2020年高二生物選修一專題五《血紅蛋白的提取和分離》知識點(diǎn)總結(jié)測試無答案

1、2020年高二生物選修一專題五血紅蛋白的提取和分離知識點(diǎn)總結(jié)測試無答案5 / 5專題五血紅蛋白的提取和分離【知識框架】1 .分離不同種類蛋白質(zhì)可以利用蛋白質(zhì)各種特性的差異,如分子的、所帶電荷的和對其他分子的凝膠色譜法也稱做 ，是根據(jù) 分離蛋白質(zhì)的有 效方法；電泳是指帶電粒子在 的作用下發(fā)生 的過程，許多重要的生物大分子，如、等都具有, 在下，這些基團(tuán)會(huì)帶上, 在電場的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷 的電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分子的差異以及 、的不同，使帶電粒子產(chǎn)生不同的,從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。常用的電泳法有 由泳和 由泳。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移率取決于

2、以及 等因素。在測蛋白質(zhì)分子量（純度鑒定）時(shí)通常使用 電泳。2 .當(dāng)相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過瓊脂凝膠層析時(shí)，相對分子質(zhì)量 的蛋 白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部,路程較,移動(dòng)速度；而相對分子質(zhì)量大的蛋白 質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部，路程較，移動(dòng)速度，導(dǎo)致相對分子質(zhì)量小的一流 出，相對分子質(zhì)量大的 流出，相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。3 .蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步： 、粗分離、和。（1）樣品（哺乳動(dòng)物的血液）處理和粗分離樣品處理和粗分離的過程為：一 一一。紅細(xì)胞的洗滌：目的：去除;方法： 離心。采集血樣前，盛血容器中需預(yù)先加入 作為,以防止 0 米血后應(yīng)及時(shí)分離 和, 分離方法米用（500r/mi

3、n離心10min）,分離后，去除 層透明的黃色血漿，將層色紅細(xì)胞倒入燒杯，加入 儕體積的,緩慢攪拌10min,低速短時(shí)間離心，如此重復(fù)洗滌三次以上，直至表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。洗滌紅細(xì)胞時(shí)，洗滌次數(shù)過少，無法將全部除去，如果血液樣品離心后分層不明顯，可能原因是;離心速度過 一 和時(shí)間過,會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，得不到 的紅細(xì)胞，影響后續(xù)提取的血紅蛋白的。血紅蛋白的釋放：將已洗滌干凈的紅細(xì)胞倒入燒杯， 加 到原血液的體積，使紅細(xì)胞,再加40琳積的,使 溶解，置于攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）,紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋 白。分離血紅蛋白溶液：將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r

4、/min的速 度進(jìn)行高速離心10 min ,離心管中的溶液從上往下分為 4層：第1層（最上層）：的層第2層（中上層）：的沉淀層，色薄層固體第3層（中下層）： 的水溶液層，的液體第4層（最下層）：其它雜質(zhì)的 沉淀層將試管中的液體用 過濾、 除去, 于 中靜置片刻后，分離出下層的。粗分離：即。將裝有血紅蛋白溶液的透析袋放入pH為7.0的中，透析12h,透析的原理是,透析的目的是。（2）血紅蛋白的純化一一凝膠色譜法（層析）制作色譜柱：柱體是長 40cm內(nèi)徑1.6cm的玻璃管，柱頂部插入安裝了 的橡皮塞，柱底部插入安裝了 （帶頭部）的橡皮塞（橡皮塞上 部切成鍋底狀凹穴），在橡皮塞中安裝移液管時(shí)，移液管

5、上部 （必需/不 能）超過橡皮塞凹穴底面，凹穴上覆蓋尼龍網(wǎng)，再用尼龍紗將橡皮塞上部包好插 入柱體的下端，移液管頭部作為出口部位，連接細(xì)尼龍管，用螺旋夾控制尼龍管 的打開與關(guān)閉。裝填凝膠色譜柱：商品凝膠使用前直接放在 中膨脹，并用將加入洗脫液的 加熱至接近沸騰，這種方法既加速凝膠膨脹，又除去凝膠中可能帶有的 和排除凝膠顆粒內(nèi)的 。因?yàn)楦傻哪z和用緩沖液（洗脫液）平衡好的凝膠的體積差別 （不大/很大）,所以裝 柱前需要根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計(jì)算。交聯(lián)葡聚糖凝膠（SephadexG-75 白G表示凝膠的?及, “75”表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水 g 凝膠裝填色譜柱時(shí)，色譜柱下端連接的尼龍管應(yīng)

6、 仔T開/關(guān)閉）,將配制 好的凝膠懸浮液 （一次性/分多次）緩慢倒入色譜柱內(nèi)，期間（可以/不能）輕微抖動(dòng)色譜柱，使凝膠裝填均勻，凝膠色譜柱內(nèi)不得有 存在，否則會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的, 降低。 一旦發(fā)現(xiàn)凝膠柱內(nèi)有氣泡，必需 。凝膠裝填完畢，立即連接盛有 （pH為7.0 ）的洗脫瓶，在50cm高的操作壓下充分洗滌平衡，使凝膠裝填緊密。樣品的加入和洗脫：加樣前，打開色譜柱下端的流出口，讓色譜柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降，當(dāng)緩沖液緩慢下降到 時(shí)關(guān)閉出口,然后按照下圖順序加樣，最后連接裝有緩沖液的洗脫瓶進(jìn)行洗脫， 待紅色 蛋白液接近色譜柱底部時(shí)，用試管收集流出液，每試管 mL如果凝膠色譜柱裝填成功、分離

7、操作正確，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶 :地隨著洗脫液緩慢流出,反之，如果凝膠色譜柱的裝填不好,紅色區(qū)帶，分離效果不好。通過凝膠色譜（層析）除去透析后的血紅蛋白溶液中的吸管口沿管 壁環(huán)繞移動(dòng)， 貼.看管壁加田O（3）純度鑒定：判斷 的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求，需要進(jìn)行蛋白質(zhì)純度的鑒定。在鑒定的方法中，使用最多的是。十二烷基硫酸鈉（SDS能與各種蛋白質(zhì)形成“蛋白質(zhì)一SD雙合體”，SDS所帶負(fù)電荷的量 大大超過蛋白質(zhì)分子的電荷量，掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差異， 電泳時(shí)，蛋 白質(zhì)的遷移速率完全取決于 2蛋白質(zhì)由點(diǎn)樣孔向 極遷移,點(diǎn)樣孔在極一端；SDStt使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性，多肽鏈蛋白質(zhì)解聚成單條肽鏈

8、，因此，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定的結(jié)果是 的分子量將純化的血紅蛋白樣品與若干已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白分別加入到電泳裝置上槽的點(diǎn)樣孔中，電泳后，觀察血紅蛋白條 太帶與標(biāo)注蛋白條帶的位置，可確定提取的蛋白質(zhì)的分子量。個(gè)圖甲的上、下槽中加入,上、下才之間是比較圖乙條帶蛋白質(zhì)的分子量大?。? .血紅蛋白的提取和分離常見試劑及其作用:檸檬酸鈉： ; 生理鹽水： ;蒸儲水：使紅 細(xì)胞; 40%勺甲苯溶液： ;磷酸緩沖溶液：維持pH穩(wěn)定，使血 紅蛋白的不受破壞。5 .緩沖溶液能夠在一定的范圍內(nèi)，能抵制外來 對溶液 的影響，維持基本不變，緩沖溶液通常由 種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的 就可以制得 使

9、用的緩沖液?！竞诵囊c(diǎn)】1.凝膠色譜層析法蛋白質(zhì)項(xiàng)目相對分子質(zhì)里人相對分子質(zhì)量小凝膠內(nèi)部不能進(jìn)入能進(jìn)入運(yùn)動(dòng)方式垂直向卜垂直向卜和無規(guī)則擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)經(jīng)過路程較短較長洗脫次序先流出后流出2.電泳法原理在一定pH下，蛋白質(zhì)分子的某些基團(tuán)解離后帶上正電或負(fù)電。在電場的 作用下，帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。3 .比較瓊脂糖凝膠電泳和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(1)從載體上看，利用瓊脂糖凝膠作為載體的是瓊脂糖凝膠電泳，利用聚丙 烯酰胺凝膠作為載體的是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。(2)從依據(jù)上看，利用了分子帶電性質(zhì)差異和分子大小的是瓊脂糖凝膠電泳， 僅利用了分子大小的是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。(3)從優(yōu)點(diǎn)上看，瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需處理， 電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好；SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳消除了凈電荷對 遷移率的影響，使電