標(biāo)準(zhǔn)菌種管理規(guī)程完整

1、標(biāo)準(zhǔn)菌種管理規(guī)程目的：規(guī)藥品微生物學(xué)檢定用菌的管理，最大限度降低變異率，確保 菌種的溯源性與穩(wěn)定性，從而確保微生物學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。 職責(zé)：QC主管負(fù)責(zé)菌種的中購、接受、保存、分發(fā)，微生物檢驗(yàn)員負(fù) 責(zé)菌種的確認(rèn)、傳代、使用及銷毀。圍：木規(guī)程適用于檢定用菌種的管理，包括菌種的申購、保存、傳代、 使用及銷毀等。容：1術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)菌種是指由中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理 中心提供的冷凍干燥菌。傳代用菌種是指用標(biāo)準(zhǔn)菌種制備的采用特定保存方法長期固定保存 的菌種，用于傳代及制備工作用菌種。工作用菌種是指用標(biāo)準(zhǔn)菌種或傳代用菌種接種至普通瓊脂斜而培養(yǎng) 后，作為日常工作使用的菌種。菌種的代是指將

2、其接種至一新鮮培養(yǎng)基上或培養(yǎng)基，每萌發(fā)一次即稱 為一代，從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代。2.標(biāo)準(zhǔn)：2.1檢定菌的申購QC主管每年根據(jù)檢定菌種的使用情況（包括臨時(shí)檢驗(yàn)需要），提出購 買計(jì)劃，交由質(zhì)量管理部部長審批后，向中檢所菌種保藏中心或?。ㄊ校?藥檢所購買凍干菌種（標(biāo)準(zhǔn)菌種）；也可以直接向?。ㄊ校┧帣z所購頁腳 買傳代用菌種，購買時(shí)，需詢問與確定菌種的代數(shù)，以便傳代時(shí)控制 代數(shù)。2.2檢定菌的接收菌種到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，由QC主管接收菌種，檢查其名稱和數(shù)量，以及 每一支的完整性，同時(shí)將菌種的所有信息，填寫在檢定菌接收記錄（附表2）上，容包括：名稱、數(shù)量、編號（無編號者按檢定菌種的 編號原則編

3、號）、代數(shù)、來源、接收日期、接收人等，貼好標(biāo)簽并儲(chǔ)存 于2-8C直到需要使用時(shí)。儲(chǔ)存期最長不超過5年。2.3檢定菌的保存2.3.1工作用菌種的保存工作用菌種采用斜面低溫保存法。將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng) 基上，待菌生長充分以后，轉(zhuǎn)移至28C冰箱中保存。此法僅用于工 作用菌種的短期保存，并應(yīng)隨時(shí)檢查其污染朵菌和變異等情況，發(fā)現(xiàn) 異常情況，經(jīng)應(yīng)滅活處理后銷毀。保存時(shí)間根據(jù)菌種種類而不同，細(xì) 菌：1個(gè)月；酵母菌：2個(gè)月；霉菌及芽胞：3個(gè)月。2.3.2傳代用菌種的保存采用甘油冷凍管保藏法或液體石蠟保存法。2.3.2.1. 甘油冷凍管保存法用無菌接種環(huán)輕輕刮取經(jīng)冷凍復(fù)溶增菌后并接種至平板或瓊脂斜而

4、的菌苔，并通過接種環(huán)與試管壁之間的輕輕摩擦而使細(xì)菌充分?jǐn)U散到 預(yù)先裝入試管中的無菌純化水中，調(diào)整菌液濃度，使其等同于10號 比濁管，向已制備好的菌懸液中加入等體積的無菌甘油（濃度20%）,頁腳 即為10%甘油菌懸液，輕輕振搖，使容物充分混合，分裝于無菌小試 管，在-20C冷凍條件下保存。此甘油冷凍管為第2代（G2）,保存期 限為5年。使用時(shí)，取岀一支放至室溫，轉(zhuǎn)種增菌培養(yǎng)或接種至瓊脂 斜而復(fù)，挑取純菌落傳代或工作用。此種方法主要適用于需氧細(xì)菌和 酵母菌的保藏（如大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌）。 2.322.液體石蠟保存法2.3.2.2.1, 無菌液體石蠟的制備：選用優(yōu)質(zhì)化學(xué)純液

5、體石蠟，將液體 石蠟分裝加塞，用牛皮紙包好，在121C滅菌30分鐘，置40C恒溫箱 中蒸發(fā)水分，經(jīng)無菌檢查后備用。2.322.2. 液體石蠟管的制備：將菌種穿刺接種于半固體高層培養(yǎng)基 中，在適宜條件下培養(yǎng)結(jié)束后，在層流臺(tái)下用無菌吸管吸取上述無菌 液體石蠟至培養(yǎng)好的菌種管，并使石蠟高出菌種表而約lcm使菌體 與空氣隔絕，并將試管直立，置于-20C冷凍冰箱中保存。此法主要適 用于霉菌、厭氧菌、放線菌、芽泡桿菌的保存（如枯草芽抱桿菌、白 色念珠菌、黑曲霉菌等）。2.3.3.各菌種的保存方法、條件及期限，見傳代用菌種保存方法、 保存溫度、保存期限（附件1）。2.4. 檢定菌的傳代檢定菌菌種的傳代因凍干

6、菌（標(biāo)準(zhǔn)菌種）與傳代用菌種而不完全相同。2.4.1. 標(biāo)準(zhǔn)菌種的復(fù)、確認(rèn)、傳代2.4.1.1. 標(biāo)準(zhǔn)菌種的復(fù)2.4.1.1.1, 把凍干菌種管、滅菌毛細(xì)滴管（1ml）、雙碟、銀子、營養(yǎng)頁腳 肉湯培養(yǎng)基（或其它適宜培養(yǎng)基）數(shù)支，移入接種室或超凈工作臺(tái)。2.4.1.1.2, 將凍干菌種管外壁用碘酒擦洗消毒,稍干，用75%乙醇棉 擦凈，放在滅菌雙碟，待干。點(diǎn)燃酒精燈，將標(biāo)準(zhǔn)菌種管的封口一端 在火焰上，燒灼紅熱，用滅菌毛細(xì)滴管吸取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（或其它 適宜的培養(yǎng)基），滴在灼熱的菌種管封口一端，使驟冷而炸裂。241.1.3. 取滅菌銀子，在火焰旁，將炸裂的管口打開，放入滅菌雙 碟，另取1支滅菌毛細(xì)滴管

7、，在火焰旁吸取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（或其它 適宜的培養(yǎng)基）少許，加至菌種管底部，將凍干菌塊攪動(dòng)促使溶解, 隨即吸出管菌液，接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（或其它適宜的培養(yǎng)基）， 并根據(jù)不同菌種類型而將其培養(yǎng)于相宜的溫度下2472小時(shí)（細(xì)菌 需要2448的培養(yǎng)物，酵母菌需要72小時(shí)的培養(yǎng)物，形成泡子的 微生物則宜保藏泡子，放線菌和絲狀真菌則應(yīng)培養(yǎng)720天）。最后 將毛細(xì)滴管及菌種管經(jīng)高溫滅菌（121C, 45分鐘）。2.4.1.1.4. 取出培養(yǎng)物，仔細(xì)觀察液體培養(yǎng)基是否渾濁，渾濁說明菌 種復(fù)活生長，若不渾濁，在將其作為無活菌生長的培養(yǎng)物丟棄以前, 細(xì)菌應(yīng)至少培養(yǎng)1周以上，真菌和酵母菌至少應(yīng)培養(yǎng)2周以上，并在

8、丟棄之前應(yīng)高溫滅活處理（121C, 45分鐘）。2.4.1.2. 標(biāo)準(zhǔn)菌種的確認(rèn)2.4.1.2.1. 用無菌接種環(huán)取上述培養(yǎng)物接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（細(xì)菌） 或玫瑰紅鈉培養(yǎng)基（真菌和酵母菌）平板上，或相應(yīng)的宜于該菌生長 的鑒別培養(yǎng)基平板上，然后在3035C下培養(yǎng)3天（細(xì)菌）；2328C 下培養(yǎng)5天（真菌和酵母菌）。培養(yǎng)后，首先觀察其是否具有典型的頁腳 菌落形態(tài)，然后挑取生長旺盛的單一的純菌落，劃線于平皿培養(yǎng)基, 每種菌劃4個(gè)平皿，以便收集較多的生長旺盛的典型單菌落，進(jìn)行保 存和鑒定。鑒定時(shí)作革蘭氏染色、鏡檢，觀察其染色特性及形態(tài)特征。最后再做生化實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步鑒定該菌種。若在該平板上發(fā)現(xiàn)有其它菌

9、落生長，則說明操作有污染或菌種不純，應(yīng)將此被污染了的培養(yǎng)物滅 活處理，并尋找原因。應(yīng)根據(jù)其原因采取措施重新分離挑選純菌落。 24122.菌種的確認(rèn)結(jié)果，記錄在檢定菌種鑒定記錄上。2.4.1.23.各檢定菌種的復(fù)活、劃線用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件，見菌種 復(fù)活、劃線用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件（附件2）。2.4.1.3. 標(biāo)準(zhǔn)菌種的傳代2A1.3.1.按菌種說明書要求復(fù)溶菌粉，轉(zhuǎn)種于適宜的增菌培養(yǎng)基， 稱第1代（G1）,復(fù)壯后轉(zhuǎn)接至平板上，并在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí) 間，分離單個(gè)純種菌落，此為第2代（G2）。241.3.2. 菌種確認(rèn)后，挑取平板上純菌落制成濃菌懸液用于制備甘 油冷凍管，作為保存菌種（G2）,也稱傳

10、代用菌種，同時(shí)挑取純菌落 轉(zhuǎn)接斜而菌種數(shù)支，作為工作用菌種，此為第3代（W3）。2.4.1.33.將第2代（G2）菌種管冷凍保存，將工作用菌（W3）于適 當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后用于H常檢驗(yàn)。2.4.1.3.4. 取一支冷凍保存的第2代（G2）菌種轉(zhuǎn)種于平板和斜面培 養(yǎng)基上，平板上的菌種制成冷凍保存管第3代（G3）；斜面培養(yǎng)基的 菌種經(jīng)適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后用作工作用菌種，此仍為第3代 （W3）o頁腳 2.4.135.將第3代菌種（G3）冷凍或低溫保存，將生長、轉(zhuǎn)種后的 第2代（G2）菌種經(jīng)高溫滅活處理后丟棄。2.4.1.3.6.按上述規(guī)程操作，直至G4轉(zhuǎn)為W5為止，需重新開啟冷凍 干燥菌種，

11、重復(fù)上述規(guī)程操作，保存和使用菌種。2.4.13,7. 當(dāng)工作用菌種代數(shù)小于5時(shí)，在規(guī)定保存期限，可直接用 上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作用菌種。2.4.2. 傳代用菌種的傳代當(dāng)無標(biāo)準(zhǔn)用菌種時(shí)，可從省（市）藥檢所購買菌種作為傳代用菌種, 不需經(jīng)過復(fù)溶增菌，但應(yīng)劃線接種確認(rèn)。將購回?zé)o異常的傳代用菌種（一般為第3代），根據(jù)日常檢驗(yàn)工作的需要量，挑取純菌落轉(zhuǎn)接斜 而菌種數(shù)支，作為工作用菌種（為第4代），同時(shí)，結(jié)合菌種的代數(shù)和 最長保存期限，挑取純菌落制成濃菌懸液按“232.”的方法制備甘 油冷凍管或液體石蠟管數(shù)支，作為傳代用菌種（仍為第3代）。2.4.3. 工作用菌種的傳代當(dāng)工作用菌種代數(shù)小于5時(shí)，可

12、直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代 工作用菌種。取在冰箱28C保存的工作用菌種用普通瓊脂斜面?zhèn)?代，并將新傳代的培養(yǎng)物替代原有的菌種，作為工作用菌種。也可取 用“甘油冷凍管保藏法或液體石蠟覆蓋保藏法”保存的菌種，進(jìn)行復(fù)， 直接作為工作用菌種。細(xì)菌每1個(gè)月傳代一次；酵母菌每2個(gè)月傳代 一次；霉菌及芽胞每3個(gè)月傳代一次。當(dāng)超過5代，須用傳代用菌種 傳代。2.4.4. 傳代時(shí)注意無菌操作，使菌株不死亡，不污染、不丟失。同時(shí)頁腳 實(shí)驗(yàn)人員也要采取有效的預(yù)防措施進(jìn)行自我保護(hù)，如工作時(shí)必須穿工 作服，佩帶無菌手套，實(shí)驗(yàn)完成以后消毒實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的區(qū)域、實(shí)驗(yàn)儀器 和器具。如發(fā)生意外，如菌種泄漏或人員受傷，微生物學(xué)檢

13、驗(yàn)人員應(yīng) 立即向QC主管報(bào)告以便及時(shí)進(jìn)行處理。2.4.5. 傳代后，按檢定菌種的編號原則編號，并在每一支菌種管上貼 上標(biāo)簽，標(biāo)簽容包括：名稱、編號、代數(shù)、傳代日期、操作人、有效 期。交QC主管統(tǒng)一保管。同時(shí)及時(shí)填寫菌種傳代、分離記錄（附 表2）。2.5檢定菌種的編號采用字母加數(shù)字表示：英文縮寫字母一代次一傳代日期一順序號菌 種的英文縮寫字母：大腸埃希菌（E.C）、金黃色葡萄球菌（S.J）、枯草 芽泡桿菌（B.s）、白色念珠菌（C.a）、黑曲霉菌（A.n）、乙型副傷寒沙 門菌（S.p）代數(shù)用一位帶有下標(biāo)數(shù)字的字母表示：傳代用菌種用G表 示；工作用菌種用W表示；如G3表示傳代用菌種第3代；W3表示

14、 工作用菌種第3代。傳代日期用6位數(shù)字表示：年份取最后兩位數(shù), 月、日分別用兩位數(shù)。如2012年2月12日傳代的第一支大腸埃希菌 作為傳代用菌種的編號為：E.c-G3-120112-01o2.6檢定菌種的保管2.6.1. 檢定菌種設(shè)專人加雙鎖保管，并對所保存的菌種建立檢定菌 種保存、領(lǐng)用登記臺(tái)賬（附表3）。2.6.2. 檢定菌種的定期檢查與鑒定 在菌種的保存期間，應(yīng)每天檢查 保存菌種冰箱的溫度、菌種管的塞子是否松動(dòng)或生霉，并及時(shí)填寫檢頁腳 定菌種觀察記錄（附表4）,如有異常應(yīng)及時(shí)處理。菌種在保存期均 應(yīng)根據(jù)菌種的特性（工作用菌種每轉(zhuǎn)種兩代一次、傳代用菌種每三個(gè) 月一次）檢查其菌落性狀、革蘭染色

15、、顯微鏡下菌體形態(tài)及生化特性 等項(xiàng)目，若發(fā)現(xiàn)與原菌種變異較大，應(yīng)重新分離、純化、鑒定、再加 以保存，并做好檢定菌種鑒定記錄（附表5）。2.6.3. 所保管的菌種，不能隨意轉(zhuǎn)讓其他單位和個(gè)人，需要時(shí)應(yīng)有單 位證明和批準(zhǔn)手續(xù)方可供應(yīng)。2.7. 檢定菌種的領(lǐng)用與使用2.7.1. 微生物學(xué)檢驗(yàn)人員根據(jù)檢驗(yàn)需要，需到QC主管領(lǐng)取工作用菌 種或傳代用菌種，同時(shí)填寫檢定菌種領(lǐng)用登記臺(tái)賬相關(guān)容。2.7.2. 微生物學(xué)檢驗(yàn)人員從QC主管領(lǐng)取工作用菌種或傳代用菌種, 用于H常檢驗(yàn)或驗(yàn)證試驗(yàn)，使用后及時(shí)填寫檢定菌種使用登記臺(tái)賬（附表6）,以便追蹤菌種使用歷史。2.8. 檢定菌種（廢棄）的銷毀2.8.1. 下列情況的

16、菌種或培養(yǎng)物或被污染的器具等，必須采用121C. 45分鐘濕熱滅活處理：新一代菌種制備成功后的上一代菌種；使用完 后的菌種和帶有標(biāo)準(zhǔn)菌種的器具和培養(yǎng)物；超過有效期的菌種；凡被 污染、變異、可疑等異常情況菌種；其他應(yīng)廢棄的菌種。2.8.2. 廢棄菌種的銷毀由QC主辦提出申請，交QC主管批準(zhǔn)后，由 微生物學(xué)檢驗(yàn)員進(jìn)行滅活處理，并有其他人在場監(jiān)督，并填寫廢棄 菌種（物品）銷毀處理記錄（附表7）。3 .記錄歸檔頁腳 木標(biāo)準(zhǔn)涉及的記錄由質(zhì)量管理部保存，保存期5年。4.附則：本標(biāo)準(zhǔn)附件二份，附表六份：附件傳代用菌種保存方法、保存溫度、保存期限附件2：菌種復(fù)活、劃線用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件附表2：檢定菌接收記錄附

17、表2：檢定菌種傳代、分離記錄附表3：檢定菌種保存、領(lǐng)用登記臺(tái)賬附表4：檢定菌種觀察記錄附表5：檢定菌種鑒定記錄附表6：檢定菌種使用登記臺(tái)賬附表7：廢棄菌種（物品）銷毀處理記錄頁腳附件4傳代用菌種保存方法、保存溫度、保存期限菌種名稱保存方法保存溫度保存期限大腸埃希菌(CMCC(B)44 102)甘油冷凍管-20 C5年金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26 003)甘油冷凍管-20 C5年枯草芽抱桿菌(CMCC(B) 63 501)液體石蠟管-20 C5年白色念珠菌(CMCC(F) 98 001)液體石蠟管-20C5年黑曲霉菌(CMCC(F) 98 003液體石蠟管-20C5年乙型副傷寒沙門菌(CM

18、CC50094)甘油冷凍管-20 C5年附件2：菌種復(fù)活、劃線用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件菌種名稱復(fù)活培養(yǎng)基劃線用培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度培養(yǎng)時(shí)間大腸埃希菌TSB或營養(yǎng)肉 湯TSA或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿32C24h金黃色葡萄球菌枯草芽抱桿菌乙型副傷寒沙門菌白色念珠菌TSB或改良馬TSDA或玫瑰紅鈉培養(yǎng)基平皿24C48h黑曲霉7d頁腳附表4檢定菌接收記錄記錄名稱檢定菌種接收記錄代碼頁次1共1頁需稱及編號數(shù)量代數(shù)來源接收日期接收人檢查情況保存條件頁腳附表2：檢定菌種傳代.分離.保存記錄記錄名稱檢定菌種傳代.分離記錄代碼頁次1共1頁名稱及編號購進(jìn)（領(lǐng)?。┤掌谀?月曰來源傳代前菌種保存方法傳代用培養(yǎng)基傳代日期傳代用 菌種編號總數(shù)量傳代用菌種工作用菌種操作人數(shù)量編號有效期保存方法數(shù)量編號有效期保存方法分離與純 化過程純度檢查 結(jié)果操作人：復(fù)核人：頁腳附表3：檢定菌種使用登記臺(tái)賬記錄名稱檢定菌種保存、領(lǐng)用登記臺(tái)賬代碼頁次1共1頁收到日期名稱及編號數(shù)量接收人移交人領(lǐng)用日期用途數(shù)量發(fā)放人領(lǐng)用人頁腳附表4：檢定菌種觀察記錄記錄名稱檢定菌種觀察記錄代碼頁次1共2頁日期冰