大腸桿菌基因組DNA的提取方式

1、大腸桿菌基因組 DNA 的提取方式一、傳統(tǒng)法提取大腸桿菌基因組 DNA 。1、實(shí)驗(yàn)原理提取 DNA 的一般過程是將分散好的組織細(xì)胞在含十二烷基硫酸鈉（ SDS） 和蛋白酶 K 的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯仿 /異戊醇抽提分離蛋白質(zhì)， 得到的 DNA 溶液經(jīng)乙醇沉淀使 DNA 從溶液中析出。SDS 的作用機(jī)理是由于其能結(jié)合蛋白，中和蛋白的電性，使蛋白質(zhì)的非共 價(jià)鍵受到破壞，失去二級結(jié)構(gòu)，從而變形失活，蛋白酶 K 或鏈霉蛋白酶 E 均為 光譜蛋白酶，其重要特性是能在 SDS 和 EDTA （乙二胺四乙酸二鈉）存在的情 況下保持很高的活性。在勻漿后提取 DNA 的反應(yīng)體系中， SDS 可通過失

2、活蛋 白破壞細(xì)胞膜、核膜，并使組織蛋白和 DNA 分離；而蛋白酶 K 可將蛋白質(zhì)降 解成小肽或氨基酸，使 DNA 分子完整地分離出來。用酚、酚 / 氯仿抽提除去蛋 白質(zhì)，最后用無水乙醇沉淀 DNA 。為獲得高純度 DNA ，操作過程中常加入 RNaseA 除去 RNA 。CTAB（十六烷基三乙基溴化銨）是一種去污劑，可溶解 細(xì)胞膜，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中（ 0.7mol/LNaCl ）是可溶的， 當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定的程度（ 0.3mol/LNaCl ）時(shí)，從溶液中沉淀，通過離 心就可將 CTAB- 核酸的復(fù)合物與蛋白，多糖物質(zhì)分開。最后通過乙醇或異丙醇 沉淀 DNA ，而 CT

3、AB 溶于乙醇或異丙醇而除去。2、實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 1）實(shí)驗(yàn)材料：大腸桿菌2）實(shí)驗(yàn)試劑：LB 液體培養(yǎng)基， TE溶液， 10%SDS ，蛋白酶 K，5mol/LNaCl ，CTAB/NaCl 溶液，酚 /氯仿 /異戊醇，異丙醇， 70%乙醇3）實(shí)驗(yàn)儀器：恒溫?fù)u床、低溫離心機(jī)、微量移液器、水浴鍋3、溶液配制1）LB 液體培養(yǎng)基：細(xì)菌培養(yǎng)用膠化蛋白胨 10g/L ，細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物 5g/L ，NaCl10g/L ，去離子水。（攪拌溶解后，用 5mol/LNaOH 調(diào) pH 至 7.0. 用去離子水定容 100ml ，用 20/50ml 搖瓶分裝 5 瓶，包扎好，在 121 ， 1.034 10

4、5高pa壓下蒸汽滅菌 20min.）2）TE 緩沖液：1MTris 溶液（取 Tris242.2g ，加 ddH 2O 至 1600ml ，加熱溶解）1Mtris-HClpH8.0 溶液（取 1MTris 溶液 160ml 用分析純鹽酸調(diào)至 Ph=8.0 （需濃鹽酸約 8.5ml ），加 ddH2O 定容至 200ml ，高壓滅菌備用）TE緩沖液（ 10mMTris-HCl1MmEDTApH=8.0，1MTris-HClBufferPH=8.05ml0.5MEDTAPH=8.01ml 向燒杯中加入約 400mlddH 2O 均勻混合 ;將溶液定 容到 500ml 后，高溫高壓滅菌，室溫保存）3

5、）蛋白酶 K：（ 20mg 蛋白酶 K 溶于 1ml 無菌雙蒸水， -20 備用）4）CTAB/NaCl 溶液：（ 5%w/v ，5gCTAB 溶于 100ml0.5MNaCl 溶液中，需 加熱到 65 使之溶解，然后室溫保存）4、實(shí)驗(yàn)方法步驟1、將大腸桿菌接種到滅菌好的 LB 培養(yǎng)基中，一級培養(yǎng)過夜，以 10% 的接種量 進(jìn)行二級培養(yǎng)，培養(yǎng)至對數(shù)期（ 4-6h ）。2、取菌液 1.5ml 置于離心管中，以 5000rpm 冷凍離心 1min ，棄上清液3、加 190ulTE 懸浮沉淀，并加 10ul10%SDS, 搖勻直至溶液變粘稠4、加入 1ul 蛋白酶 K（20mg/ml ），混勻， 3

6、7 保1溫小時(shí)。5、加 30ul5mol/LNaCl, 混勻。6、加 30ulCTAB/NaCl 溶液，混勻，65 保2溫0min7、加入 300ul 酚/ 氯仿/異戊醇抽提（ 25 ：24:1 ）， 5000rmp 離心 10min8、取上清液，加入 300ul 氯仿/異戊醇（ 24:1 ）抽提， 5000rmp 離心 10min9、取上清液，加入 300ul 的異丙醇，顛倒混勻，室溫下靜止 10min ，沉淀DNA ， 5000rmp 離心 10min10 、加 500ul70% 乙醇洗沉淀， 5000rmp 離心 10min11 、棄上清液，待酒精揮發(fā)盡后加 30ulTE 溶解12 、溶

7、解于 20ulTE 中，-20 保存。二、試劑盒法提取大腸桿菌基因組 DNA 。細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒：1、TGuide 細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒DP302-0250 次 420 元2、TaKaRa 細(xì)菌基因組 DNA 小量純化試劑盒TaKaRaDV810A50650 元3、Biomiga 細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒GD2411-01BacterialgDNAkit50 次 423 元GD2411-02BacterialgDNAkit250 次 1798 元4、Biospin 細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒BSC12S150 次 400 元BSC12M1100 次 750 元

8、5、OMEGA 細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒D3350-00E.Z.N.A.TMBacterialDNAkit5210 元D3350-01E.Z.N.A.TMBacterialDNAkit50980 元D3350-02E.Z.N.A.TMBacterialDNAkit2003350熒光定量 PCR 試驗(yàn)（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）定量實(shí)驗(yàn)是一種實(shí)時(shí)實(shí)驗(yàn)，用于在聚合酶鏈反應(yīng) （PCR）的每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)期間 測定靶核苷酸序列（靶）數(shù)量。其中靶可以是 DNA 、cDNA 或 RNA ?！緦?shí)驗(yàn)原理】在實(shí)時(shí)定量實(shí)驗(yàn)中，反應(yīng)是在 PCR 產(chǎn)物的擴(kuò)增達(dá)到固定熒光水平時(shí)的循環(huán) 期間時(shí)間點(diǎn)來描述的，而不是在固定循環(huán)次數(shù)后累積

9、的 PCR 產(chǎn)物最終數(shù)量來描述。擴(kuò)增曲線以圖形形式顯示在執(zhí)行的循環(huán)次數(shù)中檢測到的熒光。值）與閾值在 PCR 的最初幾次循環(huán)中，熒光信號沒有明顯變化。該預(yù)定義的 PCR 循 環(huán)范圍稱為基線。首先，軟件通過計(jì)算歸一化報(bào)告熒光信號強(qiáng)度（與基線循環(huán) 相對應(yīng)的 Rn 值）的數(shù)學(xué)趨勢，生成一個(gè)基線簡化擴(kuò)增曲線。然后，算法將搜 索擴(kuò)增曲線上基線校準(zhǔn)后歸一化報(bào)告熒光信號強(qiáng)度（ deltaRn?Rn 交叉的點(diǎn)。? Rn 值與閾值交叉的分?jǐn)?shù)循環(huán)定義為 CT。一、試驗(yàn)設(shè)計(jì)使用 StepOne 軟件中的 DesignWizard （設(shè)計(jì)導(dǎo)向）創(chuàng)建新實(shí)驗(yàn)1、定義實(shí)驗(yàn)屬性在 ExperimentProperties （實(shí)

10、驗(yàn)屬性）屏幕上，輸入實(shí)驗(yàn)的標(biāo)識信息， 然后選擇要設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)類型。1）ExperimentName （實(shí)驗(yàn)名稱）。2）Barcode （條碼），然后輸入您的 PCR 反應(yīng)板上的條碼。（可不填）3）UserName （用戶名）4）Comments （注釋）。（可不填）5）選擇 Quantitation （定量）實(shí)驗(yàn)類型6）Next （下一步）2、定義方法和材料在 Methods&Materials （方法和材料）屏幕上，選擇用于實(shí)驗(yàn)的定量方 法、試劑、升降溫速度和 PCR 模板。1）將 StandardCurve （標(biāo)準(zhǔn)曲線）選為定量方法。將 StandardCurve （標(biāo)準(zhǔn)曲線）選為定量方法。

11、標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)確定樣本 中靶序列的絕對量。從已知量的稀釋序列中構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線用于歸檔結(jié)果。當(dāng) 設(shè)置反應(yīng)板時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方法需要靶、標(biāo)準(zhǔn)品和樣本。用于標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)的 PCR 反應(yīng)包括以下組分：?樣本其中靶數(shù)量未知的樣本。?標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量已知的樣本。?標(biāo)準(zhǔn)品稀釋序列一組用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（例如， 1:2、1:4 、1:8、1:16 、1:32 ）。?重復(fù)數(shù)含有相同組分和量的相同反應(yīng)數(shù)。?陰性對照含有水或緩沖液的樣本，不含模板；也稱為“無模板對照（NTC） ”。陰性對照應(yīng)不會擴(kuò)增。2 ）為試劑選擇 TaqMan ? Reagents （ TaqMan 試劑）（包括兩個(gè)引物 一個(gè)探針）如果使用 T

12、aqMan 試劑以檢測擴(kuò)增并定量樣本中靶的數(shù)量，則選擇TaqMan ? Reagents （TaqMan 試劑）。 TaqMan 試劑包括兩個(gè)引物和 一個(gè)TaqMan? 探針。引物設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增靶。 TaqMan 探針設(shè)計(jì)用于雜交靶， 并在擴(kuò)增靶時(shí)產(chǎn)生熒光信號。切記！ AppliedBiosystems 不建議將 TAMRATM 染料隨 StepOneTM 系 統(tǒng)用作熒光報(bào)告基團(tuán)或淬火基團(tuán)。如果使用 SYBRGreen 試劑以檢測擴(kuò)增并定量樣本中靶的數(shù)量，則選擇 SYBR? GreenReagents （ SYBRGreen 試劑）。 SYBRGreen 試劑包 括兩個(gè)引物和 SYBRGreen

13、 染料。引物設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增靶。 SYBRGreen 染料可在 結(jié)合到雙鏈 DNA 時(shí)產(chǎn)生熒光信號。 SYBRGreen 染料通常是添加到反應(yīng)的 SYBRGreen 母液的一部分。如果使用 SYBRGreen 染料： 選擇 IncludeMeltCurve （包括解鏈曲線）以執(zhí)行擴(kuò)增靶的解鏈曲線分析。 將 Standard （標(biāo) 準(zhǔn)） 選 為 升降溫速度 。 AppliedBiosystems 不 提供 SYBRGreen 試劑的 Fast 母液。3）為升降溫速度選擇 Standard（2hourstocompletearun） （標(biāo)準(zhǔn)（約 兩小時(shí)完成運(yùn)行）如果為PCR反應(yīng)使用 Fast 試劑，則

14、選擇 Fast（40MinutestoCompleteaRun） （快速（約 40 分鐘完成運(yùn)行）。如果為PCR 反應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)試劑（包括 SYBRGreen 試劑和 TaqMan 試 劑），則選擇 Standard（2HourstoCompleteaRun） （標(biāo)準(zhǔn)（約 2 小時(shí)完成 運(yùn)行）。4）為模板類型選擇 gDNA（genomicDNA） （gDNA （基因組 DNA ）5）Next （下一步）。3、設(shè)置靶在 Targets （靶）屏幕上，輸入您想在 PCR 反應(yīng)板中定量的靶數(shù)量，然后 為每個(gè)靶設(shè)置檢測。1）單擊 Howmanytargetsdoyouwanttoquantifyinth

15、ereactionplate? （您想在反 應(yīng)板中定量多少靶？）字段，然后輸入 1 （根據(jù)需要填）。注意：靶檢測表中的行數(shù)將以您輸入的數(shù)字更新。2 ）選擇 SetUpStandards （設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品）復(fù)選框，以為靶檢測設(shè)置標(biāo)準(zhǔn) 品。建議反應(yīng)板中的每個(gè)靶檢測設(shè)置一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意： SetUpStandards （設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品）復(fù)選框默認(rèn)情況下已選取。3）設(shè)置靶 1 檢測：RNasePa. 單擊 EnterTargetName （輸入靶名稱）單元格，然后輸入 （示例） 。b. 從 Reporter （報(bào)告基團(tuán)）下拉菜單中，選擇 FAM （默認(rèn)）。如果要將 FAMTM 染料加在您用于檢測靶的 Taq

16、Man 探針的 5端，則選 擇 FAM 。如果要將 JOETM 染料加在您用于檢測靶的 TaqMan 探針的 5端，則選 擇 JOE 。如果要將 VIC? 染料加在您用于檢測靶的 TaqMan 探針的 5端，則選擇 VIC。如果您正使用 SYBR?Green 染料以檢測雙鏈 DNA ，則選擇 SYBR。c. 從 Quencher （淬火基團(tuán)）下拉菜單中，選擇 NFQ-MGB （默認(rèn)）。如果要將非熒光淬火基團(tuán)小溝結(jié)合物加在您正用于檢測靶的 TaqMan 探針的 3 端，則選擇NFQ-MGB 。如果您正使用 SYBRGreen 染料，則選擇 None （無）。4） Next （下一步）。4、設(shè)置標(biāo)

17、準(zhǔn)品在 Standards （標(biāo)準(zhǔn)品）屏幕上，為所有標(biāo)準(zhǔn)曲線輸入反應(yīng)板中的點(diǎn)數(shù)和 重復(fù)數(shù)。對于每條標(biāo)準(zhǔn)曲線，輸入起始量并選擇序列倍數(shù)。1 ）單擊 Howmanypointsdoyouneedforeachstandardcurve? （每條 標(biāo)準(zhǔn)曲線您需要多少個(gè)點(diǎn)？）字段，然后輸入 5 。建議每條標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)至少有五個(gè)稀釋點(diǎn)2 ）單擊 Howmanyreplicatesdoyouneedforeachpoint?（每個(gè)點(diǎn)您需要多少次重復(fù)反應(yīng)？）字段，然后輸入 3 。建議每個(gè)點(diǎn)三次重復(fù)反應(yīng)。3 ）為 RNaseP （示例）檢測定義標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量范圍：a.單擊 EnterStartingQuantity

18、 （輸入起始量）字段，然后輸入 10000 。 由于標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量的范圍會影響擴(kuò)增效率計(jì)算，因此應(yīng)仔細(xì)為您的檢測考慮 標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量的適當(dāng)范圍：為了更準(zhǔn)確地測量擴(kuò)增效率，請使用大范圍的標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量，擴(kuò)大到 5 個(gè)至 6 個(gè)對數(shù)級之間。如果您為標(biāo)準(zhǔn)品指定大范圍的數(shù)量，您需使用 PCR 產(chǎn)物或高 度濃縮的模板，如 cDNA 克隆。如果您的 cDNA 模板數(shù)量有限且 / 或靶是低拷貝數(shù)轉(zhuǎn)錄物，或已知在給定 范圍之內(nèi)，則可能需要小范圍的標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量。b. 從 SelectSerialFactor （選擇序列倍數(shù)）下列菜單中，選擇 1:2 。 序列倍數(shù)用于計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線所有點(diǎn)中的數(shù)量。如果您的起始數(shù)量是最高數(shù) 量，則

19、選擇如 1:2 、1:3 之類的稀釋倍數(shù)。如果您的起始數(shù)量是最低數(shù)量， 則選擇如 2X、 3X 之類的濃縮倍數(shù)。4 ）查看 StandardCurvePreview （標(biāo)準(zhǔn)品曲線預(yù)覽）窗格。標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)包 含如下點(diǎn)： 10000 、5000 、2500 、1250 和 625 。5 ）Next （下一步）。5、設(shè)置樣本在 Samples （樣本）屏幕上，輸入反應(yīng)板中要包括的樣本、重復(fù)數(shù)和陰性 對照數(shù)，然后選擇樣本 / 靶反應(yīng)以進(jìn)行設(shè)置。1）單擊 Howmanysamplesdoyouwanttotestinthereactionplate? （您想在反應(yīng)板中檢測多少樣本？）字段，然后輸入 2 。

20、（根據(jù)需要填）2 ）單擊 Howmanyreplicatesdoyouneed?（您需要多少次重復(fù)反應(yīng)？）字段，然后輸入 3 。建議對每個(gè)樣本反應(yīng)重復(fù)三次反應(yīng)。3）單擊Howmanynegativecontrolsdoyouneedforeachtargetassay? （每個(gè)靶檢 測您需要多少陰性對照？），然后輸入 3 。建議對每個(gè)靶檢測進(jìn)行三次陰性對照反應(yīng)。4）4.設(shè)置樣本 1：a. 單擊 EnterSampleName （輸入樣本名）字段，然后輸入 pop1 （用于 重復(fù)組 1 ）。b. 保留 Color （顏色）字段中的默認(rèn)設(shè)置。5）設(shè)置樣本 2：a. 單擊 EnterSampleNa

21、me （輸入樣本名）字段，然后輸入 pop2 （用于 重復(fù)組 2 ）。b. 保留 Color （顏色）字段中的默認(rèn)設(shè)置。6）選擇 AllSample/TargetReactions所有樣本 / 靶反應(yīng)）以檢測所有樣本中的所有靶。選擇 AllSample/TargetReactions （所有樣本 / 靶反應(yīng)）以檢測所有樣 本中的所有靶。選擇 SpecifySample/TargetReactions （指定樣本 / 靶反應(yīng)）以指定每 個(gè)樣本中要檢測的靶。7）在 WellCount （反應(yīng)孔數(shù)）窗格中，確認(rèn)存在：?6 個(gè)未知反應(yīng)孔 U?15 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)孔 S?3 個(gè)陰性對照反應(yīng)孔 N?24 個(gè)

22、空反應(yīng)孔8）在 ViewPlateLayout （查看檢測板布局）選項(xiàng)卡上：a. 從 ArrangePlateby （反應(yīng)板布局方式）下拉菜單中，選擇 Rows （按行）（默認(rèn)）。b. 從 PlaceNegativeControls （ 放 置 陰 性 對 照 ） 下 拉 菜 單 中 ， 選 擇 UpperLeft （左上角）（默認(rèn)）。9）Next （下一步）6、設(shè)置運(yùn)行方式在 RunMethod （運(yùn)行方法）屏幕上，查看默認(rèn)運(yùn)行方法的反應(yīng)體積和溫 度變化過程設(shè)置。若需要，您可調(diào)整默認(rèn)運(yùn)行方法或用 RunMethod （運(yùn)行方 法）庫中的某種方法進(jìn)行替換。1）單擊選 擇 GraphicalVi

23、ew （圖形 視圖 ）選項(xiàng)卡（默認(rèn)）或 TabularView （表格視圖）選項(xiàng)卡。2 ）單擊 ReactionVolumePerWell （每個(gè)反應(yīng)孔的反應(yīng)體積）字段，然 后輸入 25 L。為“反應(yīng)體積 /反應(yīng)孔”輸入介于 10 至 30 的值。 StepOne 系統(tǒng)支持 10 至30 L之間的反應(yīng)體積。3）確保溫度變化過程設(shè)置顯示保持和循環(huán)階段。確保溫度變化過程設(shè)置適合試劑。如果正執(zhí)行一步法 RT-PCR 擴(kuò)增，則包括一個(gè)反轉(zhuǎn)錄步驟。如果實(shí)驗(yàn)需要一個(gè)不同的溫度變化過程設(shè)置，調(diào)整溫度變化過程設(shè)置或用RunMethod （運(yùn)行方法）庫中的某個(gè)溫度變化過程設(shè)置進(jìn)行替 換。RunMethod （運(yùn)

24、行方法）庫包括在 StepOne 軟件中。4） Next （下一步）7、查看反應(yīng)設(shè)置在 ReactionSetup （反 應(yīng) 設(shè) 置 ） 屏幕 上 ，選 擇 檢 測 類 型（ 如 果使 用 TaqMan 試劑），然后查看為準(zhǔn)備 PCR 反應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)稀釋序列和樣本稀釋而計(jì)算 的劑量。若需要，您可調(diào)整反應(yīng)體積、額外反應(yīng)體積、組分濃度、標(biāo)準(zhǔn)品濃度 和/或稀釋后樣本濃度。切記！對反應(yīng)板中的每個(gè)靶檢測執(zhí)行這些步驟。完成 ReactionMixCalculations （反應(yīng)預(yù)混液計(jì)算）選項(xiàng)卡1 ）選擇 ReactionMixCalculations（反應(yīng)預(yù)混液計(jì)算）選項(xiàng)卡（默認(rèn)）。2 ）從 SelectT

25、arget （選擇靶）窗格中，選擇 RNaseP 。3 ） 從 AssayType （ 檢 測 類 型 ） 下 拉 菜 單 中 ， 選 擇 Inventoried/MadetoOrder （庫存/ 定制）。如果正使用 TaqMan 試劑，選擇所使用的檢測類型：如果正使用 AppliedBiosystemsTaqMan?GeneExpressionAssays 存/ 定制）或 AppliedBiosystemsCustomTaqMan?GeneExpressionAssays 則選擇 Inventoried/MadetoOrder（庫存 / 定制）。如果正使用 PrimerExpress?軟件設(shè)

26、計(jì)檢測，則選擇Custom（定制）。4 ）確認(rèn) ReactionVolumePerWell （每個(gè)反應(yīng)孔的反應(yīng)體積）字段中顯示25 L。為“反應(yīng)體積 /反應(yīng)孔”輸入介于 10 至 30 的值。 StepOne 系統(tǒng)支持 1030 L之間的反應(yīng)體積。5 ）確認(rèn) ExcessReactionVolume （額外反應(yīng)體積）字段中顯示 10% 。包括額外反應(yīng)體積以彌補(bǔ)移液過程中的損失。建議至少準(zhǔn)備 10% 的額外反 應(yīng)體積。6 ）在 ReactionsforRNaseP （RNaseP 反應(yīng)）窗格中：a.確認(rèn) MasterMixConcentration （母液濃度）字段中顯示 2.0 X。b. 確認(rèn)

27、 AssayMixConcentration （檢測預(yù)混液濃度）字段中顯示 20.0 X。c. 查看 PCR 反應(yīng)的組分和計(jì)算的劑量。7 ）在 StandardDilutionSeriesforRNaseP（ RNaseP 的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋序列）窗格中：a.單擊 StandardConcentrationinStock（儲液中標(biāo)準(zhǔn)品的濃度）字段，然后輸入 20000 。b. 單擊 units （單位）字段，然后輸入 copies per L 。c. 查看為準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品稀釋序列計(jì)算的劑量。完成 SampleDilutionCalculations （樣本稀釋計(jì)算）選項(xiàng)卡1）選擇 SampleDilut

28、ionCalculations（樣本稀釋計(jì)算）選項(xiàng)卡。2 ）單擊 DilutedSampleConcentration（10 XforReactionMix） （稀釋 后樣本濃度）（對于反應(yīng)預(yù)混液為 10X ），然后輸入 6.63）從單位下拉菜單中，選擇 ng/ L（默認(rèn)）。4）查看為樣本稀釋計(jì)算的劑量。8、實(shí)驗(yàn)材料訂購在 MaterialsList （材料列表）屏幕上，查看建議用于準(zhǔn)備 PCR 反應(yīng)板的 材料列表?；蛘?，您可從 AppliedBiosystemsStore （ AppliedBiosystems 產(chǎn) 品倉庫）訂購所建議的材料。創(chuàng)建購物籃，向購物列表中添加項(xiàng)目，然后登錄 以提交

29、您的訂單。您必須具有不受限制的網(wǎng)絡(luò)連接才能訪問 AppliedBiosystemsStore （ AppliedBiosystems 產(chǎn)品倉庫）。1）在 AppliedBiosystemsStore （ AppliedBiosystems 產(chǎn)品倉庫）網(wǎng)站 上查找靶檢測套件：a.確保您的計(jì)算機(jī)已連接到因特網(wǎng)。b.單擊 EnterGeneName （輸入基因名）字段，輸入 RNaseP ，然后單擊 FindAssay （查找檢測套件）。c. 在 FindAssayResults （發(fā)現(xiàn)檢測套件結(jié)果）對話框中，選擇您的檢測套 件。d. 單擊 ApplyAssaySelection （應(yīng)用檢測套件選擇

30、）。2 ）完成 ExperimentMaterialsList （實(shí)驗(yàn)材料列表）窗格：a. 從 Display （顯示）下拉菜單中，選擇 AllItems （所有項(xiàng)）（默認(rèn)），然 后查看建議的材料。若需要，使用右側(cè)的滾動(dòng)條查看所有項(xiàng)。檢測設(shè)計(jì)用于配合以3）用于進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)的 Inventoried/MadetoOrder下 TaqMan? 母液使用：TaqMan?FastUniversalPCRMasterMix(2 ? ),NoAmpErase?UNG ，250 次反應(yīng)，編號 4352042TaqMan?2 ? UniversalPCRMasterMix ，200 次反應(yīng)，編號 430443

31、7TaqMan?2 ? UniversalPCRMasterMix ，2000 次反應(yīng)，編號 432670810 包裝 TaqMan?2 ? UniversalPCRMasterMix ，編號 4305719TaqMan?2 ? UniversalPCRMasterMix,NoAmpErase?UNG20，0 次反應(yīng)，編號 4324018TaqMan?2 ? UniversalPCRMasterMix,NoAmpErase?UNG，2000 次反應(yīng)，編號 432661410 包裝 TaqMan?2 ? UniversalPCRMasterMix ， NoAmpErase?UNG ，編號 432

32、40204 )靶 DNA 或 cDNA 有幾種 TaqMan 和 SYBRGreen 試劑可用于定量實(shí)驗(yàn)。a. TaqMan? 試劑TaqMan?FastUniversalPCRMasterMix(2 ? ),NoAmpErase?UNG ， 250 次反應(yīng) 4352042TaqMan?2 ? UniversalPCRMasterMix ，200 次反應(yīng)，編號 4304437TaqMan?2 ? UniversalPCRMasterMix ，2000 次反應(yīng)，編號 432670810 包裝 TaqMan?2 ? UniversalPCRMasterMix ，編號 4305719TaqMan?2

33、 ? UniversalPCRMasterMix,No ， AmpErase?UNG ， 200 次反 應(yīng)，編號 4324018TaqMan?2 ? UniversalPCRMasterMix,NoAmpErase?UNG20，00 次反應(yīng)，編號 432661410 包裝 TaqMan?2 ? UniversalPCRMasterMix ， NoAmpErase?UNG ， 編號 4324020TaqMan?PCRCoreReagentsKit2，00 次反應(yīng)，編號 N808-0228b. SYBR?Green 試劑Power SYBR?GreenPCRMasterMix(1mL)4，0 次反

34、應(yīng)，編號 4368577Power SYBR?GreenPCRMasterMix(5 -mL) ，200 次反應(yīng)，編號 4367659Power SYBR?GreenPCRMasterMix(10-m5L) ， 2000 次 反 應(yīng) ， 編 號4368708Power SYBR?GreenPCRMasterMix(50mL)2，000 次反應(yīng)，編號 4367660SYBR?GreenPCRMasterMix(1 -mL) ，40 次反應(yīng)，編號 4344463SYBR?GreenP CRMasterMix(5-mL) ，200 次反應(yīng)，編號 4309155SYBR?GreenPCRMasterM

35、ix(50 -mL) ，2000 次反應(yīng)，編號 4334973SYBR?GreenPCRCoreReagents2，00 次反應(yīng)，編號 43048869 、完成設(shè)計(jì)向?qū)?要完成 DesignWizard （設(shè)計(jì)向?qū)В┕ぷ髁鞒蹋榭捶磻?yīng)板布局，然后選擇一 個(gè)退出選項(xiàng)。1）在 ReviewPlateforExperiment （查看實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)板）窗口中，查看反 應(yīng)板布局。2）單擊 SaveExperiment （保存實(shí)驗(yàn)）。3）在 SaveExperiment （保存實(shí)驗(yàn)）對話框中，單擊 Save （保存）以接 受默認(rèn)文件名和位置。示例實(shí)驗(yàn)被保存并關(guān)閉，并且您返回到 Home （主頁） 屏幕。二、

36、準(zhǔn)備反應(yīng)工作如何為標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 PCR 反應(yīng)。1、準(zhǔn)備樣本稀釋在將樣本添加到最終反應(yīng)預(yù)混液之前，執(zhí)行樣本稀釋。采用 StepOneTM 軟件計(jì)算的劑量稀釋樣本。（樣本稀釋計(jì)算）根據(jù)儲液中的樣品濃度？ngS/ tepoLn，e 軟件計(jì)算出稀釋劑量。因?yàn)樵赟tepOne 軟件中，樣本量僅限于反應(yīng)總量的 10% ，因此需要進(jìn)行樣本稀釋。 反應(yīng)總量為每次反應(yīng) 25 L，因此樣本量為每次反應(yīng) 2.5 L。根據(jù)“樣本稀釋計(jì) 算”表稀釋樣本。1）所需材料用于稀釋樣本的稀釋液（ TE 緩沖液或水）、樣本儲液微量離心管、移液槍、移液槍槍頭、試管振蕩器、離心機(jī)2）為每份擬稀 釋樣 本標(biāo)記一個(gè)單獨(dú)的微量 離心

37、管： Population1 、Population2 等3）將所需劑量的稀釋液添加到每個(gè)空反應(yīng)管內(nèi)。（ 14.2 L）4）將所需劑量的樣本儲液添加到每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)。（ 1 L ）5）振蕩每份稀釋的樣本 3 至 5 秒，然后短暫地離心反應(yīng)管。6）將稀釋后樣本置于冰上，直到準(zhǔn)備好反應(yīng)板。2 、準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品稀釋序列采用 StepOne 軟件計(jì)算的劑量準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品稀釋序列。（反應(yīng)預(yù)混液計(jì)算）根 據(jù)儲液中的標(biāo)準(zhǔn)品濃度？copiesS/ teponeL ，軟件計(jì)算出劑量。1）所需材料用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋液（ TE 緩沖液或水）、標(biāo)準(zhǔn)品儲液微量離心管、移液槍、移液槍槍頭、試管振蕩器、離心機(jī)2 ）為每份標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)記

38、一個(gè)單獨(dú)的微量離心管：Std.1 、 Std.2 、Std.3 、Std.4 、Std.5 。3）將所需劑量的稀釋液添加到每個(gè)空反應(yīng)管內(nèi)： Std.1 （14.5 L）、Std.2（9.1 L ）、Std.3 （9.1 L）、Std.4（9.1 L）、Std.5 （9.1 L）。4）在 Std.1 反應(yīng)管中準(zhǔn)備稀釋液 1 ：a. 振蕩儲液 3 至 5 秒，然后短暫地離心反應(yīng)管。b. 使用新的移液槍槍頭，將 3.6 儲L液添加到 Std.1 反應(yīng)管中c. 振蕩 Std.1 反應(yīng)管 3 至 5 秒，然后短暫地離心反應(yīng)管5）在 Std.2 反應(yīng)管中準(zhǔn)備稀釋液 2 ：a. 使用新的移液槍槍頭，將 9.

39、1 稀L釋液 1 添加到 Std.2 反應(yīng)管中。b. 振蕩 Std.2 反應(yīng)管 3 至 5 秒，然后短暫地離心反應(yīng)管。6）在 Std.3 反應(yīng)管中準(zhǔn)備稀釋液 3 ：a.使用新的移液槍槍頭，將 9.1 稀L釋液 2 添加到 Std.3 反應(yīng)管中。b. 振蕩 Std.3 反應(yīng)管 3 至 5 秒，然后短暫地離心反應(yīng)管。7）在 Std.4 反應(yīng)管中準(zhǔn)備稀釋液 4 ：a.使用新的移液槍槍頭，將 9.1 稀L釋液 3 添加到 Std.4 反應(yīng)管中。b.振蕩 Std.4 反應(yīng)管 3 至 5 秒，然后短暫地離心反應(yīng)管。8）在 Std.5 反應(yīng)管中準(zhǔn)備稀釋液 5 ：a. 使用新的移液槍槍頭，將 9.1 稀L釋液

40、 4 添加到 Std.5 反應(yīng)管中。b.振蕩 Std.5 反應(yīng)管 3 至 5 秒，然后短暫地離心反應(yīng)管。9）將標(biāo)準(zhǔn)品置于冰上，直到準(zhǔn)備好反應(yīng)板。3、準(zhǔn)備反應(yīng)預(yù)混液使用 StepOne 軟件計(jì)算的組分和劑量準(zhǔn)備反應(yīng)預(yù)混液。（反應(yīng)預(yù)混液計(jì) 算）若實(shí)驗(yàn)包括一個(gè)以上的靶檢測，則為每個(gè)靶檢測單獨(dú)準(zhǔn)備反應(yīng)預(yù)混液1）所需材料各反應(yīng)預(yù)混液組分微量離心管、移液槍、移液槍槍頭、離心機(jī)2）為反應(yīng)預(yù)混液標(biāo)記一個(gè)適當(dāng)大小的反應(yīng)管： ReactionMix 。3）將所需劑量的每種組分添加到反應(yīng)管中：母液（2.0X ）12.5 L、檢測母液（ 20.0X ） 1.3 L、8水.8 L，總劑量22.6 L，加上10%的超額量

41、 2.26 L， 共計(jì) 24.86 L2，4 次反應(yīng)所需劑量為 596.6 L注意：將檢測母液置于冰柜中避光儲存，直到準(zhǔn)備使用。過多暴露在光線 下會影響熒光探針。計(jì)算中包括額外劑量，以便為試劑轉(zhuǎn)移期間發(fā)生的損失提供多余劑量。建議至少準(zhǔn)備 10% 的超額量。4）用移液槍輕輕吸入并排出反應(yīng)預(yù)混液使其混合，然后蓋上反應(yīng)管蓋。5）短暫地離心反應(yīng)管以除去氣泡。6）將反應(yīng)預(yù)混液置于冰上，直到準(zhǔn)備好反應(yīng)板。注意：使用之前，請執(zhí)行以下操作：搖晃瓶子，徹底混合母液。振蕩反應(yīng)管以重新懸浮檢測母液，然后短暫地離心反應(yīng)管。將任何冷凍樣本置于冰上將其解凍。解凍時(shí)，進(jìn)行振蕩以重新懸浮樣本，然后短暫地離心反應(yīng)管4、準(zhǔn)備反應(yīng)

42、板為每個(gè)重復(fù)組準(zhǔn)備反應(yīng)物，然后將它們轉(zhuǎn)移到反應(yīng)板。采用 StepOne 軟件 中顯示的反應(yīng)板布局。1）所需材料反應(yīng)預(yù)混液 ReactionMix 、標(biāo)準(zhǔn)品、樣本、水MicroAmpTMFastOptical48-WellReactionPlateMicroAmpTMOptical48-WellAdhesiveFilm 微量離心管、移液槍、移液槍槍頭、離心機(jī)2）準(zhǔn)備靶陰性對照反應(yīng)預(yù)混液：a. 向一個(gè)適當(dāng)大小的反應(yīng)管中，加入下面所列劑量的反應(yīng)預(yù)混液和水反應(yīng)管反應(yīng)預(yù)混液反應(yīng)預(yù)混液劑量（ L ）水量（ L ）1Reactionmix74.68.3b. 用移液槍輕輕吸入并排出反應(yīng)預(yù)混液使其混合，然后蓋上

43、反應(yīng)管蓋。c. 短暫地離心反應(yīng)管以除去氣泡。d. 向反應(yīng)板的相應(yīng)反應(yīng)孔中分別加入 25 L的陰性對照反應(yīng)預(yù)混液。3）對于每個(gè)重復(fù)組，準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)預(yù)混液：a. 向適當(dāng)大小的反應(yīng)管中，加入下面所列劑量的反應(yīng)預(yù)混液和標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)預(yù)混液反應(yīng)預(yù)混液標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品劑管反應(yīng)預(yù)劑量 ( L)量( L)混液1Std1Reactionmix74.6Std18.32Std2Reactionmix74.6Std28.33Std3Reactionmix74.6Std38.34Std4Reactionmix74.6Std48.35Std5Reactionmix74.6Std58.3b. 用移液槍輕輕吸入并排出反應(yīng)

44、預(yù)混液使其混合，然后蓋上各反應(yīng)管蓋c. 短暫地離心各反應(yīng)管以除去氣泡。d. 向反應(yīng)板的相應(yīng)反應(yīng)孔中加入 25 L的標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)預(yù)混液。4) 對于每個(gè)重復(fù)組，準(zhǔn)備未知樣本的反應(yīng)預(yù)混液：a. 向適當(dāng)大小的反應(yīng)管中，加入下面所列劑量的反應(yīng)預(yù)混液和樣本。反應(yīng)管未知樣本反應(yīng)預(yù)混液反應(yīng)預(yù)混液反應(yīng)預(yù)混液劑量 ( L)樣本樣本劑量( L)1pop1Reactionmix74.6pop18.32Pop2Reactionmix74.6Pop28.3b. 用移液槍輕輕吸入并排出反應(yīng)預(yù)混液使其混合，然后蓋上各反應(yīng)管蓋。c. 短暫地離心各反應(yīng)管以除去氣泡。d. 向反應(yīng)板的相應(yīng)反應(yīng)孔中加入 25 L的未知（樣本）反應(yīng)預(yù)混液

45、。5）用孔板高透光度蓋膜密封反應(yīng)板。6）短暫地離心反應(yīng)板以除去氣泡。7）在您準(zhǔn)備好運(yùn)行實(shí)驗(yàn)之前，將反應(yīng)板置于陰暗處的冰上。注意：當(dāng)您準(zhǔn)備自己的標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)時(shí)：?確保您使用適當(dāng)?shù)暮牟摹? 確保 PCR 反應(yīng)的安排與 StepOne 軟件中顯示的反應(yīng)板布局一致。您可以：接受軟件自動(dòng)生成的反應(yīng)板布局?；蚴褂肁dvancedSetup （高級設(shè)置）工作流程更改軟件中的反應(yīng)板布局。三、運(yùn)行試驗(yàn)1 、準(zhǔn)備運(yùn)行打開實(shí)驗(yàn)并將密封的 MicroAmpTMFastOptical48-WellReactionPlate 裝載 到 StepOneTM 擴(kuò)增儀以準(zhǔn)備運(yùn)行。1）打開設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)a.打開 StepOneb.

46、從 Home 屏幕上，單擊 Openc. 在 Open 對話框中，導(dǎo)航到 experiments 文件夾（默認(rèn)）d. 找到創(chuàng)建的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，打開。2）裝載反應(yīng)板（帶無粉手套）a. 打開擴(kuò)增儀抽屜b.將反應(yīng)載體放置在樣本加熱塊中。反應(yīng)板的方向取決于您所用耗材的類型：? 若使用一個(gè)反應(yīng)板，讓 A1 反應(yīng)孔位于樣本加熱塊的左后角。 ?若使用反應(yīng)管條帶，則將條帶置于樣本加熱塊中。c. 小心地關(guān)閉擴(kuò)增儀抽屜。2、啟動(dòng)運(yùn)行若計(jì)算機(jī)已通過 StepOne 系統(tǒng)線纜直接連接到 StepOne 擴(kuò)增儀，則執(zhí)行 下列步驟。（并置啟動(dòng)）1）在 StepOne 軟件中，單擊 TemperaturePlot （溫度曲線）

47、。2）單擊 STARTRUN （啟動(dòng)運(yùn)行）。3、監(jiān)視運(yùn)行1）并置監(jiān)視運(yùn)行期間，定期查看 StepOne 軟件提供的所有三條曲線是否存在潛在問a.停止運(yùn)行在 StepOne 軟件中，單擊 STOPRUN （停止運(yùn)行）。對話框中包括：StopImmediately （立即停止）以立即停止運(yùn)行。StopafterCurrentCycle/Hold（當(dāng)前循環(huán) / 保持階段后停止）以在當(dāng)前循環(huán)或保持階段之后停止運(yùn)行。Cancel （取消）以繼續(xù)運(yùn)行。b. 實(shí)時(shí)查看擴(kuò)增數(shù)據(jù)(?Rn)AmplificationPlot （擴(kuò)增曲線）屏幕允許在 StepOne 擴(kuò)增儀運(yùn)行期間采 集熒光數(shù)據(jù)時(shí)查看樣本擴(kuò)增。若設(shè)

48、置了某種方法以采集實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)， AmplificationPlot （擴(kuò)增曲線）屏幕上會顯示在 ViewPlateLayout （查看反應(yīng) 板布局）選項(xiàng)卡中所選反應(yīng)孔的數(shù)據(jù)。擴(kuò)增曲線將對照歸一化染料熒光 循環(huán)數(shù)。AmplificationPlot （擴(kuò)增曲線）屏幕對識別和檢查異常擴(kuò)增十分有用。 異常擴(kuò)增可能包括以下情況：?陰性對照反應(yīng)孔中熒光增強(qiáng)。?預(yù)期循環(huán)中不存在可檢測熒光（在相同情況下使用相同試劑從先前類似 的實(shí)驗(yàn)運(yùn)行確定）。c. 實(shí)時(shí)查看運(yùn)行的溫度數(shù)據(jù)。運(yùn)行期間， TemperaturePlot （溫度曲線）屏幕上實(shí)時(shí)顯示樣本加熱塊、 受熱護(hù)蓋門和樣本（已計(jì)算）的溫度Temperature

49、Plot （溫度曲線）屏幕對識別硬件故障十分有用。當(dāng)監(jiān)視 TemperaturePlot （ 溫 度 曲 線 ） 屏 幕 時(shí) ， 觀 察 Sample （ 樣 本 ） HeatedCover （受熱護(hù)蓋門）和 SampleBlock （樣本加熱塊）曲線是否出現(xiàn) 異常情況。?通常，Sample （樣本）和 Block （樣本加熱塊）曲線應(yīng)大約相互對應(yīng)。 兩條曲線存在顯著偏差可能表示存在問題。?HeatedCover （受熱護(hù)蓋門）曲線應(yīng)保持方法中指定的常溫。偏離一致 溫度可能表示存在問題。d. 在 RunMethod （運(yùn)行方法）屏幕上查看運(yùn)行進(jìn)度開始運(yùn)行之后， StepOne 系統(tǒng)會在 Run

50、Method （運(yùn)行方法）屏幕上顯 示運(yùn)行進(jìn)度。例如對于方法的溫度變化過程報(bào)告運(yùn)行進(jìn)度。更改運(yùn)行方法（添加循環(huán)、保持或解鏈曲線）? 在導(dǎo)航窗格中，單擊 RunMethod （運(yùn)行方法）。?在 RunMethod （運(yùn)行方法）屏幕上，執(zhí)行以下任意操作輸入要應(yīng)用于 CyclingStage （循環(huán)階段）的循環(huán)數(shù)。若您想要將解鏈曲線階段添加到運(yùn)行的末尾，則選擇AddMeltCurveStagetoEnd （將解鏈曲線階段添加到末尾）。若您想要將保持階段添加到運(yùn)行的末尾，則選擇 AddHoldingStagetoEnd （將保持階段添加到末尾）。?單擊 SendtoInstrument （發(fā)送到擴(kuò)增儀

51、）e. 啟用/ 禁用通知設(shè)置。取或取消選取 EnableNotifications （啟用通知）復(fù)選框。2）遠(yuǎn)程監(jiān)視若將您的 StepOne 擴(kuò)增儀連接到網(wǎng)絡(luò)，您可使用 StepOne 軟件的遠(yuǎn)程監(jiān)視功 能從網(wǎng)絡(luò)上的任何一臺計(jì)算機(jī)上實(shí)時(shí)查看運(yùn)行進(jìn)度。4、卸載反應(yīng)板并傳輸數(shù)據(jù)當(dāng) StepOne 擴(kuò)增儀顯示 RunHistory （運(yùn)行歷史）屏幕時(shí)，從 StepOne 擴(kuò)增儀上卸載反應(yīng)板，并將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)傳輸?shù)接?jì)算機(jī)以進(jìn)行分析。當(dāng) StepOne 擴(kuò)增儀完成一次運(yùn)行時(shí)，系統(tǒng)會將運(yùn)行詳情保存到運(yùn)行歷史 記錄，在擴(kuò)增儀完成另一次運(yùn)行之前，該運(yùn)行歷史記錄會保留在系統(tǒng)中。1）當(dāng) StepOne 擴(kuò)增儀觸摸屏上

52、顯示 RunReport （運(yùn)行報(bào)告）屏幕時(shí)2）打開擴(kuò)增儀抽屜。3）從樣本加熱塊中取出反應(yīng)板。4）小心地關(guān)閉擴(kuò)增儀抽屜。切記！不要在運(yùn)行后關(guān)閉 StepOne 擴(kuò)增儀電源開關(guān)。不使用時(shí)，擴(kuò)增儀 會自動(dòng)進(jìn)入休眠模式。并置數(shù)據(jù)的傳輸是自動(dòng)傳輸。四、實(shí)驗(yàn)分析StepOneTM 軟件使用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量方法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。1、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)打開 StepOne ，從 Home 屏幕上，單擊 Open ，在對話框中，導(dǎo)航到 experiments 文件夾， 找到創(chuàng)建的試驗(yàn)設(shè)計(jì) ，打開實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)文件 ，單擊 Analyze （分析），軟件使用默認(rèn)分析設(shè)置來分析數(shù)據(jù)。1）軟件元素a. ExperimentMenu （實(shí)驗(yàn)

53、菜單）窗格提供到以下軟件屏幕的鏈接：?Setup （設(shè)置）屏幕?Run （運(yùn)行）屏幕?Analysis （分析）屏幕：AmplificationPlot （擴(kuò)增曲線）StandardCurve （標(biāo)準(zhǔn)曲線）MulticomponentPlot （多組分曲線）RawDataPlot （原始數(shù)據(jù)曲線）QCSummary （ QC 摘要）MultiplePlotsView （多曲線視圖）b.Plot （曲線）窗格為已打開的實(shí)驗(yàn)顯示所選分析屏幕。c. View （視圖）選項(xiàng)卡為已打開的實(shí)驗(yàn)顯示反應(yīng)板布局或反應(yīng)孔表d. Experiment （實(shí)驗(yàn)）選項(xiàng)卡為每個(gè)打開的實(shí)驗(yàn)顯示一個(gè)選項(xiàng)卡。2）如何選擇反應(yīng)

54、孔要在分析屏幕上顯示特定反應(yīng)孔，在 ViewPlateLayout （查看反應(yīng)板布 局）選項(xiàng)卡上選擇相應(yīng)的反應(yīng)孔，操作如下：a. 要選擇某特定類型的反應(yīng)孔，使用 SelectWellsWith （選擇反應(yīng)孔類型） 下拉菜單：選擇 Sample （樣本）、 Target （靶）或 Task （任務(wù)），然后選 擇樣本、靶或任務(wù)名稱。b. 要選擇單個(gè)反應(yīng)孔，在反應(yīng)板布局中單擊該反應(yīng)孔。c. 要選擇多個(gè)反應(yīng)孔，按住 CTRL 鍵并單擊、或按住 Shift 鍵并單擊反應(yīng) 板布局中的某反應(yīng)孔并拖移鼠標(biāo)覆蓋所需的反應(yīng)孔。d. 要選擇所有 48 個(gè)反應(yīng)孔，單擊反應(yīng)板布局的左上角。3）如何顯示多條曲線使用 Mu

55、ltiplePlots （多曲線）屏幕可同時(shí)顯示最多 4 條曲線。要在 MultiplePlots （多曲線）屏幕內(nèi)導(dǎo)航：a. 從 ExperimentMenu （實(shí)驗(yàn)菜單）窗格中，選擇 Analysis （分析）MultiplePlotsView （多曲線視圖）。b. 要顯示四條曲線，單擊 Showplotsina2 2matrix （以 2 2窗格方 式顯示曲線）。c. 要在兩行中顯示兩條曲線，單擊 Showplotsintworows （以兩行顯 示曲線）。d. 要在兩列中顯示兩條曲線，單擊 Showplotsintwocolumns（以兩列顯示曲線）。e. 要顯示某特定曲線，從每條曲線顯示上方的下拉菜單中選擇該曲線 2、查看標(biāo)準(zhǔn)曲線StandardCurve （標(biāo)準(zhǔn)曲線）屏幕顯示指定為標(biāo)準(zhǔn)品的樣本的標(biāo)準(zhǔn)曲線。StepOne 軟件根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算未知靶的數(shù)量。在 StandardCurve （標(biāo)準(zhǔn)曲 線）屏幕上檢查以下回歸系數(shù)值：?Slope （斜率）/ 擴(kuò)增效率斜率/ 擴(kuò)增效率值擴(kuò)增效率通過使用標(biāo)準(zhǔn)曲線中回歸線的斜率來計(jì)算。斜率接近- 3.3 表示最佳，即 100%PCR 擴(kuò)增效率。影響擴(kuò)增效率的因素包括：標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量范圍，為了獲得更準(zhǔn)確及更精確的效率測量值，使用大范圍 的標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量（ 5 至 6 個(gè)對數(shù)級（ 105 至 106 倍）。標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)數(shù)，為了獲