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1、TNF a ,INF Y的診斷意義摘要:目的 為更好地為兒童急性再生障礙性貧血體 內(nèi)細(xì)胞因子濃度變化提供證據(jù)。方法 采再障組( 46 例)和 對(duì)照組( 48 例)靜脈血,用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定所取血樣標(biāo) 本中腫瘤壞死因子 -a (TNF- a )和干擾素 -Y (INF-Y )的 含量。并用獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)分析兩組外周血中細(xì)胞因子是否 存在顯著性差異。結(jié)果 再障組患兒外周血 TNF- a 和 INF- Y的含量均高于對(duì)照組兒童。結(jié)論通過對(duì)TNF- a和INF-Y 的監(jiān)測(cè),可以有效的了解再障患兒疾病進(jìn)展,治療效果和 預(yù)后情況。關(guān)鍵詞:再生障礙性貧血;腫瘤壞死因子 -a ;干擾素 -Y再生障礙性貧
2、血可分為急性再障和慢性再障兩型。其中 急性再生障礙性貧血發(fā)病急、進(jìn)展快,骨髓衰竭是其主要病 理過程, 常伴內(nèi)臟出血、 嚴(yán)重感染, 常危及生命, 預(yù)后不良。 但是現(xiàn)在大部分的病例被診斷為特發(fā)性免疫異常導(dǎo)致的再 生障礙性 1 。細(xì)胞因子失調(diào), 包括腫瘤壞死因子 (TNF- a ), 干擾素(INF- y ),今年來研究發(fā)現(xiàn)在再生障礙性貧血的發(fā)病 機(jī)制中起到了重要的作用 2 。兒童再生障礙性貧血已經(jīng)成為 繼兒童白血病之后,兒童死亡率較高的一種血液系統(tǒng)疾病3 。本研究為了給臨床上提供更好的關(guān)于兒童急性再障體內(nèi) 細(xì)胞因子濃度變化的證據(jù)?,F(xiàn)報(bào)告如下:1 資料與方法1.1 一般資料 2010年6月2013年
3、6月我院診治的46名急性再生障礙性貧血患兒。符合我國(guó)小兒再生障礙性貧血 的診斷及分型標(biāo)準(zhǔn) 4 ?;純壕鶠榧毙栽偕系K性貧血發(fā)作。 其中男 20 例,女 26 例,中位年齡 6.3( 2 1 4)歲。對(duì)照組 選擇同期到我院體檢中心體檢的正常兒童,共 48 例,男 21 例,女 27 例,中位年齡 7( 2 1 6)歲。兩組兒童的年齡比 較和性別比例上無顯著性差異,P 0.05。1.2 方法1.2.1 標(biāo)本收集 用肝素鈉抗凝管采集靜脈血 5ml 用于TNF- a測(cè)定。取用無肝素采集管采集靜脈血15ml用于INF-Y測(cè)定。1.2.2TNF- a含量的測(cè)定 以鼠源性的抗 TNF- a單抗以 每孔 40
4、0ng 的量, 在 PH 值為 9 的碳酸 -碳酸鈉緩沖液中包被 96孔板中,置4C環(huán)境過夜。取出后洗滌3次,加入預(yù)先備好的待測(cè)樣本及標(biāo)準(zhǔn)的TNF- a (制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用)。37C孵育2h。用洗滌液洗滌3次,加入羊抗鼠 TNF- a抗體,37C 孵育 2h 后,再洗滌 3 次,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗 羊IgG , 37C孵育2h后加入底物顯色。終止顯色后在自動(dòng)酶 標(biāo)儀上測(cè)定濃度,并以標(biāo)準(zhǔn)曲線為基準(zhǔn)求得TNF- a的含量。 以( xs) ng/ml 的形式表示結(jié)果。1.2.3INF- 丫含量測(cè)定 將上述采得的用于INF- 丫測(cè)定的 靜脈血在室溫凝固 30m in , 1000r /m in
5、離心15m in,收集血 清。檢測(cè)IFN- a用人IFN- a檢測(cè)Elisa試劑盒,操作步驟為 分別設(shè)空白孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步 操作相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品 準(zhǔn)確加樣50卩I,待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液 40卩I,然后 再加待測(cè)樣品10卩I (樣品最終稀釋度為 5倍)。將樣品加于 酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻。用封板膜 封板后置37 C溫育30min。將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水 20 倍稀釋后備用。小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加 滿洗滌液,靜置 30s 后棄去,如此重復(fù) 5 次,拍干。每孔加 入酶標(biāo)試劑50卩I,空白孔除外。再
6、用封板膜封板后置37C溫育 30min 。小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿 洗滌液,靜置 30s 后棄去,如此重復(fù) 5 次,拍干。每孔先加 入顯色劑A50卩I,再加入顯色劑B50卩I,輕輕震蕩混勻,37 C 避光顯色15min,每孔加終止液50卩I,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色 立轉(zhuǎn)黃色)。以空白孔調(diào)零, 450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸 光度( OD 值)。終止顯色后在自動(dòng)酶標(biāo)儀上測(cè)定濃度,并以 標(biāo)準(zhǔn)曲線為基準(zhǔn)求得 IFN- a 的含量。以( xs) ng/mI 的形 式表示結(jié)果。1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用 SPSS1 1 2 . 0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料采用均 x s 表示,結(jié)
7、果分析采用獨(dú)立樣 本的 t 檢驗(yàn),以 P 0.05 為差異有顯著性。2 結(jié)果2.1 TNF- a含量的對(duì)比結(jié)果 再障組患兒外周血中 TNF- a含量的平均值是:(56.51 土 20.02) ng/ml,而對(duì)照組的患 兒的平均值為( 25.88 10.11) ng/m l 。通過獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn) 分析,P=0.0080.05,差異具有顯著性。2.2 INF- 丫含量的對(duì)比結(jié)果 再障組患兒外周血中INF-Y含量的平均值是:(21.2 9.22) ng/ml,而對(duì)照組的患兒 的平均值為 (8.87 10.11) ng/ml 。通過獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)分析, P=0.0010.05。3 討論 近年來
8、,越來越多的證據(jù)表明,再生障礙性貧血發(fā)病與 免疫異常有關(guān)。已經(jīng)有不少學(xué)者從細(xì)胞因子水平方面研究再 生障礙性貧血 5 。到目前為止雖然再生障礙性貧血精確的發(fā) 病機(jī)制還沒有被完全的闡明, 但是大量證據(jù)表明 T 細(xì)胞介導(dǎo) 的免疫調(diào)節(jié)異常在再障的發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮了重要的作用。Th1 功能失調(diào)被認(rèn)為是再障發(fā)病的一個(gè)重要原因, Th1 功能 活躍導(dǎo)致TNF- a和INF- 丫過表達(dá)成為了再障炎癥改變的基 礎(chǔ)6。腫瘤壞死因子, 是單核 -巨噬細(xì)胞分泌的單核細(xì)胞刺激因 種形式TNF- a和TNF- B o由于TNF- 3又稱為淋巴毒素只限 于局限分泌,而 TNF- a則被廣泛分泌到外周血循環(huán)中。所 以在關(guān)于機(jī)體
9、免疫功能的研究中,一般都是檢測(cè) TNF- a 的 含量。研究表明,再障患者體內(nèi) TNF 的含量有明顯增加 7 最初的研究認(rèn)為, TNF 是造血祖細(xì)胞的負(fù)調(diào)節(jié)因子,能夠抑 制粒紅細(xì)胞集落形成單位、粒單細(xì)胞集落形成單位、紅系爆 式集落形成單位及紅系集落形成單位的形成 8 。但后期證 實(shí), TNF 對(duì)正常造血細(xì)胞具有雙向調(diào)節(jié)作用 9 。在正常情況 下,TNF- a濃度較低,適量的 TNF- a對(duì)機(jī)體有保護(hù)作用, 在疾病的病理改變下,TNF- a大量分泌,以致對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損 害作用。最近的研究證實(shí), TNF 升高是由于患兒存在自身免 疫功能缺陷,特別是組織免疫受到抑制,過量的 TNF- a 刺 激單核
10、-巨噬細(xì)胞從而分泌更多的結(jié)果。 是否還有其它因素影 響,尚待進(jìn)一步探討 10 。本研究的結(jié)果為再障兒童體內(nèi)外 周血 TNF- a 含量顯著高于正常兒童含量提供了臨床依據(jù)。子,在炎癥和免疫反應(yīng)中起著重要的作用人的 TNF 具有兩INF- 丫主要由輔助T (Th)細(xì)胞產(chǎn)生,INF- 丫是可調(diào)節(jié)Th 細(xì)胞極化的細(xì)胞因子 。在這種調(diào)節(jié)機(jī)制中, 細(xì)胞分泌的 INF- 丫發(fā)揮著十分重要的作用,能顯著地促進(jìn)Th1應(yīng)答,且抑制 Th2 應(yīng)答 11。國(guó)外已經(jīng)有學(xué)者研究表明再障患者外 周血中存在高水平的INF- 丫 12升高的機(jī)理可能是患兒血清 中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平明顯低于正?;純?,也可能是由于 患兒外周血 T
11、、B 淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)紊亂,機(jī)體的免疫功能發(fā)生障礙的原因。再障患兒 Th1 功能活躍,超過了機(jī)體正常的調(diào) 節(jié)功能,產(chǎn)生高水平的INF- 丫,進(jìn)而對(duì)造血又起抑制作用, 進(jìn)一步惡化再障。所以體內(nèi)的INF -丫含量可以有效的體現(xiàn)再 生障礙性患者疾病的嚴(yán)重程度。在我們這次研究中,也可以 看到急性再生障礙性貧血患兒外周血中的INF- 丫的含量與對(duì)照組患兒體內(nèi)INF- 丫的含量差異具有顯著性。 這里后期應(yīng) 該追加急性再障和慢性再障患兒體內(nèi)外周血INF- 丫含量比較的研究,以提供更完善的證據(jù)證明INF -丫的含量可以反映 再障疾病的嚴(yán)重程度。綜上所述, 在再生障礙貧血的發(fā)展過程中, 通過對(duì) TNF- a和INF
12、- Y三種細(xì)胞因子的監(jiān)測(cè), 可以有效地了解疾病的情 況、治療效果和疾病的預(yù)后,具有較重要的意義。本研究為 再障的新治療靶點(diǎn)提供有效的臨床依據(jù)。同時(shí),提示我們較 新的研究思路,有助于進(jìn)一步研究?jī)和偕系K性貧血。參考文獻(xiàn):1 Jianping Li , Qinjun Zhao , Wen Xing , et al.Terleukin-27 enhances the production of tumour necrosis actor-a and interferon-c by bone marrow T lymphocytes in aplastic anaemiaJ.British Jour
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