(2015年版藥典)非無菌藥品微生物限度檢查操作規(guī)程

1、(2015 年版藥典 ) 非無菌藥品微 生物限度檢查操作規(guī)程公司 gmp 文件非無菌藥品微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：sop-qc-ty-02-0332015 年 12 月 01起草人日期年月日執(zhí)行日期日審核人日期年月日頒發(fā)部門質(zhì)保部批準人日期年月日變更記載：修訂號執(zhí)行日期質(zhì)保部（）份質(zhì)檢部（）份2012 年 06 月 01生產(chǎn)部（）份物資部（）份00分 發(fā)日設(shè)備部（）份采供部（）份部 門2014 年 05 月 01銷售部（）份行政部（）份01日財務(wù)部（）份2015 年 12 月 0102日1. 目的：建立非無菌藥品微生物限度檢查檢驗標準操作規(guī)程，規(guī)范檢驗操作， 確保檢驗結(jié)果準確。2. 適用范圍

2、：適用于本公司所有采用非無菌藥品微生物限度檢查法測定的供試 品。3. 責(zé)任者：qc 檢驗員、qc 經(jīng)理。4. 正文：4.1 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法4.1.1 簡述第 2 頁 共 45 頁公司 gmp 文件編碼：sop-qc-ty-02-033微生物計數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細菌和真菌的計數(shù)。當(dāng)本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合規(guī)定的微生物限度標準時，應(yīng)按下述規(guī)定進行檢驗，包括樣品的取樣量和結(jié)果的判斷等。除另有規(guī)定外，本法不 適用于活菌制劑的檢查。本檢查法可采用替代的微生物檢查法，包括自動檢測方法，但必須證明替代方法 等效于藥典規(guī)定的檢查方法。微生物計數(shù)試驗應(yīng)

3、在受控潔凈環(huán)境下的局部潔凈度不低于 b 級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行。檢驗全過程必須嚴格遵守?zé)o菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期進行監(jiān)測。如供試品有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢查時, 若使用了中和劑或 滅活劑，應(yīng)確認其有效性及對微生物無毒性。供試液制備時如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認其對微生物無毒性以及與所使用中 和劑或滅活劑的相容性。4.1.2 計數(shù)方法計 數(shù) 方 法 包 括 平 皿 法 、 薄 膜 過 濾 法 和 最 可 能 數(shù) 法（most-probable-numbermethod，簡稱mpn 法）。mpn 法用于微

4、生物計數(shù)時精確度較差，但對于某些微生物污染量很小的供試品，mpn 法可能是更適合的方 法。供試品檢查時, 應(yīng)根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標準等因素選擇計數(shù)方法，所選的方法必須具備檢測充足樣品量的能力，以保證所獲得的試驗結(jié)果能夠判斷供試 品是否符合規(guī)定。所選方法的適用性須經(jīng)確認。4.1.3 計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和供試品計數(shù)方法適用性試驗第 3 頁 共 45 頁公司 gmp 文件編碼：sop-qc-ty-02-033供試品微生物計數(shù)中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進行適用性檢查。供試品的微生物計數(shù)方法應(yīng)進行方法適用性試驗，以確認所采用的方法適合于該 產(chǎn)品的微生物計數(shù)。若檢驗程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗結(jié)果時

5、，計數(shù)方法應(yīng)重新進行適用性試 驗。表1 試驗菌液的制備和使用計數(shù)培養(yǎng)基適用性 計數(shù)方法適用性試試驗菌株試驗菌液的制備檢查驗 霉菌和 霉菌和需氧菌總 酵母菌 需氧菌總 酵母菌數(shù)計數(shù)金黃色葡 胰 酪 大 豆 胰酪大豆萄球菌 胨 瓊 脂 培 胨瓊脂培(staphylo 養(yǎng) 基 或 胰 養(yǎng)基和胰coccusau 酪 大 豆 胨 酪大豆胨-reus) 液 體 培 養(yǎng) 液體培養(yǎng)cmcc( 基 ， 培 養(yǎng) 基，培養(yǎng)溫總數(shù)計數(shù)數(shù)計數(shù)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基/胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（mpn總數(shù)計數(shù)第 4 頁 共 45 頁公司 gmp 文件編碼：sop-qc-ty-02-033b)26溫度 30 度法），培養(yǎng)003)

6、35 ，培 3035，養(yǎng) 時 間 培養(yǎng)時間18 24 不超過溫度3035，培養(yǎng)時間不超小時 3天，接過3天，種量不大于100cfu銅綠假單 胰 酪 大 豆 胰 酪 大 豆接種量不大于100cfu胰酪大豆胞菌胨 瓊 脂 培 胨 瓊 脂 培胨瓊脂培（pseudo 養(yǎng) 基 或 胰 養(yǎng) 基 和 胰monasae 酪 大 豆 胨 酪 大 豆 胨ru-ginosa 液 體 培 養(yǎng) 液 體 培 養(yǎng)養(yǎng)基/胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基）基 ， 培 養(yǎng) 基，培養(yǎng)溫（mpn第 5 頁 共 45 頁公司 gmp 文件 cmcc 溫度 30 度 30 （b）10 35 ，培 35，培養(yǎng)編碼：sop-qc-ty-02-033 法

7、），培養(yǎng)溫度30104養(yǎng) 時 間 時 間 不 超18 24 過 3 天，接35，培養(yǎng)時間不超小時種 量 不 大過3天，于100cfu枯草芽孢 胰酪大豆 胰酪大豆接種量不大于100cfu胰酪大豆桿菌胨瓊脂培 胨瓊脂培胨瓊脂培(bacilluss 養(yǎng)基或胰 養(yǎng)基和胰養(yǎng)基/胰ubtilis) 酪大豆胨 酪大豆胨cmcc( 液體培養(yǎng) 液體培養(yǎng)酪大豆胨液體培養(yǎng)b) 63基，培養(yǎng) 基，培養(yǎng)溫基（mpn第 6 頁 共 45 頁公司 gmp 文件編碼：sop-qc-ty-02-033501溫度30 度3035，培 35，培養(yǎng)法），培養(yǎng)溫度30養(yǎng)時間時間不超35，培養(yǎng)1824 過3天，接時間不超小時種量不大過3

8、天，于100cfu接種量不大于100cfu白色念珠 沙氏葡萄 胰酪大豆 沙氏葡 胰酪大豆 沙氏葡菌糖瓊脂培 胨瓊脂培 萄糖瓊 胨瓊脂培 萄糖瓊(candida 養(yǎng)基或沙 養(yǎng)基，培養(yǎng) 脂培養(yǎng)養(yǎng)基脂培養(yǎng)albicans) 氏葡萄糖 溫度30 基，培 （mpn基，培養(yǎng)cmcc( 液體培養(yǎng) 35，培養(yǎng) 養(yǎng)溫度法不適溫f) 98基，培養(yǎng) 時間不超 20 用），培養(yǎng) 度 20第 7 頁 共 45 頁公司 gmp 文件編碼：sop-qc-ty-02-033001溫度20 過5天，接 25， 溫度30 25，培 種量不大 培養(yǎng)時 35，培養(yǎng) 25，養(yǎng)時間 于100cfu 間不超 時間不超 培養(yǎng)時23天過5天，

9、過5天， 間不超接種量 接種量不 過5天，不大于100cfu大于100cfu接種量不大于100cfu黑曲霉沙氏葡萄 胰酪大豆 沙氏葡 胰酪大豆 沙氏葡(aspergill 糖瓊脂培 胨瓊脂培 萄糖瓊 胨瓊脂培 萄糖瓊us niger) 養(yǎng)基或馬 養(yǎng)基，培養(yǎng) 脂培養(yǎng) 養(yǎng)（mpn 脂培養(yǎng)cmcc( 鈴薯葡萄 溫度30 基，培法不適 基，培養(yǎng)f) 98糖瓊脂培 35，培養(yǎng) 養(yǎng)溫 用），培養(yǎng)溫003養(yǎng)基，培 時間不超 度 20 溫度30 度 20第 8 頁 共 45 頁公司 gmp 文件養(yǎng)溫度 過5 天，編碼：sop-qc-ty-02-033 35，培養(yǎng) 20接種量不 25， 時間不超 25，25，培

10、大于培養(yǎng)時 過5天，接 培養(yǎng)時養(yǎng)時間57天，100cfu 間不超 種量不大 間不超過5天，于100cfu 過5天，或直到獲得豐富的孢子接種量不大于100cfu接種量不大于100cfu注：當(dāng)需用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測定霉菌和酵母菌總數(shù)時，應(yīng)進行培養(yǎng)基適用性檢查，檢查方法 同沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。4.1.4 菌種及菌液制備菌種試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過 5 代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進行保存，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。 計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和計數(shù)方法適用性試驗用菌株見表1。第 9 頁 共 45 頁公司 gmp 文件編碼：sop-qc-ty-02-033

11、菌液制備按表 1 規(guī)定程序培養(yǎng)各試驗菌株。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用ph7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加入35ml含 0.05 聚山梨酯 80 的 ph7.0 無菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液或 0.9% 無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含 0.05 聚山梨酯 80 的 ph7.0 無菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液或 0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜 濃度的黑曲霉孢子懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在 2 小時內(nèi)使用；若保存在 28，可在24小時

12、內(nèi)使用。穩(wěn)定的黑曲霉孢子懸液可保存在28，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。 4.1.5 陰性對照為確認試驗條件是否符合要求，應(yīng)進行陰性對照試驗，陰性對照試驗應(yīng)無菌生長。 如陰性對照有菌生長，應(yīng)進行偏差調(diào)查。4.1.6 培養(yǎng)基適用性檢查微生物計數(shù)用的成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進行培養(yǎng) 基適用性檢查。按表 1 規(guī)定，接種不大于 100cfu 的菌液至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，置表1 規(guī)定條件下培養(yǎng)。每一試驗菌株平行制備 2 管或 2 個平皿。同時，用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢 培養(yǎng)基進行上述試驗。被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基

13、上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在 0.5-2范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基管與對照培 養(yǎng)基管比較，試驗菌應(yīng)生長良好。第 10 頁 共 45 頁公司 gmp 文件編碼：sop-qc-ty-02-0334.1.7 計數(shù)方法適用性試驗供試液制備根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性 , 采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時 ,應(yīng)均勻加熱 ,且溫度不應(yīng)超過 45 。供試液從制備至加入檢驗用培養(yǎng)基 , 不得超過1 小時。常用的供試液制備方法如下。如果下列供試液制備方法經(jīng)確認均不適用，應(yīng)建立 其他適宜的方法。水溶性供試品取供試品，用ph7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或ph

14、7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋制成1:10 供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液 ph 值至68 。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步 10 倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。水不溶性非油脂類供試品取供試品，用 ph7.0 無菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液，或 ph7.2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基制備成 1:10 供試液。分散力較差的供試品，可在稀釋劑中加入表面活性劑如0.1% 的聚山梨酯80，使供試品分散均勻。若需要，調(diào)節(jié)供試液 ph 值至 6 8 。必要時，用同一稀釋液將供試液進一 步10 倍系列稀釋。油脂類供試品取供試品，加入經(jīng)過濾除菌的十四

15、烷酸異丙酯使溶解，或與最少量并能使供試品乳化的無菌聚山梨酯 80 或其他無抑菌性的無菌表面活性劑充分混勻。表面活性劑的溫度一般不超過40（特殊情況下，最多不超過45），小心混合，若需要可在水浴中進行，然后加入預(yù)熱的稀釋劑使成110供試液，保溫，混合，并在最短時間內(nèi)形成乳狀液。必要時，用含適宜濃度的無菌聚山梨酯80 或其他 無抑制性無菌表面活性劑的稀釋劑進一步10 倍系列稀釋。第 11 頁 共 45 頁公司 gmp 文件需用特殊方法制備供試液的供試品編碼：sop-qc-ty-02-033膜劑供試品取供試品 ,剪碎,加ph7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或 ph7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液

16、體培養(yǎng)基，浸泡，振搖，制備成 1 10 的供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液 ph 值至6 8。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步 10倍系列 稀釋。腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品取供試品，加入 ph6.8 無菌磷酸鹽緩沖液（用于腸溶制劑）或ph7.6 無菌磷酸鹽緩沖液（用于結(jié)腸溶制劑），置45水浴中,振搖,使溶解,制備成110 的供試液。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。氣霧劑、噴霧劑供試品取供試品 ,置冰凍室冷凍約 1 小時，取出，迅速消毒供試品開啟部位，用無菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉(zhuǎn)動容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器從每一容器中吸出全部藥液于無菌容器中混合，然后

17、取樣檢查。貼膏劑供試品取供試品 , 去掉防粘層，將粘貼面朝上放置在無菌玻璃或塑料器皿上，在粘貼面上覆蓋一層適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布），避免貼膏劑粘貼在一起。將處理后的貼膏劑放入盛有適宜體積并含有表面活性劑（如聚山梨脂80 或卵磷脂）稀釋液的容器中，振蕩至少30 分鐘。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步 10 倍系列稀釋。接種和稀釋按下列要求進行供試液的接種和稀釋 , 制備微生物回收試驗用供試液。所加菌液的體積應(yīng)不超過供試液體積的 1%。為確認供試品中的微生物能被充分檢出，首先應(yīng) 選擇最低稀釋級的供試液進行計數(shù)方法適用性試驗。（1）試驗組取上述制備好的供試液，加入試驗菌液，混勻，使每 1m

18、l供試液第 12 頁 共 45 頁公司 gmp 文件或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100cfu 。編碼：sop-qc-ty-02-033（2）供試品對照組取制備好的供試液, 以稀釋液代替菌液同試驗組操作。（3）菌液對照組取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液,按試驗組操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因?qū)е聼o法選擇最低稀釋級的供試液進行方法適用性試驗時，應(yīng)采用適宜的方法對供試液進行進一步的處理。如果供試品對微生物生長的抑制作用無法以其他方法消除，供試液可經(jīng)過中和、稀釋或薄膜過濾處 理后再加入試驗菌懸液進行方法適應(yīng)性試驗。抗菌活性的去除或滅活供試

19、液接種后，按下列“微生物回收”規(guī)定的方法進行微生物計數(shù)。若試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值小于菌液對照組菌數(shù) 值的50%，可采用下述方法消除供試品的抑菌活性。1 增加稀釋液或培養(yǎng)基體積。2 加入適宜的中和劑或滅活劑。中和劑或滅活劑（表 2）可用于消除抗菌劑的抑菌活性， 最好在稀釋劑或培養(yǎng)基滅菌前加入。若使用中和劑或滅活劑，試驗中應(yīng)設(shè)中和劑或滅活劑對照組，即取相應(yīng)量稀釋液替代供試品同試驗組操作，以確認其有效性和對微生物無毒性。中和劑或 滅活劑對照組的菌落數(shù)與菌液對照組的菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.52范圍內(nèi)。表2 常見干擾物的中和劑或滅活方法干擾物戊二醛酚類、乙醇、吸附物 醛類可選用的中和劑或滅活

20、方法 亞硫酸氫納稀釋法甘氨酸季銨化合物、對羥基苯甲酸、雙胍類化合物 卵磷脂第 13 頁 共 45 頁公司 gmp 文件季銨化合物、碘、對羥基苯甲酸 水銀水銀、汞化物、醛類編碼：sop-qc-ty-02-033聚山梨酯巰基醋酸鹽硫代硫酸鹽乙二胺四乙酸（edta）、喹諾酮類抗生素 鎂或鈣離子磺胺類-內(nèi)酰胺類抗生素對氨基苯甲酸 -內(nèi)酰胺酶3 采用薄膜過濾法。4 上述幾種方法的聯(lián)合使用。若沒有適宜消除供試品抑菌活性的方法，對特定試驗菌回收的失敗，表明供試品對該試驗菌具有抗菌活性，同時也表明供試品不可能被該類微生物污染。但是，供試 品也可能僅對特定試驗菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作用。因此，根

21、據(jù)供試品須符合的微生物限度標準和菌數(shù)報告規(guī)則，在不影響檢驗結(jié)果判斷的前提下，應(yīng)采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行計數(shù)方法適用性試驗。若方法適用性試驗符合要求，應(yīng)以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進行 供試品檢查。供試品中微生物的回收表1 所列的計數(shù)方法適用性試驗用的各試驗菌應(yīng)逐一進行微生物回收試驗。 微生物的回收可采用平皿法、薄膜過濾法或mpn 法。平皿法平皿法包括傾注法和涂布法。表 1 中每株試驗菌每種培養(yǎng)基至少制備2 個平皿，以算術(shù)均值作為計數(shù)結(jié)果。傾注法取照上述“供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的中和或消除”制備的供試液1ml，置直徑90mm 的無菌平皿中, 注入1

22、520ml 溫度不超過45熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基的用量應(yīng)相應(yīng)增加。按表 1 規(guī)定條件培養(yǎng)、計第 14 頁 共 45 頁公司 gmp 文件 數(shù)。編碼：sop-qc-ty-02-033同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。計算各試驗組的平均菌落數(shù)。涂布法取1520ml 溫度不超過45的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，注入直徑90mm 的無菌平皿，凝固，制成平板，采用適宜的方法使培養(yǎng)基表面干燥。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基用量也應(yīng)相應(yīng)增加。每一平皿表面接種上述照“供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的中和或消除”制備

23、的供試液不少于0.1ml。按表1 規(guī)定條件培養(yǎng)、計數(shù)。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。 計算各試驗組的平均菌落數(shù)。薄膜過濾法薄膜過濾法所采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于 0.45m,直徑一般為50mm,若采用其他直徑的濾膜,沖洗量應(yīng)進行相應(yīng)的調(diào)整。選擇濾膜材質(zhì)時應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時 ,應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品 , 其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率 ,應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每

24、張濾膜每次沖洗量為100ml 。總沖洗量不得超過 1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷。取照上述“供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的中和或消除”制備的供試液適量（一般取相當(dāng)于1g、1ml或10cm2的供試品,若供試品中所含的菌數(shù)較多時，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液中,混勻,過濾。用適量的沖洗液沖洗濾 膜。若測定需氧菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上；若測定霉菌和酵母總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。按表1 規(guī)第 15 頁 共 45 頁公司 gmp 文件編碼：sop-qc-ty-02-033定條件培養(yǎng)、計數(shù)。每株試驗菌每種培養(yǎng)基至少制

25、備一張濾膜。同法測定供試品對照 組及菌液對照組菌數(shù)。 mpn 法 mpn 法的精密度和準確度不及薄膜過濾法和平皿計數(shù)法，僅在供試品需氧菌總數(shù)沒有適宜計數(shù)方法的情況下使用，本法不適用于霉菌計數(shù)。若使 用mpn 法，按下列步驟進行。取照上述 “供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的中和或消除 ”制備的供試液至少 3 個連續(xù)稀釋級，每一稀釋級取 3 份 1ml 分別接種至 3 管裝有 9 10ml 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同法測定菌液對照組菌數(shù)。必要時可在培養(yǎng)基中加 入表面活性劑、中和劑或滅活劑。接種管置3035培養(yǎng)3 天，逐日觀察各管微生物生長情況。如果由于供試品的原因使得結(jié)果難以判斷，可將

26、該管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng)12 天，觀察是否有微生物生長。根據(jù)微生物生 長的管數(shù)從表3 查對被測供試品每1g 或每1ml 中總需氧菌的最可能數(shù)。表3 微生物最可能數(shù)檢索表生長管數(shù)每管含樣品的g或ml數(shù)需氧菌總數(shù) 最可能數(shù)95%置信限mpn/g或ml下限上限0.10.010.0010000001101013336.100.10.11.29.49.51017第 16 頁 共 45 頁公司 gmp 文件編碼：sop-qc-ty-02-03300111111112222222222232300011223000111222330000120101001

27、20120120106.29.43.67.2117.4111115169.214201520272128352936231.23.50.21.241.344551.54545959999517351717352035353838353538383894409494949494第 17 頁 共 45 頁公司 gmp 文件編碼：sop-qc-ty-02-0333333333333333300111122223333120123012301233864437512016093150210290240460110011009169173030183030904090200104181181199360

28、38036038040099099019804000注：表內(nèi)所列檢驗量如改用1g（或ml）、0.1g（或ml）和0.01g（或ml）時，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低 10 倍；如改用 0.01 g（或ml ）、0.001 g （或ml）和0.0001 g （或ml）時，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增第 18 頁 共 45 頁公司 gmp 文件 加10 倍，其余類推。編碼：sop-qc-ty-02-033結(jié)果判斷計數(shù)方法適用性試驗中，采用薄膜過濾法或平皿法時，試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在 0.5 2 范圍內(nèi)；采用 mpn 法，試驗組菌數(shù)應(yīng)在菌液對照組菌數(shù)的 95%置信限內(nèi)。若各試驗

29、菌的回收試驗均符合要求，照所用的供試液制備方法及計數(shù)方法進行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌 總數(shù)計數(shù)。方法適用性確認時,若采用上述方法還存在一株或多株試驗菌的回收達不到要求 , 那么選擇回收最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢查。4.1.8 供試品檢查檢驗量檢驗量即一次試驗所用的供試品量（g、ml 或cm2）。除另有規(guī)定外 , 一般供試品的檢驗量為 10g 或 10ml ；膜劑為 100cm2；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。檢驗時 , 應(yīng)從 2 個以上最小包裝單位中抽取供 試品,大蜜丸還不得少于4 丸,膜劑還不得少于4 片。一般應(yīng)隨機抽取供試品，取規(guī)定容器數(shù)，混合，取規(guī)定量供

30、試品進行檢驗。 供試品的檢查按計數(shù)方法適用性試驗確認的計數(shù)方法進行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌 總數(shù)的測定。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于測定需氧菌總數(shù)；沙氏葡萄 糖瓊脂培養(yǎng)基用于測定霉菌和酵母菌總數(shù)。陰性對照試驗以稀釋劑代替供試液進行陰性對照試驗，陰性對照試驗應(yīng)無菌生 第 19 頁 共 45 頁公司 gmp 文件長。如果陰性對照有菌生長，應(yīng)進行偏差調(diào)查。編碼：sop-qc-ty-02-033平皿法平皿法包括傾注法和涂布法。除另有規(guī)定外，取規(guī)定量供試品，按方法適用性試驗確認的方法進行供試液制備和菌數(shù)測定，每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2個平皿。培養(yǎng)和計數(shù) 除另有規(guī)定外，胰酪大豆

31、胨瓊脂培養(yǎng)基平板在 3035培養(yǎng)3天，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板在 2025培養(yǎng) 5 天， 觀察菌落生長情況 , 點計平板上生長的所有菌落數(shù)，必要時可適當(dāng)延長培養(yǎng)時間至 7 天進行菌落計數(shù)并報告。菌落蔓延生長成片的平皿不宜計數(shù)。點計菌落數(shù)后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)。若同稀釋級兩個平皿的菌落數(shù)平均值不小于 15 ，則兩個 平皿的菌落數(shù)不能相差1 倍或以上。菌數(shù)報告規(guī)則 需氧菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于 300cfu 的稀釋級、霉菌和酵母菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu 的稀釋級，作為菌數(shù)報告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。取最高的平均菌落數(shù)，計算1g、1ml

32、或10cm2 的微生物數(shù)。供試品中所含如各稀釋級的平皿均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌 落數(shù)小于1 時，以1 乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。薄膜過濾法除另有規(guī)定外，按計數(shù)方法適用性試驗確認的方法進行供試液制備。取相當(dāng)于1g、1ml 或10cm2供試品的供試液，若供試品所含的菌數(shù)較多時，可取適宜稀釋級的供試液，照方法適用性試驗確認的方法加至適量稀釋液中，立即過濾，沖洗，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培 養(yǎng)。第 20 頁 共 45 頁公司 gmp 文件編碼：sop-qc-ty-02-033培養(yǎng)和計數(shù) 培養(yǎng)條件和計數(shù)方法同平皿計數(shù)法，每

33、張濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過 100cfu。菌數(shù)報告規(guī)則 以相當(dāng)于 1g、1ml 或10cm2供試品的菌落數(shù)報告菌數(shù)；若濾膜上無菌落生長，以 1 報告菌數(shù)（每張濾膜過濾 1g、1ml 或 10cm2 或1 乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。供試品） , mpn 法取規(guī)定量供試品，按方法適用性試驗確認的方法進行供試液制備和供試品接種，所有試驗管在 3035 培養(yǎng) 3 5 天，如果需要確認是否有微生物生長，按方法適應(yīng)性試驗確定的方法進行。記錄每一稀釋級微生物生長的管數(shù)，從表 3查對每 1g 或 1ml 供試品中需氧菌總數(shù)的最可能數(shù)。4.1.9 結(jié)果判斷需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)（包

34、括真菌菌落數(shù)）；霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)（包括細菌菌落數(shù)）。若因沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的細菌使霉菌和酵母菌的計數(shù)結(jié)果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、慶大霉素）的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或其他選擇性培養(yǎng)基（如玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基）進行霉菌和酵母菌總數(shù)測定。使用選擇性培養(yǎng)基時，應(yīng)進行培養(yǎng)基適用性檢查。若采用mpn 法，測定結(jié)果為需氧菌總數(shù)。 各品種項下規(guī)定的微生物限度標準解釋如下：101 cfu ： 可接受的最大菌數(shù)為20；102 cfu ： 可接受的最大菌數(shù)為200 ；103 cfu ： 可接受的最大菌數(shù)為2000 ：依此類推。若供試品的需氧菌總數(shù)、

35、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢查結(jié)果均符合該品種項下的規(guī)第 21 頁 共 45 頁公司 gmp 文件編碼：sop-qc-ty-02-033定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項不符合該品種項下的規(guī)定，判供試品不符合 規(guī)定。稀釋液、沖洗液及培養(yǎng)基見非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法（通則1106 ）無菌檢查法系用于檢查藥典要求無菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器具、原料、輔料、及其他品種是否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定 ,僅表明了供試品 在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。4.1.10 稀釋液、沖洗液及培養(yǎng)基見非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制及檢查法。4.2 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制及檢查法4.

36、2.1 簡述控制菌檢查法系用于在規(guī)定的試驗條件下，檢查供試品中是否存在特定的微生 物。當(dāng)本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料是否符合相應(yīng)的微生物限度標準時，應(yīng) 按下列規(guī)定進行檢驗，包括樣品取樣量和結(jié)果判斷等。本檢查法可采用替代的微生物檢查法，包括自動檢測方法，但必須證明替代方法 等效于藥典規(guī)定的檢查方法。供試液制備及實驗環(huán)境要求同 “ 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法 ” （通則1105）。如果供試品具有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢查時, 若使用了中和 劑或滅活劑，應(yīng)確認有效性及對微生物無毒性。供試液制備時如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認其對微生物無毒性以及與所使用中第 22 頁 共

37、 45 頁公司 gmp 文件和劑或滅活劑的相容性。編碼：sop-qc-ty-02-0334.2.2 培養(yǎng)基適用性檢查和控制菌檢查方法適用性試驗供試品控制菌檢查中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進行適用性檢查。供試品的控制菌檢查方法應(yīng)進行方法適用性試驗，以確認所采用的方法適合于該 產(chǎn)品的控制菌檢查。若檢驗程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗結(jié)果時，控制菌檢查方法應(yīng)重新進行適 用性試驗。4.2.3 菌種及菌液制備菌種試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過 5 代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進行保存，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。 金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)c

38、mcc（b）26 003銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa) cmcc（b）10 104 大腸埃希菌(escherichia coli) cmcc（b）44 102乙型副傷寒沙門菌(salmonella paratyphi b) cmcc（b）50 094 白色念珠菌(candida albicans)cmcc（f）98 001 生孢梭菌（clostridium sporogenes）cmcc（b）64 941菌液制備將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌分別接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上， 3035培養(yǎng) 1824 小時；將白色念珠菌

39、接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上或沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，2025培養(yǎng) 23 天；將生孢梭菌接種于梭菌增菌培養(yǎng)基中置厭氧條件下 3035培養(yǎng) 2448 小時或接種于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中 3035培養(yǎng) 1824 小時。上述培養(yǎng)物用 ph7.0 無菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液或 0.9% 無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度第 23 頁 共 45 頁公司 gmp 文件 的菌懸液。編碼：sop-qc-ty-02-033菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2 小時內(nèi)使用；若保存在28，可在24 小時內(nèi)使用。生孢梭菌孢子懸液可替代新鮮的菌懸液，穩(wěn)定的孢子懸液可保存在 2 8，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。4.2.4 陰性對照為確

40、認試驗條件是否符合要求，應(yīng)進行陰性對照試驗，陰性對照試驗應(yīng)無菌生長。 如陰性對照有菌生長，應(yīng)進行偏差調(diào)查。4.2.5 培養(yǎng)基適用性檢查控制菌檢查用的成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進行培養(yǎng) 基的適用性檢查?？刂凭鷻z查用培養(yǎng)基的適用性檢查項目包括促生長能力、抑制能力及指示特性的 檢查。各培養(yǎng)基的檢測項目及所用的菌株見表1。表1 控制菌檢查用培養(yǎng)基的促生長能力、抑制能力和指示特性控制菌培養(yǎng)基特性試驗菌株檢查耐膽鹽腸道菌增菌液大腸埃希菌、促生長能力革蘭陰體培養(yǎng)基銅綠假單胞菌性菌抑制能力金黃色葡萄球第 24 頁 共 45 頁公司 gmp 文件編碼：sop-qc-ty-02-033菌紫紅

41、膽鹽葡萄促生長能力大腸埃希菌、糖瓊脂培養(yǎng)基 +指示特性 麥康凱液體培促生長能力 養(yǎng)基銅綠假單胞菌大腸埃希菌大腸埃金黃色葡萄球抑制能力希菌菌麥康凱瓊脂培促生長能力大腸埃希菌養(yǎng)基+指示能力rv 沙門菌增乙型副傷寒沙促生長能力菌液體培養(yǎng)基沙門菌 四硫磺酸鈉亮門菌乙型副傷寒沙促生長能力綠培養(yǎng)基門菌抑制能力第 25 頁 共 45 頁金黃色葡萄球公司 gmp 文件木糖賴氨酸脫編碼：sop-qc-ty-02-033菌氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基三糖鐵瓊脂培 養(yǎng)基溴化十六烷基銅綠假 三甲銨瓊脂培 單胞菌 養(yǎng)基促生長能力+指示能力指示能力促生長能力抑制能力乙型副傷寒沙 門菌乙型副傷寒沙 門菌銅綠假單胞菌大腸埃希菌金黃色葡

42、萄球菌梭菌甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基梭菌增菌培養(yǎng)促生長能力+指示能力抑制能力促生長能力金黃色葡萄球 菌大腸埃希菌生孢梭菌第 26 頁 共 45 頁公司 gmp 文件 基哥倫比亞瓊脂編碼：sop-qc-ty-02-033促生長能力生孢梭菌培養(yǎng)基沙氏葡萄糖液促生長能力白色念珠菌體培養(yǎng)基沙氏葡萄糖瓊促生長能力白色念白色念珠菌脂培養(yǎng)基 +指示能力珠菌念珠菌顯色培促生長能力養(yǎng)基 +指示能力抑制能力白色念珠菌大腸埃希菌液體培養(yǎng)基促生長能力檢查分別接種不大于 100cfu 的試驗菌（見表 1）于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不長于規(guī)定的最短培 養(yǎng)時間下培養(yǎng)，與對照培養(yǎng)基管比較，被檢培

43、養(yǎng)基管試驗菌應(yīng)生長良好。固體培養(yǎng)基促生長能力檢查用涂布法分別接種不大于100cfu 的試驗菌（見表1）于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不長于規(guī)定的最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基上生長的菌落大小、形態(tài)特征第 27 頁 共 45 頁公司 gmp 文件 應(yīng)一致。編碼：sop-qc-ty-02-033培養(yǎng)基抑制能力檢查接種不少于100cfu 的試驗菌（見表1 ）于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不短于規(guī)定的最長培養(yǎng)時間下培 養(yǎng)，試驗菌應(yīng)不得生長。培養(yǎng)基指示特性檢查用涂布法分別接種不大于 100cfu 的試驗菌（見表 1）于被檢培養(yǎng)基

44、和對照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不長于規(guī)定的最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基上試驗菌生長的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反應(yīng) 情況等應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致。4.2.6 控制菌檢查方法適用性試驗供試液制備 按下列“供試品檢查”中的規(guī)定制備供試液。試驗菌根據(jù)各品種項下微生物限度標準中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)試驗菌株，確認耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法時,采用大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗菌。適用性試驗按控制菌檢查法取規(guī)定量供試液及不大于 100cfu 的試驗菌接入規(guī)定的培養(yǎng)基中；采用薄膜過濾法時 , 取規(guī)定量供試液 , 過濾 , 沖洗 , 試驗菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中,過濾后,注入規(guī)定的培養(yǎng)基或取出濾膜接入規(guī)定的培養(yǎng)基中。依相應(yīng)的控制菌檢查方法，在規(guī)定的溫度及最短時間下培養(yǎng)，應(yīng)能檢出所加試驗菌相應(yīng)的反應(yīng) 特征。結(jié)果判斷上述試驗若檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查方法進行供試品檢查；若未檢出試驗菌，應(yīng)消除供試品的抑菌活性（見非無菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計數(shù)法中的“抗菌活性的去除或滅活”），并重新進行方法適用性試驗。如果經(jīng)過試驗確證供試品對試驗菌的抗菌作用無法消