HPLC法測定艾司唑侖血藥濃度的方法驗證.

1、HPLC法測定艾司唑侖血藥濃度的方法驗證侯大平*,張志國#，國玉芝，雷力力，黃展(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，佳木斯市154002)中圖分類號R 969. 1； R 971+. 3文獻標(biāo)識碼A文章編號1001-0408 ( 2011)14-1280-03摘要目的：建立測定艾司唑侖血藥濃度的方法，以確定較好的檢測條件。方 法：采用高效液相色譜法，以依利特 Hypersil-1ODS 2C 18為色譜柱，甲醇-乙腈-水(28 : 28 : 54)為流動相，1.0mL min為 流速，35C為柱溫，230nm為檢測波長，地西泮為內(nèi)標(biāo)，考察服用艾司唑侖片患 者血漿、堿化血漿、血清濃度并對選定的標(biāo)本及提取方

2、法進行驗證。結(jié)果：艾司唑 侖血漿濃度明顯高于堿化血漿及血清濃度，經(jīng)成對雙側(cè)t檢驗，艾司唑侖血漿濃度與堿化血漿及血清濃度比較(P分別為0. 01130 0. 01817)，有顯著性差異。艾 司唑侖血藥濃度在0. 04941.2896卩g - mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r = 0.9918)，定量下限為0. 0494卩g平均日內(nèi)、日間 RSD均V 10%，平均回 收率為99. 95%100. 79%。結(jié)論：采用患者血漿作為標(biāo)本進行艾司唑侖血藥濃度 監(jiān)測和藥物中毒的定量分析可行，本方法簡便、準(zhǔn)確。關(guān)鍵詞艾司唑侖；血漿；堿 化血漿；血清；高效液相色譜法；血藥濃度Method Validati on of

3、 Plasma Concen trati on Determ in ati on of Estazolam by HPLC HOU Da-pi ng , ZHANG Zhi-guo , GUO Yu-zhi , LEI Li-li , HUANG Zha n (The First Affiliated Hospital of Jiamusi University , Jiamusi 154002 China )ABSTRACT OBJECTIVE : To establish the method for plasma concentration determ in ati on of est

4、azolam, and to confirm optimal determ in ati on con diti ons. METHODS : HPLC method was adopted. The determ in ati on was performed on Elite Hypersil ODS 2C 18column with methanol-acetonitrile-water (28 : 28 : 54) as mobile phase at flow rate of 1.0mL min 1. The colu mn temperature was set at 36 and

5、 detect ion wavele ngth was 230nm. Diazepam was used as the in ternal sta ndard. The concentrations of estazolam in plasma alkalinized plasma and serum in patients recei ving estazolam were determ in ed. Selected samples and extracti on method were verified. RESULTS : Plasma concentration of estazol

6、am was significantly higher than those in alkalinized plasma and serum. In bilateral paired t test the concentration of estazolam in plasma was significantly different from that in alkalinized plasma and serum-mL(P = 0. 01130and P= 0. 01817) . The linear range of estazolam was 0. 049 1. 2896 卩 g L1

7、(r = 0. 9918) . The minimum quanti-tation limit was 0. 0494卩 g1. The average recovery rate was 99. S 100. 79%. The RSD of in tra-day and inter-day were less than 1% . CONCLUSION : It is feasible to collect plasma sample of patie nts for plasma concen trati on mon itori ng of estazolam and qua ntitat

8、i on an alysis of drug poisoning. The method is simple, accurate. KEY WORDS Estazolam； Plasma； Alkalinized plasma ; Serum ； HPLC ; Plasma concentration艾司唑侖為臨床常用的 鎮(zhèn)靜催眠藥，也可用于抗焦慮、抗癲癇治療，大劑量可引起外周神經(jīng)肌肉阻滯、興 奮不安等不良反應(yīng)，嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡。鑒于其臨床應(yīng)用廣泛，監(jiān)測其血藥濃度對 臨床治療和中毒搶救均有重要意義。然而，在高效液相色譜(HPLC )法測定艾司唑侖血藥濃度時，文獻報道有使用123-1血漿、堿化血

9、漿和血清作為標(biāo)本檢測，為確定一種較好的方法，本文對使用標(biāo) 本、提取方法進行了初選，結(jié)果使用血漿作為標(biāo)本，艾司唑侖檢出率較高。以此為 基礎(chǔ)，對HPLC法檢測血漿艾司唑侖血漿藥物濃度方法進行了驗證，結(jié)果證明此 法簡便、準(zhǔn)確。艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號：1219-0102）;內(nèi)標(biāo)：地西泮標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號： 171225-200302）;甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。22. 1方法與結(jié)果11. 1材料儀器P 230H高效液相色譜儀（大連伊利特分析儀器有限公司）；XW-80渦旋混合器（上海精科實業(yè)有限公司）；AUW 220D十萬分之一分析天平（日本島津公

10、司）。1.2試藥科雜志，1994，9 （6）: 343.色譜條件色譜柱：Hypersil ODS 2C 18 （250m材 4.6mm，5pm）;流動相：甲醇-乙腈-水（28 : 28： 44）;流速：1. OmL min ;檢測波長：230nm ; 柱溫：35C ;進樣量：20此。2. 2標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備2. 2. 1艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)品24. 80mg，置于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取該溶液5mL，置于50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得濃度為0. 0248mg mL 1的艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)溶液。2. 2. 2內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取地西泮標(biāo)準(zhǔn)品

11、5. 00mg ,置于25mL容量瓶中， 用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取該溶液5高瑞林，李華，楊輝，等.靜脈注射a 12b干擾素治療嬰幼兒病毒性肺炎療效分析J.中國綜合臨床，2001，17 （7）： 560.*主任藥師。研究方向：臨床藥學(xué)。電話通訊作者：主任藥師。研究方向：藥物分析與藥動學(xué)。電話： Chi naPharmacy 2011V ol. 22No. 140454-8623372 E-mail : zzg-0000 1280 -中國藥房201122卷第14期（收稿日期：2010-10-27年第修回日期：2010-11- 27）5mL，置于50mL容量

12、瓶中，加甲醇至刻度搖勻，即得濃度為0. 02mg mL 1的地西泮溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。2. 3使用標(biāo)本及提取方法初選2. 3. 1血樣的采 集：隨機選取我院門診服用艾司唑侖患者10名，男、女各半，年齡2855歲。晚10 : 00時口服艾司唑侖片2mg，200mL溫開水送服。于服藥后次日晨 9 : 00時用 檸檬酸鈉抗凝和無抗凝劑真空管采集外周靜脈血，分離出血漿或血清后，置10C以下冰箱保存待用。2. 3. 2血樣處理：（1）精密取患者血漿1mL，置于10mL玻 璃試管內(nèi)，加入0. 02mg mL 1地西泮內(nèi)標(biāo)溶液25此，渦旋混勻，加入乙酸乙酯 5mL，渦旋震蕩3min，3500r min 1離

13、心10min，分離乙酸乙酯于10mL試管 內(nèi)，45C下N 2氣流吹干，甲醇100此溶解，作為血漿樣品溶液。（2）精密取患 者血漿1mL，置-1于10mL玻璃試管內(nèi)，加入0. 02mg mL地西泮內(nèi)標(biāo)溶液25此，加入0. 01mol 1氫氧化鈉0. 25mL堿化，渦旋混勻，加入乙酸乙酯 5mL，渦旋震蕩 3min，3500r min 1離心10min，分離乙酸乙酯于10mL試管內(nèi)，45C下N 2氣 流吹干，甲醇100此溶解，作為堿化血漿樣品溶液。（3）精密取患者血清 1mL，置于110mL玻璃試管內(nèi)，加入0. 02mg mL地西泮內(nèi)標(biāo)溶液25此，渦旋混勻，加入 乙酸乙酯5mL，旋渦震蕩3min，

14、3500r min 1離心10min，分離乙酸乙酯于 10mL試管內(nèi)，45C下N 2氣流吹干，甲醇溶解100丄，作為血清樣品溶液。2. 3. 3 血樣測定：分別取血漿樣品、堿化血漿樣品和血清樣品，按“ 2.傾色譜條件進樣檢測，以內(nèi)標(biāo)法計算含量，結(jié)果如表1。表13組樣品含量測定結(jié)果Tab 1Content determ in atio n of samples of 3groups序號 12345678910血漿 0. 084130. 069270. 108310. 073890. 049650. 079060.090820. 071190. 057220. 173950. 08575艾司唑侖含

15、量/卩g - n-L堿化血漿 0. 079120. 054420. 083290. 028100. 055280. 070650. 062970. 056490.046120. 171820. 07113血清 0. 081800. 053190. 080270. 029240. 058520. 075340. 063100. 055460.047860. 169820. 07146mV 321600321mV 32160691215min 03691215mi nA B圖1高效液相色譜圖A.血漿樣品+內(nèi)標(biāo)；B.空白血漿；1.艾司唑侖；2.地西泮Fig 1HPLC ChromatogramsA.

16、 plasma+internalstandard; B. blank plasma ； 1. estazolam； 2. diazepam2. 5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密取健康人血漿1mL，置于10mL玻璃試管內(nèi)，加入0. 02mg mL 1地西泮內(nèi)標(biāo)溶液25此，加入0. 0248mg mL 1艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)液分別為 2、6、10、14、18、22、26、52丄，渦旋混勻，加乙酸乙酯 5mL，渦旋震蕩3min ,3500r min 1離心10min，分離乙酸乙酯于10mL試管內(nèi)，45C下N 2氣流吹干，甲醇100此溶解，按“2. 1項色譜條件進樣，記錄色譜。將艾司唑侖的標(biāo)準(zhǔn)濃 度（X ）對其峰面積與內(nèi)

17、標(biāo)峰面積比值（丫）進行線性回歸，得艾司唑侖回歸方程為丫 = 1.3183X +0. 0656 （r = 0. 9918），結(jié)果表明，艾司唑侖血藥濃度在 0.04941.2896卩g -mlL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為 0. 0494卩g rUL 2. 6加樣回收率及精密度試驗按“2. 4項下方法，分別配制含艾司唑侖 0. 3968、0. 2480、0. 0992卩g 高mL中、低3種濃度的樣品各5份，按“2. 1項色譜條件進樣檢 測，以內(nèi)標(biāo)法計算回收率；同法制備含艾司唑侖高、中、低3種濃度樣品各1份，分別在同日不同時間進樣5次，以及在3d內(nèi)進樣5次，以樣品及內(nèi)標(biāo)峰面積比值 計算日內(nèi)及日間精

18、密度。精密度及回收率試驗結(jié)果見表2。表2精密度及回收率試驗結(jié)果(n = 5)Tab 2Results of recovery and precisi on tests (n = 5)加入量 / 卩 g -39680. 24800. 0992測得量/卩g - mL0. 3999 03040. 2482 0. 7250. 9915 0. 964回收率 /% 100. 79100. 1099. 95RSD 日內(nèi) RSD 日間 RSD /%/%/% 3. 015. 584. 467. 243. 244. 129. 655. 818. 542. 7將3組樣品分別進行成對雙側(cè)t檢驗：血漿、堿化血漿樣品檢測

19、含量比較，P = 0. 01130,有顯著性差異；血漿、血清樣品檢測含量比 較，P = 0. 01817,有顯著性差異；堿化血漿樣品、血清樣品檢測含量比較，P = 0.74081，無顯著性差異?？梢娧獫{樣品艾司唑侖含量約是堿化血漿和血清樣品的1.2倍。因而選定以血漿樣品作為艾司唑侖血藥濃度檢測的標(biāo)本。2. 4色譜行為精密取健康人血漿1mL，置于10mL玻璃試管內(nèi)，加入0. 0248mg ml_ 1的 艾司唑侖標(biāo)準(zhǔn)溶液10此，0. 02mg mL 1地西泮內(nèi)標(biāo)溶液25此，渦旋混勻，力卩 入乙酸乙酯5mL，渦旋振蕩3min，3500r min 1離心10min，分離乙酸乙酯于 10mL試管內(nèi)，45

20、C下N 2氣流吹干，甲醇100此溶解；同法制備不含艾司唑侖和內(nèi)標(biāo)的空白血漿溶液。按 “2.傾色譜條件進樣，高效中國藥房 2011年第22卷第 14期液相色譜圖見圖1。血漿樣品室溫放置穩(wěn)定性試驗用空白血漿制備含艾司唑侖 0. 3968、0. 2480、0. 0992卩g mL高、中、低3 種濃度的樣品，室溫放置，分別于 0、24、48h時取樣，按“2. 4項方法處理并測 定。結(jié)果艾司唑侖含量 RSD分別為5. 84%、10. 54%和9. 12%，表明樣品在室溫 放置穩(wěn)定。3討論艾司唑侖口服吸收后，血漿蛋白結(jié)合率為93%4，2010年版中國藥典中艾司唑侖性狀項下表述為 本品在三氯甲烷中易溶，；在

21、醋酐中易溶”，這可能 是血漿濃度高于堿化血漿和血清濃度的主要原因；同時提取溶媒的不同也可能是造2，3成與其他作者產(chǎn)生試驗差異的原因。在進行使用標(biāo)本及提取方法初選時使用服 藥患者血樣是考慮到藥物吸收后會與血漿蛋白結(jié)合，而體外加入藥品會影響與血漿 蛋白結(jié)合，因而選用了患者血樣作為試驗標(biāo)本。1本試驗曾選用甲醇-水（65 : 35）、甲醇-乙腈-水（30 : 30 : 240）作為流動相，最終發(fā)現(xiàn)采用甲醇-乙腈-水 （ 28： 28： 44）的比例，2組分 分離度較好；曾考慮采用卡馬西平為內(nèi)標(biāo)，但在此試China Pharmacy 2011V ol. 22No. 14由于地西泮驗條件下，卡馬西平與艾司

22、唑 侖不能有效分離1281 LC-MS/MS法測定人血漿中硫酸氨基葡萄糖濃度及其藥動學(xué)研究栗艷*，田云，關(guān)月，奚苗苗，常瑛，文愛東（第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科，西安市710032）中圖分類號R 969. 1文獻標(biāo)識碼 A文章編號1001-0408 （2011） 14-1282-04摘要目的：建立測定人血漿中硫酸氨基葡萄糖濃度的方法，并考察其藥動學(xué)特 征。方法：采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜電噴霧檢測（LC-MS/MS ）法，色譜柱為 Phenomenex ODS，流動相為甲醇-0. 2%醋酸銨-0. 1 %甲酸緩沖液（梯度洗脫）， 流速為1.0mL min 1;電噴霧電離源，正離子模式下以選擇反應(yīng)監(jiān)

23、測（SRM ） 方式進行監(jiān)測。以DAS 2. 0軟件進行房室模型擬合，計算主要藥動學(xué)參數(shù)。結(jié) 果：在選定的色譜及質(zhì)譜條件下，硫酸氨基葡萄糖與內(nèi)標(biāo)及血漿雜質(zhì)分離良好，氨 基葡萄糖增量濃度在8. 27165、1658268ng mL 1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。方 法回收率為103. 8%113. 7%，日內(nèi)和日間RSD均20%。健康受試者單劑量口 服低、中、高劑量（500、1000、1500mg ）復(fù)方硫酸氨基葡萄糖分散片后的藥-時 曲線符合非房室模型，主要藥動學(xué)參數(shù)分別為：t 1/2為（1.2 4）、(1. 3 4)、( 1.4 9) h，t max (2. 6 4)、( 2. 7 9)、( 1.9

24、 8) h，c max (41793)、( 795吃81)、( 92582) ng mL，AUC 0 10(1416201)、( 3366020)、( 4033282) ng h mL，MRT 010 (3. 2 7)、( 3. 6 2)、( 3. 3 6) h ;多劑量口服低劑量(每次 500mg，ss 1sstid )復(fù)方硫酸氨基葡萄糖分散片達到穩(wěn)態(tài)后，主要藥動學(xué)參數(shù)為：c max(29475. 6)ng mL， c min ( 59. 4 55. 7) ng mL 1，t max ( 1.9 1) h，t 1/() h , AUC 0 10 (1015=243) ng h mL 1, A

25、UC ss (1000吃44) ng h mL 1, c ss av (12530. 6) ng mL 1, MRT 0 10 (2. 7 . 4 80. 3)。結(jié)論： 本方法適用于復(fù)方硫酸氨基葡萄糖分散片人體內(nèi)藥動學(xué)研究。健康受試者單劑量口 服本品后，氨基葡萄糖的吸收程度(AUC 0t和c max )與劑量在試驗設(shè)計的劑 量范圍內(nèi)存在一定的線性關(guān)系；連續(xù)口服本品后，在體內(nèi)基本無積蓄現(xiàn)象。關(guān)鍵詞 復(fù)方硫酸氨基葡萄糖分散片；高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜電噴霧檢測法；藥動學(xué)Determi nation of Glucosami ne Sulfate in Human Plasma by LC-MS/MSa

26、 nd Its Pharmacokinetic Study LI Yan , TIAN Yun , GUAN Yue , XI Miao-miao , CHANG Ying , WEN Ai-dong (Dept. of Pharmacy, Xijing Hospi-tal of Fourth Military Medical University , Xi an 710032China )ABSTRACT OBJECTIVE : To determine the concentration of glucosamine sulfate in human plasma , and to stu

27、dy the pharmacoki-netics of glucosamine sulfate. METHODS : The plasma concentration of glucosamine sulfate was determined by LC- MS/MS.The de-term in atio n was performed on Phe nomenex ODS colu mn with mobile phase con sisted of metha nol-0.跖 am mon ium acetate-0.饑 formic acid buffer(gradient eluti

28、on) at flow rate of 1.0mL min 1. Electrospray ionization (ESI ) was applied and operated in posi-tive ion mode by means of SRM. Its pharmacokinetic parameters were calculated by DAS 2. 0software. RESULTS Glucosamine sulfate was well-separated from in ternal sta ndard and plasma impurity. The lin ear

29、 ran ges of glucosami ne were 8. 27- 165ng mL 1and 165- 8268ng mL 1with recoveries of 103. 8%113. 7%. The RSD of in tra-day and in ter-day were all lower than 2%. The plasma concen trati on-time curves of glucosam ine sulfate fitted with the non- compartme nt model after sin gle oral dose of Compo u

30、nd glucosam ine sulfate dispersible tablets (500mg , 1000mg , 1500mg ) . The pharmacokinetic parameters were t 1/()、(1.3 . 2 40. 4)、( 1.4 9) h , t max (2. 6 4)、( 2. 7 9)、( 1.9 8) h , c max (41793)、( 79581)、( 925282) ng mL 1, AUC 0 10 (141601)、( 3366020)、( 4033282) ng h mL 1, MRT 0 10 (3. 2 7)、( 3. 6

31、 2)、( 3. 3 6) h , respectively. The main pharmacok in etic parameters of multiple oral-dose of Compo und glucosam ine sulfate dispersible tablets were as follows： c ss max (294 也5. 6) ng mL 1, c ss min (59. 4芳5. 7) ng mL 1, t max (1.9 1) h , t 1/ () h , AUC 010 (1015坐43) ng h mL 1, AUC ss (1000 44) ng h