而不定芽和不細胞發(fā)育早期階段，從其相反的兩端分化出芽端與根端，而不定芽和不 定根都是單向

14、極性。定根都是單向極性。 2 2、胚狀體的維管組織與外植體的維管組織無解剖結構上的聯(lián)系，而不定、胚狀體的維管組織與外植體的維管組織無解剖結構上的聯(lián)系，而不定 芽和不定根往往總是與愈傷組織的維管組織相聯(lián)系芽和不定根往往總是與愈傷組織的維管組織相聯(lián)系 3 3、胚狀體的維管組織的分布是獨立的、胚狀體的維管組織的分布是獨立的“”形，而不定芽和不定根的維形，而不定芽和不定根的維 管組織無此現(xiàn)象。管組織無此現(xiàn)象。 4 4、發(fā)育過程與合子胚相似。并具有與合子胚類似的形態(tài)結構，可獨立萌、發(fā)育過程與合子胚相似。并具有與合子胚類似的形態(tài)結構，可獨立萌 發(fā)形成小苗。發(fā)形成小苗。 2.4 2.4 植物組培的實驗條件

15、l準備室：準備室：進行一切與實驗有關的準備工作：器進行一切與實驗有關的準備工作：器 皿洗滌、培養(yǎng)基配制與分裝、培養(yǎng)基和培養(yǎng)器皿洗滌、培養(yǎng)基配制與分裝、培養(yǎng)基和培養(yǎng)器 皿的滅菌、培養(yǎng)材料的預處理等皿的滅菌、培養(yǎng)材料的預處理等 要求：要求：2020平方米左右。要求寬敞明亮平方米左右。要求寬敞明亮 設備：清洗區(qū)，干燥箱，工作臺，水箱，天平，設備：清洗區(qū)，干燥箱，工作臺，水箱，天平， 滅菌鍋等。滅菌鍋等。 無菌操作室：無菌操作室： 也叫接種室，進行材料的立體無也叫接種室，進行材料的立體無 菌操作，是植物離體培養(yǎng)研究或生產(chǎn)中最關鍵菌操作，是植物離體培養(yǎng)研究或生產(chǎn)中最關鍵 的一步。的一步。 要求：要求：1

16、0-2010-20平方米即可，封閉性好，干燥清潔，平方米即可，封閉性好，干燥清潔， 能較長時間保持無菌能較長時間保持無菌. . 設備：超凈工作臺，紫外燈和空調(diào)設備：超凈工作臺，紫外燈和空調(diào) 培養(yǎng)室： 對接種到培養(yǎng)瓶等器皿中的植物離體對接種到培養(yǎng)瓶等器皿中的植物離體 材料進行控制條件下的培養(yǎng)材料進行控制條件下的培養(yǎng) 要求：約需要求：約需10-2010-20平方米左右?；疽笫悄軌蚱椒矫鬃笥??；疽笫悄軌?控制光照和溫度，并保持相對的無菌環(huán)境，控制光照和溫度，并保持相對的無菌環(huán)境， 設備：培養(yǎng)架、光照培養(yǎng)箱或人工氣候箱、溫濕設備：培養(yǎng)架、光照培養(yǎng)箱或人工氣候箱、溫濕 度計、空調(diào)等。度計、空調(diào)等

17、。 緩沖間：緩沖間：是進入無菌室前的一個緩沖場地，減少是進入無菌室前的一個緩沖場地，減少 人體從外界帶入的塵埃等污染物。工作人員在人體從外界帶入的塵埃等污染物。工作人員在 此換上工作服、拖鞋，戴上口罩，才能進入無此換上工作服、拖鞋，戴上口罩，才能進入無 菌室和培養(yǎng)室。菌室和培養(yǎng)室。 要求：緩沖間需要求：緩沖間需3-53-5平方米，可建在準備室外或平方米，可建在準備室外或 無菌操作室外，應保持清潔無菌；備有鞋架和無菌操作室外，應保持清潔無菌；備有鞋架和 衣帽掛鉤，并有清潔的實驗用拖鞋、已滅菌過衣帽掛鉤，并有清潔的實驗用拖鞋、已滅菌過 的工作服；墻頂用的工作服；墻頂用1-21-2盞紫外燈定時照射，

18、對衣盞紫外燈定時照射，對衣 物進行滅菌。物進行滅菌。 設備：設備：1-21-2盞紫外燈、滅菌后的工作服、拖鞋、盞紫外燈、滅菌后的工作服、拖鞋、 口罩。口罩。 基本實驗室 準備室 培養(yǎng)室 2.5 植物組織培養(yǎng)步驟 植物組織培養(yǎng)兩個步驟：植物組織培養(yǎng)兩個步驟： 1 1、植物細胞或組織脫分化，形成愈傷組織。、植物細胞或組織脫分化，形成愈傷組織。 2 2、愈傷組織形成分生細胞團，再分化成不同的、愈傷組織形成分生細胞團，再分化成不同的 器官。器官。 有的情況下，組織細胞經(jīng)脫分化后，不形成有的情況下，組織細胞經(jīng)脫分化后，不形成 愈傷組織，而是從脫分化的細胞上直接再分化愈傷組織，而是從脫分化的細胞上直接再分

19、化 器官器官 到底通過哪個途徑再生，取決于培養(yǎng)材料和培到底通過哪個途徑再生，取決于培養(yǎng)材料和培 養(yǎng)基，尤其培養(yǎng)基中添加激素的種類、濃度及養(yǎng)基，尤其培養(yǎng)基中添加激素的種類、濃度及 配比配比 1 1、培養(yǎng)材料的采集、培養(yǎng)材料的采集 選擇具全能性細胞：受精卵、分生組織細胞、雌雄配子及單倍體細胞 常用植物莖尖、下胚軸、幼葉作為外植體。 考慮因素：材料的來源、外植體年齡、產(chǎn)地、外植體的大小、形狀、生理部位。 （1 1）最常用的組培材料：）最常用的組培材料： 莖尖、莖段、皮層、表皮、維管組織、塊莖、莖尖、莖段、皮層、表皮、維管組織、塊莖、 花瓣、根、葉、子葉、胚珠、花藥等?；ò?、根、葉、子葉、胚珠、花藥等

20、。 莖尖：形態(tài)已建成，繁殖率高，不易產(chǎn)生莖尖：形態(tài)已建成，繁殖率高，不易產(chǎn)生 變異。莖尖最先端為無病毒區(qū)。通常為變異。莖尖最先端為無病毒區(qū)。通常為0.5cm0.5cm， 無病毒區(qū)為無病毒區(qū)為0.1mm0.1mm。 缺點：數(shù)量少，取材有限。缺點：數(shù)量少，取材有限。 莖段：一般為莖段：一般為0.50.51cm1cm長，取材方便。長，取材方便。 缺點：所獲得的愈傷組織來源不一，有異質(zhì)缺點：所獲得的愈傷組織來源不一，有異質(zhì) 性，再生植株易產(chǎn)生變異。性，再生植株易產(chǎn)生變異。 葉：取材方便，再生能力強葉：取材方便，再生能力強 。 花器官：取材包括花托、花瓣、花藥、子房等?；ㄆ鞴伲喝〔陌ɑㄍ?、花瓣、花藥、

21、子房等。 種子（果實）：無菌種子發(fā)芽后可作外植體。子葉和下胚軸也可培養(yǎng)。種子（果實）：無菌種子發(fā)芽后可作外植體。子葉和下胚軸也可培養(yǎng)。 2、培養(yǎng)材料消毒 A:自來水沖洗、蒸餾水沖洗、無菌濾紙吸干。 B:無菌操作將材料放入70%酒精浸泡30-60s C:將材料移入Naclo飽和液或0.01%升汞消毒8-10min。 D:取出無菌水沖洗。 3 3、制備外植體：、制備外植體： 用消毒過的器械無菌操作將外植體置于培養(yǎng)皿上。用消毒過的器械無菌操作將外植體置于培養(yǎng)皿上。 切取外植體為適當大小，一般切取外植體為適當大小，一般0.2-0.5cm0.2-0.5cm。 4 4、接種和培養(yǎng)、接種和培養(yǎng) 誘導培養(yǎng)基成

22、分一般為基本培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)基成分一般為基本培養(yǎng)基+ +細胞分裂素細胞分裂素+ + 生長素生長素+ +附加成分附加成分, , 基本培養(yǎng)基一般選擇基本培養(yǎng)基一般選擇MSMS配方配方 （1 1）接種：每瓶約）接種：每瓶約4 41010個個 （2 2）封口）封口 （3 3）培養(yǎng)條件：溫度為）培養(yǎng)條件：溫度為25+2 25+2 光照為光照為100010004000lx 4000lx pH pH值常為值常為5.65.66.0 6.0 培養(yǎng)室的相對濕度要常保持在培養(yǎng)室的相對濕度要常保持在707080%80%。 5 5、增殖、增殖 把在誘導培養(yǎng)基上分化出的幼芽繼代培養(yǎng)。把在誘導培養(yǎng)基上分化出的幼芽繼代培養(yǎng)。

23、轉到增殖培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)轉到增殖培養(yǎng)基上進行培養(yǎng), , 這是使幼芽快速增殖的關鍵環(huán)節(jié)。這是使幼芽快速增殖的關鍵環(huán)節(jié)。 6 6、根的誘導、根的誘導 繼代培養(yǎng)的不定芽或側芽需要生根培養(yǎng)，在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)繼代培養(yǎng)的不定芽或側芽需要生根培養(yǎng)，在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng) 一個月左右方可獲得根系。一個月左右方可獲得根系。 7 7、組培苗的練苗移栽、組培苗的練苗移栽 煉苗與移栽煉苗與移栽 切取切取 2.6 2.6 愈傷組織形成的過程 外植體中已分化的活細胞，在外源激素的誘導下通過脫分化后形成愈傷組織，這 一過程被大致劃分為三個時期 誘導期 分裂期 形成期 1、誘導期：細胞分裂的準備期 誘導期是細胞準備進行分裂，需

24、加入誘導劑或 細胞分裂素。 2、分裂期：細胞從開始分裂到持續(xù)分裂的時 期 。 分裂期的愈傷組織的共同特征是：細胞分裂快， 結構疏松，缺少有組織的結構，維持其不分化 的狀態(tài)。 愈 傷 組 織 的 形 態(tài)愈 傷 組 織 的 形 態(tài) 愈 傷 組 織 的 顏 色愈 傷 組 織 的 顏 色 愈傷組織的種類愈傷組織的種類 1 1、胚性愈傷組織：表面光滑、組織結構緊湊、細胞小、再生力強。、胚性愈傷組織：表面光滑、組織結構緊湊、細胞小、再生力強。 胚性愈傷組織容易形成胚狀體，所以被稱為胚性愈傷組織。胚性愈傷組織容易形成胚狀體，所以被稱為胚性愈傷組織。 2 2、非胚性愈傷組織：表面粗糙、組織結構疏松、細胞大。、

25、非胚性愈傷組織：表面粗糙、組織結構疏松、細胞大。 復 習 愈傷組織再分化經(jīng)歷兩個途徑：器官發(fā)生方式再生植株的三種愈傷組織再分化經(jīng)歷兩個途徑：器官發(fā)生方式再生植株的三種 途徑：途徑： 可能先長芽后長根（常見）。可能先長芽后長根（常見）。 形成根，根上再長出芽（少見）。形成根，根上再長出芽（少見）。 在愈傷組織不同部位分別形成根和芽。在愈傷組織不同部位分別形成根和芽。 胚狀體形成途徑胚狀體形成途徑 胚狀體：指在植物組織培養(yǎng)中起源于一個非合子細胞，經(jīng)胚胎發(fā)育所形成的胚狀結胚狀體：指在植物組織培養(yǎng)中起源于一個非合子細胞，經(jīng)胚胎發(fā)育所形成的胚狀結 構。構。 體細胞胚與合子胚發(fā)育過程相似：體細胞胚與合子胚

26、發(fā)育過程相似： 原胚原胚 球形胚球形胚 心形胚心形胚 魚雷形胚魚雷形胚 子葉型胚子葉型胚 胚狀體發(fā)生途徑胚狀體發(fā)生途徑 外外 植植 體體 高濃度生長素（高濃度生長素（2,4-D2,4-D） 脫脫 分分 化化 愈傷組織愈傷組織 高（細胞分裂素高（細胞分裂素/ /生長素）生長素） 再再 分分 化化 形形 成成 芽芽 低（細胞分裂素低（細胞分裂素/ /生長素）生長素） 分分 化化 根根 完整植株完整植株 激 素 控 制 器 官 分 化 模 式 圖激 素 控 制 器 官 分 化 模 式 圖 植物組織培養(yǎng)舉例 一、材料和培養(yǎng)基 l0-l5cm高的蘆薈幼苗; 愈傷組織誘導培養(yǎng)基為MS+(1一6mg/ L)

27、BA+(0.1一0.5mg/L)NAA; 分化培養(yǎng)基為MS+(2-4mg/L)BA+ (0.1-0.5mg/L)NAA; 生根培養(yǎng)基為MS+(0.1一0.5mg/L)IBA+(2一5mg/L)PP33。 二、繁殖方法 (一)愈傷組織培養(yǎng) 將準備好的蘆薈幼苗在清水中沖洗數(shù)次，剪去葉片和大部 分莖段，取莖尖部分，再沖洗1-2次，淋干。在超凈臺上， 先用75%的乙醇將莖尖浸泡30-60s，再用升汞浸5-l0min， 最后用無菌水沖洗數(shù)次。用解剖刀取出包括莖尖生長點的 組織切塊，接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基上。大約15-25d 后，試管中接種的外植體就可以膨大，形成愈傷組織。愈 傷組織的形成標志著接種的外

28、植體的生長狀態(tài)已脫離分化 狀態(tài)，開始重新恢復分生能力。愈傷組織形成1周后，就 可將愈傷組織轉管進行繼代培養(yǎng)或分化培養(yǎng)。 (二)繼代培養(yǎng) 將愈傷組織在無菌條件下，用解剖刀將愈 傷塊切成數(shù)個小塊，再接種到裝有愈傷組織誘導培養(yǎng)基的 三角瓶中，在與誘導愈傷組織相同的培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)。 幾天后，小愈傷塊即可逐漸長大，這一過程稱作繼代培養(yǎng)。 通過愈傷組織的繼代培養(yǎng)，原來接種的1個蘆薈莖尖組織 可繁殖出大量的新接種材料來，用于分化培養(yǎng)。 (三)分化培養(yǎng) 將愈傷組織在無菌條件下，從試管或三 角瓶中取出，用無菌水洗凈，切成小接種塊，接種到裝 有分化培養(yǎng)基的三角瓶中，分化培養(yǎng)的條件同愈傷組織 培養(yǎng)。大約30-5

29、0d后，愈傷組織就可分化出芽，并繼 續(xù)長出小葉片。當分化出的幼苗長到一定高度或分化出 一定數(shù)量后，將這些小幼苗在無菌條件下取出，進行生 根培養(yǎng)或重新誘導分化。 (四)生根培養(yǎng) 當三角瓶中的幼苗葉片長到3cm左右時， 將幼苗在無菌條件下取出，放入裝有生根培養(yǎng)基的三角 瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同分化培養(yǎng)。大約半個月后，幼苗 即可生根。 (五)煉苗 當幼苗的根長到一 定長度，幼苗形體已顯健 壯時。將幼苗取出，在清水中洗除附著在根上的培養(yǎng)基 (注意:一定要嚴格洗凈，否則會爛根)。 (六)移栽 煉苗后，將幼苗移栽入由蛭石組成的馴化苗 圃中馴化，每天定期給幼苗噴施馴化培養(yǎng)液和清水，大 約15-20d后，視幼苗長

30、勢，即可移栽到苗圃中。 1、在植物育種上的應用 突變育種：無論是愈傷組織培養(yǎng)還是細胞培養(yǎng)， 培養(yǎng)細胞均處在不斷分生狀態(tài)，容易受培養(yǎng)條 件和外界壓力的影響而產(chǎn)生誘變，從中可以篩 選出對人們有用的突變體，從而育成新品種。 原生質(zhì)體融合和細胞雜交：可部分克服有性雜 交不親和性，而獲得體細胞雜種，從而創(chuàng)造新 種或育成優(yōu)良品種。 單倍體育種：利用花藥培養(yǎng)誘導花粉形成單倍 體，在試管培養(yǎng)中通過秋水仙素處理，使染色 體加倍，而成為純合二倍體植物，從而縮短新 品種育種的時間，還有利于突變中隱性突變的 分離。 2.7 植物組織培養(yǎng)的應用 2、在植物脫毒和快速繁殖上的應用 植物脫毒植物脫毒和離體快速繁殖離體快速繁

31、殖是目前植物組織培養(yǎng)應用最多、最有效的一個方面。 很多農(nóng)用物都帶有病毒，特別是無性繁殖植物，但是，患病植株并非每個部位都帶 有病毒，利用組織培養(yǎng)方法，取一定大小的莖尖進行培養(yǎng)，再生的植株有可能不帶 病毒，從而獲得脫病毒苗，再用脫毒苗進行繁殖，則種植的作物就不會或極少發(fā)生 病毒。 馬鈴薯脫病毒試管苗馬鈴薯脫病毒試管苗 由于組織培養(yǎng)法繁殖作物的突出特點是快速，因此，對一些繁殖系數(shù)低、不能用種子繁殖的“名、優(yōu)、特、 新、奇”作物品種的繁殖，意義更大。對于脫毒苗、新育成、新引進、稀缺育種、優(yōu)良單株、瀕危植物和 基因工程植株等可通過離體快速繁殖，同時可不受地區(qū)、氣候的影響，比常規(guī)方法快數(shù)萬倍到數(shù)百萬倍的

32、 速度擴大繁殖，及時提供大量優(yōu)質(zhì)種薯和種苗。 3、在植物種質(zhì)資源保存和交換上的應用 由于自然災害和生物之間的競爭以及人類活 動對大自然的影響，已有相當數(shù)量的植物物種 在地球上消失或正在消失。具有獨特遺傳性狀 的生物物種的絕跡是一種不可挽回的損失。利 用植物組織和細胞法低溫保存種質(zhì)，給保存和 搶救有用基因帶來了希望。例如胡蘿卜和煙草 等植物的細胞懸浮物，在-20至-196的低溫 下貯藏數(shù)月，尚能恢復生長，再生成植株。 2.8 人工種子 2.8.1 人工種子理論基礎 胚狀體： 是指在植物組織培養(yǎng)中起源于一個非合子細胞，經(jīng)胚胎發(fā)育所 形成的胚狀結構，又稱體細胞胚。 A: 體細胞胚胎發(fā)生特點 1、是離

33、體培養(yǎng)的產(chǎn)物 2、起源于非合子細胞 3、發(fā)育過程與合子胚相似，也經(jīng)歷球形期、心形期、 魚雷期 和子葉期階段。 B: 體細胞胚胎發(fā)生途徑 胚狀體可從離體培養(yǎng)的各種外植體上直接或間接地發(fā)生，大致分為五種： 直接從器官外植體上發(fā)生 愈傷組織發(fā)生 懸浮培養(yǎng)細胞發(fā)生 單倍體細胞發(fā)生 原生質(zhì)體發(fā)生 2.8.2 人工種子概念 利用人工種皮包被體細胞胚可以制造人工種子。 人工種子的結構人工種子的結構 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用的天然種子，一般都是由種被、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用的天然種子，一般都是由種被、 胚乳和胚三部分構成。胚乳和胚三部分構成。 目前研制的人工種子的結構目前研制的人工種子的結構: : 體細胞胚體細胞胚 人工種皮人

34、工種皮 人工胚乳人工胚乳 2.8.3 人工種子的基本制作流程人工種子的基本制作流程 外植體的選擇和消毒外植體的選擇和消毒 愈傷組織的誘愈傷組織的誘 導導體細胞胚的誘導體細胞胚的誘導 體細胞胚的體細胞胚的 同步化同步化體細胞胚的分選體細胞胚的分選體細胞胚體細胞胚 的包裹的包裹( (人工胚乳人工胚乳) )包裹外膜包裹外膜發(fā)芽發(fā)芽 成苗試驗成苗試驗體細胞胚變異程度與農(nóng)藝研體細胞胚變異程度與農(nóng)藝研 究。究。 人工種子制作過程中，包埋是最重要環(huán)節(jié) 包括包埋介質(zhì)的選擇，主要是人工胚乳和人工種皮的選擇 人工胚乳一般由含有供應胚狀體養(yǎng)分的膠囊組成,養(yǎng)分包括礦質(zhì)元素、維生素、碳源以及激素等 對于人工胚乳包埋介質(zhì)

35、的要求： 首先必需是對繁殖體及其它生物是無毒的，并 具有一定的緩沖強度，以保證繁殖體在生產(chǎn)、 運輸和種植操作中的安全。 同時，它最好能夠提供類似于胚乳的營養(yǎng)物質(zhì)， 以供繁殖體發(fā)芽的需要。 此外由于繁殖體的含水量較高，貯存中極易受 到微生物感染危害，因此介質(zhì)中還應含有適當 的殺菌劑。 海藻酸鈉作包埋劑 2.8.4 人工種子優(yōu)點： 第一，它同微繁殖技術一樣，培養(yǎng)條件可以人 為控制，免遭大自然災害性氣候的不利因素， 且具有省地省工可直接在田間播種等優(yōu)點。 第二，在人工種子制作中，可加入營養(yǎng)物質(zhì)、 植物生長調(diào)節(jié)劑、固氮菌、殺蟲劑等，這是微 繁殖難以達到的。 第三，用于制作人工種子的體細胞胚，可利用 生

36、物反應器大規(guī)模培養(yǎng)，大大提高了效率。 第四，一些難以得到天然種子的珍稀植物或脫 毒苗、基因工程植株，均可利用人工種子技術 加速用于生產(chǎn)。 2.9 2.9 植物細胞培養(yǎng) 2.9.1 概念：離體條件下，將愈傷組織或其他易分散 的組織置于液體培養(yǎng)基中進行振蕩培養(yǎng)。得到 分散成游離的懸浮細胞，通過繼代培養(yǎng)使細胞 增殖。從而獲得大量細胞群體的一種技術。 方法： 根據(jù)對象：單細胞培養(yǎng)、單倍體培養(yǎng)、原生質(zhì) 體培養(yǎng)。 按培養(yǎng)系統(tǒng)：懸浮培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)、 固定化培養(yǎng) 圖3-7 2.9.2 植物單細胞培養(yǎng) 1、單細胞制備方法 由完整的植物器官分離單細胞由培養(yǎng)組織中分離單細胞由完整的植物器官分離單細胞由培養(yǎng)

37、組織中分離單細胞 A: 機械法：通過機械磨碎、切割植物體獲得游離單細胞。 B: 酶解法：采用水解酶去除細胞壁，釋放出細胞，用來制備原生質(zhì)體。 葉片是分離單細胞的最好材料葉片是分離單細胞的最好材料 機械法機械法 露出葉肉細胞露出葉肉細胞 用解剖刀刮下細胞用解剖刀刮下細胞 撕去下表皮撕去下表皮 加果膠酶加果膠酶 過濾、離心過濾、離心 Takebe等（1968）最早報道： 用果膠酶處理可以分離大量的葉肉 細胞 C: 愈傷組織誘導法：先獲得愈傷組織，在通過震蕩獲得單個細胞 步驟： (1) 誘導產(chǎn)生愈傷組織； (2) 愈傷組織反復繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織的松散性。 (3)將愈傷組織在液體培養(yǎng)基

38、中培養(yǎng)，建立懸浮培養(yǎng)物。 愈傷組織愈傷組織液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基 搖床振蕩搖床振蕩 懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng) 質(zhì)地疏松，細胞分散程度大；質(zhì)地疏松，細胞分散程度大； 質(zhì)地緊密，細胞分散程度小，不適于懸浮培養(yǎng)質(zhì)地緊密，細胞分散程度小，不適于懸浮培養(yǎng) 轉速轉速30-150rpm 2-3cm沖程沖程 防細胞破裂防細胞破裂 2、單細胞培養(yǎng)方法 A: 平板培養(yǎng)法 概念：將制備好的單細胞懸浮液，按照一定的細胞密度，接種 在1mm左右的薄層固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，稱之為平板培養(yǎng) 1、單細胞懸浮液的制備 2、懸浮細胞密度的調(diào)制 3、瓊脂培養(yǎng)基的配制 4、平板制作 5、培養(yǎng) 主要技術要點： 單細胞的分離：單細胞的分離：一般采

39、用酶分離法，小細胞團不能超過一般采用酶分離法，小細胞團不能超過6 6個細胞，因此過濾時網(wǎng)篩的網(wǎng)眼要選擇合適。個細胞，因此過濾時網(wǎng)篩的網(wǎng)眼要選擇合適。 單細胞懸浮液的制備單細胞懸浮液的制備：分離的單細胞經(jīng)培養(yǎng)基洗滌：分離的單細胞經(jīng)培養(yǎng)基洗滌2 2次以后，調(diào)整密度為次以后，調(diào)整密度為10103 3或或10105 5個細胞個細胞/ml/ml 植板：植板：將將1 1份已調(diào)整好密度的單細胞懸浮液與份已調(diào)整好密度的單細胞懸浮液與3535的固體培養(yǎng)基充分混合均勻，的固體培養(yǎng)基充分混合均勻， 然后均勻的平鋪與培養(yǎng)皿中，其厚度為然后均勻的平鋪與培養(yǎng)皿中，其厚度為1-2mm1-2mm。 待植板后的培養(yǎng)基完全凝固后

40、，將培養(yǎng)皿封嚴以防污染待植板后的培養(yǎng)基完全凝固后，將培養(yǎng)皿封嚴以防污染. .在在2525黑暗條件下培黑暗條件下培 養(yǎng)養(yǎng)3 3周即可長出肉眼可見的愈傷組織。周即可長出肉眼可見的愈傷組織。 特點： 單細胞在培養(yǎng)集中分布均勻，便于顯微鏡下定點觀察；單細胞在培養(yǎng)集中分布均勻，便于顯微鏡下定點觀察； 培養(yǎng)細胞氣體交換不暢。培養(yǎng)細胞氣體交換不暢。 平板培養(yǎng)法平板培養(yǎng)法 B: 看護培養(yǎng)法 用一塊活躍生長的愈傷組織塊來看護單個細胞，并使其生長 和增殖的方法。 （1）取處于活躍生長期約1厘米大小愈傷組織塊。 （2）無菌條件下，愈傷組織塊安放在培養(yǎng)瓶中，在愈傷組織上 放約1厘米平方的無菌濾紙片。置培養(yǎng)室中放過夜。

41、 （3）將分離出的單細胞接種在培養(yǎng)瓶中的濾紙上面。 （4）恒溫培養(yǎng)。 特點： v （1）效果好，易于成功。 v （2）簡便易行。 v （3）不能在顯微鏡下直接觀察細胞的生長過程。 C: 微室培養(yǎng)法 人工制造一個小室（載玻片和蓋玻片），將單細胞培養(yǎng)在小室中的少量培 養(yǎng)基上，使其分裂增殖成細胞團的方法。小室可通過毛細管與外界通氣，便 于觀察。 微室培養(yǎng)微室培養(yǎng) 1滴含單細胞培養(yǎng)滴含單細胞培養(yǎng) 液液 周圍加石蠟油周圍加石蠟油凹穴載玻片凹穴載玻片旁邊加石蠟油旁邊加石蠟油 蓋蓋玻片蓋蓋玻片蓋蓋玻片蓋蓋玻片 平視圖平視圖 置培養(yǎng)皿中置培養(yǎng)皿中2628 恒恒 溫培養(yǎng)溫培養(yǎng) 特點： 在培養(yǎng)過程中可以連續(xù)進行顯

42、微觀察，將一個細胞的生長、分裂和形成細胞團的全部過程記錄下來。 D: D: 其它單細胞培養(yǎng)技術其它單細胞培養(yǎng)技術 飼養(yǎng)層培養(yǎng)基技術飼養(yǎng)層培養(yǎng)基技術 是用處理過的、無活性或分裂慢的細胞來飼養(yǎng)所需是用處理過的、無活性或分裂慢的細胞來飼養(yǎng)所需 培養(yǎng)的細胞，使其分裂和生長。培養(yǎng)的細胞，使其分裂和生長。 將飼養(yǎng)細胞先用射線輻射處理，然后將飼養(yǎng)細胞和培將飼養(yǎng)細胞先用射線輻射處理，然后將飼養(yǎng)細胞和培 養(yǎng)細胞混合植板，經(jīng)過照射的細胞對于培養(yǎng)細胞起到養(yǎng)細胞混合植板，經(jīng)過照射的細胞對于培養(yǎng)細胞起到 一個飼養(yǎng)作用。一個飼養(yǎng)作用。 雙層濾紙植板培養(yǎng)方法雙層濾紙植板培養(yǎng)方法 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 飼養(yǎng)層細胞看護濾紙層 轉移碟濾

43、紙 培養(yǎng)細胞 E: 懸浮培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng)是指將單個游離細胞或小細胞團在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖的技術。 1、起始培養(yǎng)物的建立 選擇適宜的外植體：幼胚、胚軸、子葉是最常使用的外植體。 2、選擇適宜的培養(yǎng)基：較高濃度激素濃度；必要的附加物質(zhì)。 愈傷組織的要求：松散性好、增殖快、再生能力強 懸浮培養(yǎng)與固體培養(yǎng)比較有三個優(yōu)點： 一、增加培養(yǎng)細胞與培養(yǎng)液的接觸面，改善營養(yǎng)供應；可以適當改善氣體的交換 二、在振蕩條件下可避免細胞代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)在局部積累而對細胞自身產(chǎn)生毒 害； 三、適合大規(guī)模培養(yǎng)。生產(chǎn)有價值次生代謝產(chǎn)物。 3、建立細胞懸浮系 一個成功的懸浮細胞培養(yǎng)體系必須滿足三個條 件： 懸浮培養(yǎng)物分散

44、性良好，細胞團較小，一般在 3050個細胞以下，在實際培養(yǎng)中很少有完全 由單細胞組成的植物細胞懸浮系。 均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同。 懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈 透亮，細胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。 細胞生長迅速，懸浮細胞的生長量一般23天 甚至更短時間便可增加一倍。 103 4、懸浮培養(yǎng)中細胞生長量的計算、懸浮培養(yǎng)中細胞生長量的計算 q細胞計數(shù)細胞計數(shù) q細胞密實體積（細胞密實體積（PCVPCV） 5鉻酸或0.25果膠酶使懸浮細胞團分散 用血球計數(shù)板進行。 將體積已知、均勻分散的懸浮液放入一個 15ml 的離心管中，2000轉下離心，用每ml培養(yǎng)液中細 胞總體積的m

45、l數(shù)表示 q細胞鮮重：細胞鮮重：細胞培養(yǎng)物過濾，洗去培養(yǎng)基，真空細胞培養(yǎng)物過濾，洗去培養(yǎng)基，真空 抽慮，稱重。抽慮，稱重。 q細胞干重細胞干重離心收集的細胞轉移到預先稱重的濾紙離心收集的細胞轉移到預先稱重的濾紙 片上，然后在片上，然后在6060烘烘12h12h，在干燥器中冷卻后稱重，在干燥器中冷卻后稱重 5、懸浮細胞培養(yǎng)的同步化 細胞同步化是指同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細胞 都同時通過細胞周期的某一特定時期。 1、物理方法 1）分選法 通過細胞體積大小分級，直接將處于相同周期 的細胞進行分選，然后將同一狀態(tài)的細胞繼代 培養(yǎng)于同一培養(yǎng)體系中 。 2）冷處理法。低溫處理可以提高培養(yǎng)體系中細 胞同步化的

46、程度 2、化學方法 1）饑餓法 懸浮培養(yǎng)細胞中，若斷絕供應一種細胞分裂所 必需的營養(yǎng)成分或激素，使細胞停滯在G1或G2 期，經(jīng)過一段時間的饑餓之后，當在培養(yǎng)基中 重新加入這種限制因子時，靜止細胞就會同步 進入分裂。 2）抑制劑法 通過一些DNA 合成抑制劑處理細胞，使細胞 停留在DNA 合成前期，當解除抑制后，即可獲 得處于同一細胞周期的細胞。 常用的抑制劑有5-氟脫氧尿苷，5-氨基尿嘧 啶、羥基尿等。 3）有絲分裂阻抑 用秋水仙素處理指數(shù)生長的懸浮培養(yǎng)物，濃 度一般控制在0.2%，處理時間以4-6小時為宜 植物細胞培養(yǎng)的意義 n2.102.10 n植物次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、輕化工業(yè)等領域

47、具有 重要意義。 n 李時珍（1593）在本草綱目中所開列的1892種藥物 絕大多數(shù)是植物藥物，目前仍有約25的法定藥品來自 植物。其藥物的有效成分均為次生產(chǎn)物。 產(chǎn)品成分產(chǎn)品成分 用途用途 年銷售額（億美元）年銷售額（億美元） 長春花堿（長春花）長春花堿（長春花）治療白血病治療白血病 18182020（美國）（美國） 阿嗎靈阿嗎靈 循環(huán)系統(tǒng)障礙藥循環(huán)系統(tǒng)障礙藥 5 52525（全世界）（全世界） 奎寧（金雞納樹）奎寧（金雞納樹） 治療瘧疾治療瘧疾 5 51010（美國）（美國） 致熱素致熱素 殺蟲劑殺蟲劑2020（全世界）（全世界） 毛地黃毛地黃 心臟病藥心臟病藥 20205555（美國）（

48、美國） 許多植物次生代謝產(chǎn)物是優(yōu)良的食品添加劑和名貴化妝品原料。有些是生物毒素的主要來源，可以用于殺 蟲、殺菌，而對環(huán)境和人畜無害，是理想的環(huán)保產(chǎn)品。例如： 從胡蘿卜、萬壽菊提取色素 從黃菊提取芳香油 梔子提取果酸：果酸含有大量的維生素，如維生素C、檸檬酸等。主要用作食品的調(diào)味劑，化妝行業(yè)用于制 作護膚品和洗發(fā)香波等，美容院用作換膚液 2.11 植物細胞生物反應器大規(guī)模培養(yǎng) 目前采用液體培養(yǎng)基的懸浮培養(yǎng) 1、植物細胞培養(yǎng)的特性 a 植物細胞較微生物細胞大得多，有纖維素細胞 壁細胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差； b 培養(yǎng)過程生長速度緩慢，易受微生物污染，需 用抗生素； c 細胞生長的中期及對數(shù)期易凝

49、聚為團塊，懸 浮培養(yǎng)較難； d 培養(yǎng)時需供氧，培養(yǎng)液粘度大： e 具有群體效應； f 因為有細胞壁, 培養(yǎng)細胞產(chǎn)物滯留于細胞內(nèi)， 產(chǎn)量較低； g 細胞培養(yǎng)過程具有結構與功能全能性,因而易 分化,從而導致目的產(chǎn)物低于原植物體內(nèi)的濃度； h 懸浮培養(yǎng)中要求有一定的細胞濃度，否則不生 長。 2 2植物細胞培養(yǎng)液的流變特性植物細胞培養(yǎng)液的流變特性 易結團，易分泌粘性物質(zhì)。傳氧速率降低，影易結團，易分泌粘性物質(zhì)。傳氧速率降低，影 響細胞生長。響細胞生長。 3 3植物細胞培養(yǎng)過程中的氣體傳遞與影響植物細胞培養(yǎng)過程中的氣體傳遞與影響 （1 1）氧的傳遞）氧的傳遞 （2 2）COCO2 2的影響的影響 4 4

50、泡沫與器壁表面黏附性泡沫與器壁表面黏附性 易產(chǎn)生泡沫，與器壁表面黏附性強，影響細胞易產(chǎn)生泡沫，與器壁表面黏附性強，影響細胞 生長，要盡量消除。生長，要盡量消除。 5 5細胞分裂和愈傷組織的形成細胞分裂和愈傷組織的形成 3 35 5天天: :發(fā)生細胞分裂發(fā)生細胞分裂 兩周后兩周后: :愈傷組織的形成愈傷組織的形成 將其轉移至分化培養(yǎng)基上即可最終獲得試管苗。將其轉移至分化培養(yǎng)基上即可最終獲得試管苗。 2、液體懸浮培養(yǎng)理論基礎-細胞生長曲線 在整個培養(yǎng)過程中，細胞數(shù)目不斷發(fā)生變化，呈現(xiàn)出明顯的由慢到快，再到慢，在整個培養(yǎng)過程中，細胞數(shù)目不斷發(fā)生變化，呈現(xiàn)出明顯的由慢到快，再到慢， 最后增長停止的細胞

51、周期。細胞的生長呈最后增長停止的細胞周期。細胞的生長呈S S型曲線型曲線 滯后期滯后期 對數(shù)生長期對數(shù)生長期 直線生長期直線生長期 緩慢期緩慢期 靜止期靜止期 培養(yǎng)時間培養(yǎng)時間 培養(yǎng)細胞數(shù)目培養(yǎng)細胞數(shù)目 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 3、懸浮細胞增殖各個時期的特點、懸浮細胞增殖各個時期的特點： 緩慢期緩慢期 滯后期（延遲期）滯后期（延遲期） 細胞很少分裂，其長短與接種量大小和繼代時原種細胞所處細胞很少分裂，其長短與接種量大小和繼代時原種細胞所處 的生長期有關的生長期有關 對數(shù)生長期對數(shù)生長期 細胞分裂活躍，細胞數(shù)目增加，增長速率保持不變細胞分裂活躍，細胞數(shù)目增加，增長速率保持不變 直

52、線生長期直線生長期細胞生長和發(fā)育最明顯的時期細胞生長和發(fā)育最明顯的時期 生長逐漸緩慢：培養(yǎng)液消耗將盡，有毒代謝物質(zhì)增生長逐漸緩慢：培養(yǎng)液消耗將盡，有毒代謝物質(zhì)增 多，氧氣減少多，氧氣減少 靜止期靜止期 生長幾乎處于停止狀態(tài)，細胞數(shù)目增加極少，甚至生長幾乎處于停止狀態(tài)，細胞數(shù)目增加極少，甚至 開始死亡。開始死亡。 4、大規(guī)模細胞培養(yǎng)過程： （1）細胞的篩選與細胞株的建立（固液培養(yǎng)相結合） 篩選細胞株的方法是： （1）愈傷組織的誘導與培養(yǎng)：將切取得材料放在培養(yǎng)基 上，愈傷組織形成后，繼代培養(yǎng)。 （2）單細胞分離：挑選出外觀疏松、生長快的淺色愈傷 組織轉移到液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，也可加入果膠酶， 游

53、離出單個細胞或小細胞團。 （3）無性系的分離：將懸浮培養(yǎng)物經(jīng)過不銹鋼網(wǎng)過濾除 去細胞塊，濃縮后接種與固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周。 （4）細胞株篩選：在平板上選擇生長迅速分散好的胞系 的培養(yǎng)物，進行有效成分的測定，篩選出有效成分高而 生長較快的細胞株。 （2）擴大培養(yǎng) 將優(yōu)良細胞株多次擴大繁殖得到大量細胞，用作生物反 應器的種子 (3)生物反應器培養(yǎng) 培養(yǎng)方式培養(yǎng)方式 （一）（一）分批培養(yǎng)分批培養(yǎng)/ /成批培養(yǎng)成批培養(yǎng) 是指細胞接種到一定容積培養(yǎng)基的密封系統(tǒng)中培養(yǎng)， 它是進行細 胞生長和細胞分裂的生理生化研究常用的培養(yǎng)方法。 要進行下一批培養(yǎng)，則生長一定時間后，需要繼代轉移。 特點：特點： （1 1）

54、細胞生長在固定體積的培養(yǎng)基上，直至培養(yǎng)基中的養(yǎng)分為）細胞生長在固定體積的培養(yǎng)基上，直至培養(yǎng)基中的養(yǎng)分為 細胞耗盡為止。細胞耗盡為止。 （2 2）用適當攪拌的方法增加和維持游離細胞和細胞團在培養(yǎng)基）用適當攪拌的方法增加和維持游離細胞和細胞團在培養(yǎng)基 中的均勻分布。中的均勻分布。 （3 3）培養(yǎng)過程中，細胞生長，其數(shù)目不斷發(fā)生變化，呈）培養(yǎng)過程中，細胞生長，其數(shù)目不斷發(fā)生變化，呈S S增長。增長。 （4 4）成批培養(yǎng)結束后，若要進行下一批培養(yǎng)，必須另外進行繼）成批培養(yǎng)結束后，若要進行下一批培養(yǎng)，必須另外進行繼 代培養(yǎng)，其方法是用注射器吸取一定量的含單細胞和小細胞團的代培養(yǎng)，其方法是用注射器吸取一定

55、量的含單細胞和小細胞團的 懸浮培養(yǎng)物，并移到含有新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶里，繼續(xù)進行培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)物，并移到含有新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶里，繼續(xù)進行培養(yǎng)。 繼代繼代 最佳繼代時期： 了解細胞數(shù)目增長變化S形曲線后，選擇對數(shù)生長期和直線 生長期！ （二）連續(xù)培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng)反應器，在投料和接種培養(yǎng)后，以一定速度連續(xù)采集細胞與培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)反應器，在投料和接種培養(yǎng)后，以一定速度連續(xù)采集細胞與培養(yǎng) 液，以同樣速度供給新鮮培養(yǎng)基，此種培養(yǎng)方式可使細胞生長環(huán)境長期維液，以同樣速度供給新鮮培養(yǎng)基，此種培養(yǎng)方式可使細胞生長環(huán)境長期維 持穩(wěn)定持穩(wěn)定 連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng) 加入培養(yǎng)基加入培養(yǎng)基 排出培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物排出培養(yǎng)基及其培

56、養(yǎng)物 二者體積相等 分分：開放式連續(xù)培養(yǎng)（：開放式連續(xù)培養(yǎng)（Open C.C） 封閉式連續(xù)培養(yǎng)（封閉式連續(xù)培養(yǎng)（Closed C.C） 開放式和封閉式區(qū)別 封閉式中：排出液中的細胞用機械方法收集后，又放入原培養(yǎng)基，所以其培養(yǎng)細胞數(shù)目不斷增加； 開放式中：在注入新鮮培養(yǎng)基的同時，培養(yǎng)細胞隨同培養(yǎng)液一起流出，培養(yǎng)細胞數(shù)目保持恒定；通過調(diào)節(jié) 流入和流出的速度，使培養(yǎng)物的生長速度永遠保持接近最高值的恒定水平上。 （三）半連續(xù)培養(yǎng) 在反應器中培養(yǎng)，一段時間后，將部分培養(yǎng)液和新鮮培養(yǎng)液進行交換或添加某種營養(yǎng)成分的培養(yǎng)。 能重復地取得大量、均一的培養(yǎng)細胞，供生物研究之用。 5.植物細胞生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)-

57、生物反應器類型 機械攪拌式、鼓泡式和氣升循環(huán)式 機械攪拌式： 優(yōu)點：攪拌均勻。 缺點：剪切力大。 氣動式培養(yǎng)系統(tǒng)： 優(yōu)點：剪切力小 缺點：操作彈性小，低氣速或培養(yǎng)后期混合效果差；此時如果 提高通氣量又會產(chǎn)生大量泡沫。 機械攪拌式生物反應器機械攪拌式生物反應器 氣動式生物反應器氣動式生物反應器 6. 6. 植物細胞生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)-培養(yǎng)細胞和次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的影響 因素 （1 1）細胞遺傳特性）細胞遺傳特性 分清代謝物的合成部位或貯藏部位。分清代謝物的合成部位或貯藏部位。 （2 2）培養(yǎng)的環(huán)境條件）培養(yǎng)的環(huán)境條件 包括光照、溫度、通氣、培養(yǎng)基成分、包括光照、溫度、通氣、培養(yǎng)基成分、PHPH、

58、調(diào)節(jié)因子等、調(diào)節(jié)因子等 培養(yǎng)基成分：培養(yǎng)基的成分包括培養(yǎng)條件要通過一定的培養(yǎng)基成分：培養(yǎng)基的成分包括培養(yǎng)條件要通過一定的 實驗才能選擇出既有利于細胞大量生長繁殖又有利于次實驗才能選擇出既有利于細胞大量生長繁殖又有利于次 生代謝產(chǎn)物大量產(chǎn)生的培養(yǎng)基。生代謝產(chǎn)物大量產(chǎn)生的培養(yǎng)基。 通氣：通氣：KLaKLa（體積氧傳遞系數(shù)，單位時間、單位體積氧（體積氧傳遞系數(shù)，單位時間、單位體積氧 量）：如在量）：如在15L15L的通風式反應器中培養(yǎng)的煙草細胞，當?shù)耐L式反應器中培養(yǎng)的煙草細胞，當 KLaKLa值在值在5 510h10h-1 -1的范圍內(nèi)，隨著 的范圍內(nèi)，隨著 KLaKLa的增加，生物量的增加，生物

59、量 和代謝產(chǎn)物也呈線性增加和代謝產(chǎn)物也呈線性增加 激發(fā)子激發(fā)子: : 植物細胞次生代謝除了自身的遺傳或發(fā)育基礎外，通常植物細胞次生代謝除了自身的遺傳或發(fā)育基礎外，通常 還與誘導因子有關。人為合理的應用這些誘導因子，就還與誘導因子有關。人為合理的應用這些誘導因子，就 有可能提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。有可能提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。 有用次生代謝物質(zhì) （3 3）培養(yǎng)方法(兩階段培養(yǎng)工藝） 為了同時滿足細胞生長和產(chǎn)物合成的需要，通常需要在不同階段使用不同的培養(yǎng)基，即兩階段培養(yǎng)為了同時滿足細胞生長和產(chǎn)物合成的需要，通常需要在不同階段使用不同的培養(yǎng)基，即兩階段培養(yǎng) 兩階段培養(yǎng)方法： 一步法逐級放大：對于細胞生長與目

60、的產(chǎn)物合成同步的類型， 一般采用此方法建立大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)。 兩步法：用于目的產(chǎn)物合成在細胞生長發(fā)育到一定時期進行， 細胞生長和產(chǎn)物合成需要不同的培養(yǎng)基的類型。先在細胞生長 培養(yǎng)基中培養(yǎng)大批量細胞，當細胞生長至合成產(chǎn)物的階段后， 再將其轉入到產(chǎn)物合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 植物細胞生物反應器培養(yǎng)存在的主要問題植物細胞生物反應器培養(yǎng)存在的主要問題 （1 1）攪拌或通氣對細胞有損傷，泡沫產(chǎn)生、有益氣體散失對細）攪拌或通氣對細胞有損傷，泡沫產(chǎn)生、有益氣體散失對細 胞代謝不利。胞代謝不利。 （2 2）培養(yǎng)液粘度增加，影響細胞吸收營養(yǎng)及氣體傳遞。）培養(yǎng)液粘度增加，影響細胞吸收營養(yǎng)及氣體傳遞。 （3 3）反應器結構