人類(lèi)免疫缺陷病毒Ⅰ型包膜糖蛋白gp41的基因重組表達(dá)解析

1、人類(lèi)免疫缺陷病毒I型包膜糖蛋白gp41的基因重組表達(dá)【摘要】目的 基因重組表達(dá)(HIV-1 gp41)抗原，并研制一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏性高、特異性強(qiáng)的國(guó)產(chǎn)HIV-1免疫檢測(cè)試劑。方法 選用HIV-1型BH10毒株的包膜糖蛋白gp41的部分基因(6977-7497),重組在PBV221表達(dá) 載體上。表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)15%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳初步分離純化，根據(jù)RF值，切下含特異蛋白的膠帶，以 Wester n blot法轉(zhuǎn)移在硝酸纖維素膜上；免疫 血清法檢測(cè)合格者制備的抗原檢測(cè)條帶，經(jīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)參比血清檢測(cè)。結(jié)果 獲得1株含HIV-1 gp41基因的重組質(zhì)粒，其蛋白的特異性表達(dá)為8%經(jīng)HIV-1陽(yáng)性

2、血清檢測(cè)和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)參比血清檢定，該表達(dá)蛋白靈敏性、特異性均為 100%結(jié)論(1)可以選用單一的gp41作為HIV-1感染初篩試劑的抗原。(2)表 達(dá)載體PBV221其表達(dá)的目的蛋白為非融合蛋白，作為試劑中的抗原，可降低檢 測(cè)中的非特異性。(3)該試劑是一種簡(jiǎn)便、特異、靈敏性高的試劑。【主題詞】HIV-1 基因重組 gp41 免疫檢測(cè)試劑Expressi on of recomb inant HIV-1 en velope glycoprote in gp41TENGZhip ing, LI Degui, GAO Lia nshe ng, et al. I nstitute of Virolog

3、y, Chi nese Academy of Preve ntive Medici ne, Beiji ng 100050【Abstract 】 ObjectiveTo con struct and express HIV-1 env gp41gene for devel oing a simple and rapid test for HIV-1 in fecti on.Methods HIV-1 env gp41 gene of BH10 strain (nt6 977-7 497) was con structed into express ing vector pBV221 and e

4、xpressed in E. Coli HB101. The expressed protei ns were purified on 15% SDS-PAGE, the specific protein gel was cut dow n, tran sferred on to n itrocellulose membra ne and sta ined with pon ceau for 10 minu tes. The membra ne was detected with positive and n egative serum respectively. The membra ne

5、was blocked with block ing buffer and cut into 2 mm of each strip and fixed into the well of thin plastic plate.Results We obta ined astra nd plasmid express ing HIV-1 env gene and the prote in.Con clusi onThe results showed that:(1)HIV-1 env gp41 prote in can be used to detect HIV-1 an tibody in se

6、rum of in dividual; (2)The expressed protein is a nonfusion protein and has high specificity and sen sitivity to HIV-1.【Key words 】 HIV-1Gene recomb in ati ongp41 Immunedetect ion reage nt人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）在感染后的24周，血清中出現(xiàn)HIV特異性抗體 ：1應(yīng)用免疫血清學(xué)方法，早期可檢出抗核心蛋白p24及其前體p55和gp41的抗體。隨后可發(fā)現(xiàn)抗包膜糖蛋白的 gp120/gp160 的抗體，但隨著病情的

7、進(jìn)展 p24抗體會(huì)逐漸下降，甚至消失。根據(jù)HIV感染后的血清學(xué)變化，我們選擇了gp41為HIV-1的診斷試劑抗原，對(duì)其基因進(jìn)行重組在PBV221溫控表達(dá)載體上，在大腸桿菌中表達(dá)。gp41位于HIV-1包膜糖蛋白的gp160的基因編碼區(qū)，第四開(kāi)放讀碼框架之 內(nèi)，共含350個(gè)氨基酸殘基，其前體為包膜糖蛋白的gp160,經(jīng)蛋白酶裂解成gp120和gp41,分別形成成熟病毒顆粒的表面棘突和跨膜部分。位于表面的部 分，可刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，本研究選用的gp41內(nèi)的抗原決定簇，位于BH10毒株基因7 345-7 423，編碼23個(gè)氨基酸殘基。PBH1（質(zhì)粒含有BH10的全基因，經(jīng)Bgl U和Hind川

8、核酸內(nèi)切酶消化，回收 的0.52 kb（6 977-7 497）基因片段重組在 PBV221表達(dá)載體上。PBV221表達(dá)載體全長(zhǎng)為 3.66 kb ，含有很強(qiáng)的啟動(dòng)和終止密碼及誘導(dǎo)表達(dá)基因，氨芐青霉素 為抗性選擇標(biāo)記基因，通過(guò) BamHI與目的基因上的Bgl U酶為同工酶）和 Hind川酶切位點(diǎn)插入了目的基因。1 材料和方法1.1 材料 含有 HIV-1 BH10 毒株全基因組質(zhì)粒為本室提供。基因表達(dá)載體PBV221由本所基因工程室贈(zèng)送。核酸內(nèi)切酶購(gòu)自華美生物技術(shù)公司。0.45卩m的硝酸纖維素膜購(gòu)于BioRAD公司。SPA辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物為本室標(biāo)記。底 物TME購(gòu)自Gen emed Bio

9、tech nologies 公司。HIV抗體陰性對(duì)照血清來(lái)自正常 人血清，用蛋白印跡及ELISA法檢測(cè)，HIV-1+2抗體均為陰性。HIV-1抗體陽(yáng)性 對(duì)照血清來(lái)自我國(guó)云南吸毒 HIV-1感染陽(yáng)性者血清，經(jīng)ELISA和Western blot 法檢測(cè)抗體為陽(yáng)性，56C30分鐘滅活，作為陽(yáng)性對(duì)照。國(guó)家 HIV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控參比 血清，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。1.2 方法51.2.1 HIV-1 gp41抗原基因的重組 將PBH1（毒株基因組DNA用核酸內(nèi)切酶 Bgl U消化酶切，0.8%低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收1.43 kb DNA片段（6 977-8 407），經(jīng)BamHI酶解PBV221質(zhì)粒載體，

10、S1核酸酶分別修平Bgl U粘性末端和 PBV221載體的BamH酶解的粘性末端，成為平頭。Hind川核酸內(nèi)切酶酶解上述 修平的片段的載體片段，低融點(diǎn)瓊脂糖回收 0.52 kb 片段，回收的 0.52 kb 基 因片段經(jīng)T4連接酶連接，重組在PBV221的載體上。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到致敏態(tài)的 HB101受體菌，LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜。1.2.2 重組質(zhì)粒的鑒定核苷酸順序分析挑選單菌落LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，小量質(zhì)粒提取，經(jīng)Hind川酶切，0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。提取純化重組的陽(yáng)性質(zhì)粒， ABI 核酸自動(dòng)測(cè)序分析儀進(jìn)行序列分析。1.2.3 重組質(zhì)粒 gp41 基因的表達(dá) 挑選經(jīng)測(cè)序分析重組正確的陽(yáng)性單

11、菌落， 接種于5 ml加氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，30E震蕩過(guò)夜，次日晨轉(zhuǎn)到50 mlLB 培養(yǎng)液中，30E搖菌測(cè)0D值（約為0.6），調(diào)溫到42C誘導(dǎo)4小時(shí)，使蛋白表 達(dá)，4 000 r/min 離心20分鐘，收集細(xì)菌，沉淀加 TG緩沖液（10 mmol Tris- HCl，10%甘油）100 C煮10分鐘，樣品于15%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，樣品一 式兩份，一份考馬斯亮藍(lán)染色表達(dá)分析蛋白產(chǎn)物，另一份分析抗原性。1.2.4 重組表達(dá) gp41 蛋白抗原性的檢測(cè) 按 Western blot 法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維 素膜上，麗春紅染色檢測(cè)轉(zhuǎn)移的蛋白，將載有抗原蛋白的硝酸纖維素膜4C封閉過(guò)夜（封閉液；

12、 0.01 mol/L PBS pH7.4 ， 0.2%Tween-20， 3%牛血清蛋白 ），以 不同稀釋度的 HIV-1 抗體陽(yáng)性血清免疫血清法檢測(cè)表達(dá)蛋白的抗原性。加陽(yáng)性 血清：37C, 30分鐘；PBS洗 10秒鐘X3次加HRF標(biāo)記的二抗；37C, 30分 鐘，PBS洗 10秒鐘X3次加入底物液：2滴底物緩沖液加入1滴底物液（H2Q+TMB觀察結(jié)果。1.2.5 檢測(cè)試劑條的制備（1）抗原的制備：取經(jīng)檢定陽(yáng)性的甘油保存菌種 1 支，接種到 5 ml 加氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，30C振蕩過(guò)夜。次日晨轉(zhuǎn)入50 mILB中,30 C振蕩約4 小時(shí)，測(cè)QD值在0.5，調(diào)溫到42C，繼續(xù)培養(yǎng)4小

13、時(shí)，誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)。4 000 r/min離心20分鐘，收集細(xì)菌。將沉淀按1 : 16的原體積加入30卩l(xiāng)TG buffer（10 mmol/L Tris-HCl, pH7.6, 10%甘油）充分混勻，加 30 卩 l 蛋白樣品buffer（3% 蔗糖， 2%SD，S 5%巰基乙醇， 20 mmol/L Tris-HCl,pH8.0, 溴酚藍(lán)）混 勻，煮沸 10分鐘，備電泳用。（2）15%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白：制備 SDS聚丙烯酰胺凝膠板30 cmx 20 cm，按每厘米1卩l(xiāng)加上述制備的樣品，15 mA電泳16小時(shí)。根據(jù)標(biāo) 準(zhǔn)蛋白分子量 marker 和 Rf 值及溴酚藍(lán)下緣長(zhǎng)度

14、計(jì)算 gp41 的位置，上下各寬 1 cm,切下特異的膠帶。按 Western blot法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，麗春紅染色3分鐘，檢測(cè)轉(zhuǎn)移蛋白效果。置于封閉液中，4C過(guò)夜。膜封閉后，自然干燥， 切割成 3 cmx 10 cm 的條帶。雙面膠將抗原條固定在反應(yīng)槽內(nèi)，每槽 1 條。（3）抗原條特異性和敏感性的檢測(cè)：按國(guó)家 HIV-1 標(biāo)準(zhǔn)，參比血清試劑盒操 作說(shuō)明，檢測(cè)制備的抗原條。2 結(jié)果2.1 Hind川內(nèi)切酶酶切鑒定的重組質(zhì)粒，經(jīng) 0.8%瓊脂糖凝膠電泳比較，獲得 了 4.1 kb 的重組質(zhì)粒 （1 ， 2）。2.2 重組質(zhì)粒經(jīng)373A型核苷酸序列測(cè)定儀測(cè)定（反向測(cè)序）核酸序列，分析 含有g(shù)

15、p41抗原決定簇的編碼23個(gè)氨基酸殘基的264-334核苷酸序列。GAT CAA CAG CTC CTA GGG ATT TGGAsp Gln Gln Leu Leu Gly Ile TrpGGT TGC TCT GGA AAC CTC ATT TGCGly Cys Ser Gly Lys Leu Ile CysACC ACT ACT GTG CCT TGG AACThr Ala Ala Val Pro Trp Asn1 重組質(zhì)粒的鑒定 (0.8%瓊脂糖凝膠電泳 )1.DNA/Hind 川 Marker; 2.PBV221; 3.重組質(zhì)粒(pBV221+0.52 kb); 4. 重組質(zhì)粒經(jīng)Hi

16、nd川酶切Fig.1 Confirmation of the recombinant plasmid(0.8% agarose gel electrophoresis)1:DNA/Hi nd 川 Marker. 2:Plasmid pBV221.3:Recombi nant plasmid(pBV221+0.52 kb). 4:recombinant plasmid digested by Hind2 HIV-1 gp41 pPBV221 重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.2 Construction of plasmid of HIV-1 gp41 gene and pBV221 vector2.3 H

17、B101受體菌內(nèi)，溫控誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白經(jīng) 15%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳純 化分離(4) 。考馬斯亮藍(lán)染色，可見(jiàn) 19 300 的蛋白，經(jīng)分光光密度掃描儀測(cè)定 顯示特異性的表達(dá)量為 8.6%。2.4 重組表達(dá)gp41蛋白抗原性的檢測(cè)結(jié)果 分別以陽(yáng)性血清和1 : 200、 1 : 20不同稀釋度的陽(yáng)性血清和1 : 1 000的免疫酶，應(yīng)用免疫血清法檢測(cè)，3， 3-二氨基聯(lián)苯胺顯色可見(jiàn)棕色的陽(yáng)性條帶，陰性對(duì)照則無(wú)其他的條帶 (5) ， 應(yīng)用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)參比血清檢測(cè)結(jié)果 (6) 可見(jiàn) 8 個(gè)陽(yáng)性， 8個(gè)陰性，與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果一 致。3 討論HIV感染人體后，出現(xiàn)p24、gp41、gp120等抗體，gp41抗體能

18、持續(xù)穩(wěn)定存 在，p24隨疾病的發(fā)生而下降。因此，HIV-1感染的檢測(cè)主要是HIV-gp41抗體 的檢測(cè)。隨著計(jì)算機(jī)在生物技術(shù)中的應(yīng)用，對(duì)于抗原蛋白表面活性親疏水性等 理化性質(zhì)及生物學(xué)功能作出綜合分析判斷，由此對(duì)抗原決定簇的定位作出理論 預(yù)測(cè)。因此，本文只選用 gp41 的單一抗原決定簇基因片段進(jìn)行重組表達(dá)，既可 獲得穩(wěn)定的反應(yīng)結(jié)構(gòu)域，又保留了原有的生物學(xué)活性。重組的目的基因與載體 之間有適宜的閱讀框架和穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，因此， 42 E溫降。因此，HIV-1感染的 檢測(cè)主要是 HIV-gp41 抗體的檢測(cè)。隨著計(jì)算機(jī)在生物技術(shù)中的應(yīng)用，對(duì)于抗原 蛋白表面活性親疏水性等理化性質(zhì)及生物學(xué)功能作出綜合分析

19、判斷，由此對(duì)抗 原決定簇的定位作出理論預(yù)測(cè)。因此，本文只選用 gp41 的單一抗原決定簇基因 片段進(jìn)行重組表達(dá)，既可獲得穩(wěn)定的反應(yīng)結(jié)構(gòu)域，又保留了原有的生物學(xué)活 性。重組的目的基因與載體之間有適宜的閱讀框架和穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，因此，42C溫3經(jīng)373A型儀器測(cè)定重組質(zhì)粒核苷酸序列Fig.3 Nucleotide sequence of recombinant plasmid415% SDS-PAG凝膠電泳分析重組表達(dá)蛋白1:蛋白分量標(biāo)記；2, 3:宿主菌；5, 6:重組表達(dá)樣品；4, 7: pBV221載體對(duì)照Fig.4 15%SDS-PAGE analysis of expressed recom

20、binant protein1:Protein molecular weight marker. 2,3:Host bacteria. 5,6:Expressedprotein sample. 4,7:Vector pBV221 control5 重組表達(dá)蛋白抗原性測(cè)定 HIV-1 陽(yáng)性血清1 : 20、1 : 200稀釋，1 : 1 000免疫酶血清學(xué)檢測(cè)（+為陽(yáng)性結(jié)果，-為陰性對(duì)照）Fig.5 Antigenicity detection of expressed protein HIV-1 positiveserum dilution 1:20、1 : 200, 1 : 1 000 se

21、rum dilution forimmunoenzyme assay (+:Positive results. -:Negative control)6 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)參比血清檢測(cè) HIV1、 2、 5、 7、 8、 10、 11、 12陽(yáng)性； 3、 7、 9、 12、 20、 24、 27、 28陰性 Fig.6 HIV detection with national standard reference serum1， 2， 5， 7， 8， 10， 11， 12: Positive. 3 ， 7， 9， 12， 20， 24， 27， 28:Negative本課題受?chē)?guó)家“八五” (編號(hào)： 85-916-03- 02) “九五”攻關(guān)項(xiàng)目資助 (編號(hào)： 96-906-03-16)作者單位： 100050 北京 中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所 (滕智平 曾 毅) ；科技服務(wù)公司 (李德貴 高連勝)參考文獻(xiàn) 1 Joller-Jemelka HI, Joller PW, Muller F, et al. Anti-HIV IgM antibody analysis during early manifestations of HIV infe