激光共聚焦顯微鏡的原理和應(yīng)用講解

1、激光共聚焦顯微鏡的原理和應(yīng)用李楠王黎明楊軍關(guān)鍵詞 激光;顯微鏡;原理和作用中國圖書資料分類法分類號(hào)R 318. 51激光共聚焦顯微鏡是80年代發(fā)展起來的一項(xiàng)劃時(shí)代意義的高科技新產(chǎn)品， 它是在熒光顯微鏡成像基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置 ，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖象處理，使用 紫外或可見光激發(fā)熒光探針，從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖象，在亞細(xì) 胞水平上觀察諸如Ca 2+、pH值，,成為形態(tài)學(xué),學(xué),1994, 了目前世界次最高,功能最全的美國M eridian 公司的產(chǎn)品：A cas系列U lti m a型和掃描速度最快的In sigh t型兩臺(tái)激光共聚焦儀。儀器自1995年5月份到貨安裝以來，已為我院

2、7個(gè)科室的10個(gè)課題所應(yīng)用，目 前主要開展的研究內(nèi)容有：（1細(xì)胞內(nèi)游離鈣的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)；（2細(xì)胞通訊的研究；（3細(xì)胞 形態(tài)學(xué)的研究。1基本原理和功能1. 1基本原理 傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡使用的是場(chǎng)光源，標(biāo)本上每一點(diǎn)的圖象都會(huì)受到鄰近點(diǎn)的衍射光或散射光的干擾 ；激光 共聚焦顯微鏡利用激光束經(jīng)照明針孔形成點(diǎn)光源對(duì)標(biāo)本內(nèi)焦平面上的每一點(diǎn)掃描，標(biāo)本上的被照射點(diǎn)，在探測(cè)針孔處成像，由探測(cè)針孔后的光電倍增管(PM T或冷電耦器件(cCCD逐點(diǎn)或逐線接收，迅速在計(jì)算機(jī)監(jiān)視器屏幕上形成 熒光圖象。照明針孔與探測(cè)針孔相對(duì)于物鏡焦平面是共軛作者單位 解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)儀器中心，北京100853的，焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于照明

3、針孔和發(fā)射針孔，焦平面以外的點(diǎn)不會(huì)在探測(cè) 針孔處成像，這樣得到的共聚焦圖象是標(biāo)本的光學(xué)橫斷面，克服了普通顯微鏡圖象模 糊的缺點(diǎn)。在顯微鏡的載物臺(tái)上加一個(gè)微量步進(jìn)馬達(dá)，可使載物臺(tái)上下步進(jìn)移動(dòng)，最小步進(jìn) 距離為的0. 1 m ,能清楚地顯示,實(shí)現(xiàn)了的目的,這就是21. . CT功能 通過狹縫 掃描技術(shù)將我們對(duì)細(xì)胞的研究由多層迭加影像推進(jìn)到真正的平面影像水平，使圖像更加 清晰,從而為分子細(xì)胞生物學(xué)的深入研究拓寬了視野。1.2. 2三維成像與細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖像相結(jié)合的功能激光共聚焦顯微成像儀可以將斷層圖像與三維重建圖像有機(jī)的結(jié)合起來 ，不但能揭示細(xì)胞內(nèi)部的結(jié)構(gòu)和提 供細(xì)胞的長、寬、厚、斷層面積、細(xì)胞體積

4、等參數(shù) ，而且可以給人以三維立體的概 念。例如：可以使細(xì)胞旋轉(zhuǎn)起來從而能隨意觀察細(xì)胞各個(gè)側(cè)面的表面結(jié)構(gòu)。1.2. 3將形態(tài)學(xué)、生理學(xué)與分子細(xì)胞生物學(xué)的研究相互結(jié)合利用激光共聚集顯微成像儀不但可以觀察細(xì)胞形態(tài)的動(dòng)態(tài)變化 而且用適當(dāng)?shù)臒晒馓结樋梢杂^察細(xì)胞內(nèi)部的生物化學(xué)變化。如細(xì)胞內(nèi)游離Ca 2+、pH值及其它細(xì)胞內(nèi)離子的實(shí)時(shí)測(cè)定。熒光原位雜交的雜交點(diǎn)觀測(cè)和定量分析。1.3激光共聚焦顯微成像儀的細(xì)胞生物學(xué)功能1.3. 1粘附細(xì)胞分選技術(shù)U Iti m a型激光共聚焦顯微成像儀是目前世界上 唯一能對(duì)粘附細(xì)胞進(jìn)行分選的儀器，而這種不改變細(xì)胞周圍培養(yǎng)環(huán)境，細(xì)胞鋪展程度 和生長狀態(tài)的分選方式232? 軍醫(yī)進(jìn)

5、修學(xué)院學(xué)報(bào) 1996Sep t ; 17(3是至關(guān)重要的。1.3. 2細(xì)胞激光顯微外科及光陷井技術(shù) 該儀器可將激光當(dāng)作一把 光刀子 使用,完成諸如細(xì)胞膜瞬間穿孔，染色體切割，神經(jīng)元突起切除等一系列細(xì)胞外科手 術(shù),也可以作光陷井操作。1.3. 3熒光光漂白恢復(fù)技術(shù) 該技術(shù)用來測(cè)定活細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)系數(shù)。通過對(duì) 活細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)系數(shù)的測(cè)定，可對(duì)細(xì)胞骨架構(gòu)成、核膜結(jié)構(gòu)、大分子組裝和徑跨膜 大分子遷移率等領(lǐng)域進(jìn)一步研究。1.3. 4光活化技術(shù) 該技術(shù)通過籠鎖與解籠鎖測(cè)定，可以人為控制多種生物活 性產(chǎn)物和其它化合物在生物代謝中發(fā)揮功能的時(shí)間和空間。1.3. 5析,重要的意義1.3. 6胞間通訊的研究通過測(cè)量細(xì)

6、胞縫隙連接的分子轉(zhuǎn)移,研究相鄰細(xì)胞間的通訊。此項(xiàng)研究用于監(jiān)測(cè)環(huán)境毒素和藥物在細(xì)胞增殖和分化中所起的作用，腫瘤啟動(dòng)子和生長因子對(duì)縫隙連接介導(dǎo)的胞間通訊的作用，以及細(xì) 胞內(nèi)Ca,pH和CAM P對(duì)縫隙連接作用的影響2應(yīng)用2. 1細(xì)胞內(nèi)游離鈣測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣作為第二信使，對(duì)細(xì)胞生長分化起著重要作用，而目前用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi) 游離鈣的方法少之又少，激光共聚焦儀的誕生為人們提供了一有效工具。目前已應(yīng) 用的課題有：臨檢科 不同刺激物對(duì)血小板胞內(nèi)鈣的應(yīng)用”、內(nèi)分泌科 免疫球蛋白對(duì) 甲狀腺細(xì)胞內(nèi)鈣的作用”、眼科 糖性白內(nèi)障晶體上皮細(xì)胞內(nèi)鈣的變化”。其技術(shù)難 點(diǎn)及處理方法如下。2. 1. 1細(xì)胞的獲取 細(xì)胞內(nèi)游離鈣的測(cè)

7、定需要活的生長旺盛的細(xì)胞。其來源可從細(xì)胞株培養(yǎng)獲得，也可由動(dòng)物活體直接取 得。培養(yǎng)優(yōu)良的細(xì)胞,是一件非常辛苦又花費(fèi)精力的工作，但它可以確保每次都有足夠多的細(xì)胞 供實(shí)驗(yàn)使用；從動(dòng)物的活體上直接取細(xì)胞，需要實(shí)驗(yàn)人員高超的手術(shù)技巧，能準(zhǔn)確地 摘取標(biāo)本,并且盡量避免細(xì)胞的丟失和死亡。2. 1.2細(xì)胞的染色 根據(jù)各種細(xì)胞的特性和活性,確保每次染色成功，是技術(shù)性很強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，需要一段摸索的時(shí)間。首 先確定加多大濃度的鈣敏熒光染料 FLUO 23 AM,在CO 2培養(yǎng)箱中孵育多長時(shí)間, 是否需要加去污劑F 2127助溶？這些在幾次試驗(yàn)以后才能夠確定。2. 1.3藥物對(duì)細(xì)胞內(nèi)游離鈣的影響 實(shí)驗(yàn)設(shè),滲透壓是否

8、合適，是否會(huì)引起細(xì) 胞內(nèi)鈣的變化。藥物對(duì)細(xì)胞內(nèi)游離鈣的作用是瞬間上升下降 ，還是鈣的振動(dòng)。要對(duì) 出現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象作出解釋。2. 1.4細(xì)胞的粘附 如果培養(yǎng)的是粘附細(xì)胞，那么它們會(huì)較為牢固地粘附在培 養(yǎng)皿上或載玻片上，可是懸浮的細(xì)胞如血小板，紅細(xì)胞很難貼壁。為了解決這個(gè)問題 必須對(duì)載玻片進(jìn)行處理。處理主要方法為使用多聚賴氨酸 ，蛋清,聚乙烯醇等作粘貼 劑。實(shí)驗(yàn)者必須根據(jù)細(xì)胞特性來選取不同的處理方法。 2. 2細(xì)胞通訊近年來細(xì)胞通訊是分子細(xì)胞生物學(xué)的研究熱門。但是對(duì)于細(xì)胞縫隙間細(xì)胞通訊 的研究，由于缺少檢測(cè)手段，一直阻礙人們?nèi)ド钊胩剿鳌Ｗ约す夤簿劢癸@微鏡誕生以 來,尤其是M eridian公司的A

9、cas系列的推出,為研究細(xì)胞通訊提供了新的手段。 目前已完成的課科題有：腎小球成纖維細(xì)胞胞間通訊影響的研究”。實(shí)驗(yàn)方法為：首先觀察原細(xì)胞的通訊情況，測(cè)定其恢復(fù)速率，然后在不同藥物作 用下,監(jiān)測(cè)其通訊情況，對(duì)恢復(fù)速率做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，推斷藥物對(duì)細(xì)胞通訊的作用。其 技術(shù)難點(diǎn)及處理方法為：332? 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào) 1996Sep t ; 17(32. 2. 1確定原細(xì)胞通訊情況并非所有的細(xì)胞都有這種縫隙連接的通訊，例如:淋巴細(xì)胞，部分癌細(xì)胞就沒有這種通訊，因此，必須預(yù)先對(duì)原細(xì)胞作用出判斷。2. 2. 2細(xì)胞通訊測(cè)定結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理由于細(xì)胞處于不同的生長期，即使同一細(xì)胞系，其恢復(fù)速率也不完全一致。這就必

10、須取得盡可能多的標(biāo)本數(shù)據(jù)來進(jìn)行統(tǒng) 計(jì)。2. 2. 3觀察細(xì)胞的選擇在一個(gè)視野里有若干個(gè)細(xì)胞。作為數(shù)據(jù)采集對(duì)象必須選擇3組細(xì)胞為觀察目標(biāo):(1對(duì)照組:選孤立的單個(gè)細(xì)胞12個(gè),由于此類細(xì)胞與 其它細(xì)胞不相連接，因而就不會(huì)有細(xì)胞通訊的機(jī)能，適合用作對(duì)照；(2觀察組:選相互緊密相連的細(xì)胞56個(gè),這種細(xì)胞間存在通訊，可作為測(cè)試對(duì)象；(3正組:,光去淬滅,光照射下,為消除2. 3細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究細(xì)胞形態(tài)測(cè)量是激光共聚焦顯微鏡最廣泛的用途之一, 這些測(cè)試的技術(shù)難點(diǎn)在于如何選擇熒光探針標(biāo)記，如何獲取樣品，樣品的處理方法及 染色方法。如：腎小管上皮細(xì)胞對(duì)成纖維細(xì)胞表達(dá)的粘附因子的影響” 3工作設(shè)想總結(jié)Confoc

11、al在我院的應(yīng)用情況,考慮今后我們的工作重點(diǎn)主要有3個(gè)方面。3. 1積極與臨床各科研配合，做好技術(shù)保 障工作。3. 2加強(qiáng)儀器功能的開發(fā)和方法學(xué)的研究。 UL T I M A型是功能很強(qiáng)大,技 術(shù)很復(fù)雜的科研儀器，目前我們只開發(fā)出很小一部分功能，今后將在這方面組織人力 物力進(jìn)行研究和探索。例如，在細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面的研究和分子細(xì)胞生物。3.是精密，。目前工作難（包括細(xì)胞培養(yǎng)，染色等達(dá)不到儀器所要求的技術(shù)水 平。激光共聚焦顯微鏡作為我院投資最大的科研儀器之一，為我院科研水平的提高， 提供了嶄新的，強(qiáng)有力的技術(shù)手段。我們將和各科同志共同努力，使其在 九五”期間 發(fā)揮更大的作用。(1996-01-30

12、收稿，1996-02-13 修回（上接226頁服20余劑,諸癥漸消。不意月經(jīng)來潮，量中色黯，夾有黑色血塊，歷 時(shí)4d而凈,乳脹、小腹墜脹也隨之消失。停用降壓藥，血壓亦能穩(wěn)定在正常范圍。 陰火既降，遂改予益腎健脾,調(diào)暢氣血治療。隨訪3月，月事如常。2討論 夫陰陽之機(jī)，清者屬陽,濁者屬陰。清陽貴升,濁陰宜降。清陽不升則濁陰不降，中氣下陷則陰火上乘，即所謂 陰火乘其土 位”清濁相干，則諸癥叢生而變化萬端。眾所周知，補(bǔ)中益氣湯乃東垣所創(chuàng)之名方, 具補(bǔ)中益氣，升陽舉陷,升清降濁之功效，用之臨床奧妙無窮。對(duì)該患者應(yīng)用此方乃 病情所需，月事久閉而不治自通實(shí)屬意外。然仔細(xì)斟酌，亦自有其內(nèi)在之理。經(jīng)曰沖為血海,任主胞胎”又云 任脈通,太沖脈盛，月事以時(shí)下”正常的月事 和胎孕有賴于沖、任二脈的充盛與暢通。如任脈不通，太沖脈衰,則月事為之變，經(jīng)閉而無子。該患者年屆六七有余，太沖漸衰；中氣下陷，清陽不升，陷于胞宮；心情不 舒,氣血不暢,氣滯血瘀