三代遺傳標(biāo)記

1、分子標(biāo)記是繼形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記之后發(fā)展起來的一種較為理想的遺傳標(biāo)記形式，它以蛋白質(zhì)、核酸分子的突變?yōu)榛A(chǔ)，檢測生物遺傳結(jié)構(gòu)與其變異。分子標(biāo)記技術(shù)從本質(zhì)上講，都是以檢測生物個體在基因或基因型上所產(chǎn)生的變異來反映生物個體之間的差異。每一種分子標(biāo)記都有其自身的特點和特定的應(yīng)用范圍，但就一般意義而言，DNA分子標(biāo)記與形態(tài)標(biāo)記和生化標(biāo)記等相比，具有許多獨特的優(yōu)點：不受組織類別、發(fā)育階段等影響。植株的任何組織在任何發(fā)育時期均可用于分析。不受 環(huán)境影響。因為環(huán)境只影響(轉(zhuǎn)錄與翻譯)，而不改變即DNA的核苷酸序列。標(biāo)記數(shù)量多，遍及整個 基因組。多態(tài)性高，自然存在許多等位變異。有許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性，

2、能夠鑒別純合基因型和雜合基因型，提供完整的遺傳信息。DNA分子標(biāo)記技術(shù)簡單、 快速、易于自動化。提取的DNA樣品，在適宜條件下可長期保存，這對于進行追溯性或仲裁性鑒定非常有利。因此，DNA分子標(biāo)記可以彌補和克服在形態(tài)學(xué)鑒定及同工酶、蛋白電泳鑒定中的許多缺陷和難題，因而在品種鑒定方面展示了廣闊的應(yīng)用前景。1. 1第1代分子標(biāo)記.1 RFLP標(biāo)記技術(shù)。1980 年Botesin 提出的限制性片段長度多態(tài)性(Restriction fragment lengthpolymorphisms ,RFLP)可以作為遺傳標(biāo)記，開創(chuàng)了直接應(yīng)用 DNA多態(tài)性的新階段，是最早應(yīng)用的分子標(biāo)記技術(shù)。RFLP是檢測DN

3、A 在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小，反映DNA分子上不同的分布情況，因此DNA序列上的微小變化，甚至1個核苷酸的變化也能引起限制性內(nèi)切 酶切點的丟失或產(chǎn)生，導(dǎo)致酶切片段長度的變化。優(yōu)點：RFLP標(biāo)記的具有共顯性的特點，結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，特別適應(yīng)于構(gòu)建遺傳連鎖圖。缺點：在進行RFLP分析時,需要該位點的DNA片段做探針用放射性同位素及核酸雜交技術(shù) ，既不安全又不易自動化。另外,RFLP對DNA多態(tài)性檢出的靈敏度不高,RFLP連鎖圖上還有很多大的空 間區(qū)。.2 RAPD 標(biāo)記技術(shù)。為了克服RFLP技術(shù)上的缺點Williams等于1990年建立了隨機擴增多態(tài) DNARando

4、mamplified polymorphic DNA ,RAPD）技術(shù)，由于其獨特的檢測 DNA 多態(tài)性的方式使得RAPD技術(shù)很快滲透于基因研究的各個領(lǐng)域。RAPD是建立于PCR基礎(chǔ)之上的分子標(biāo)記技術(shù)，基本原理是利用一個隨機引物 （810個堿基）通過PCR反應(yīng)非定點地擴增 DNA 片段，然后用凝膠電泳 分離擴增片段來進行 DNA多態(tài)性研究。對任一特定引物而言，它在基因組DNA序列上有其特定的 結(jié)合位點，一旦基因組在這些區(qū)域發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變 ，就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點的分布發(fā)生變化，從而導(dǎo)致擴增產(chǎn)物的數(shù)量和大小發(fā)生改變，表現(xiàn)出多態(tài)性。優(yōu)點：與RFLP相比,RAPD技術(shù)簡單，檢

5、測速度快，DNA用量少，實驗設(shè)備簡單，不需DNA 探針, 設(shè)計引物也不需要預(yù)先克隆標(biāo)記或進行序列分析，不依賴于種屬特異性和基因組的結(jié)構(gòu)，合成一套引物可以用于不同生物基因組分析，用一個引物就可擴增出許多片段，而且不需要同位素，安全性好。缺點：當(dāng)然,RAPD技術(shù)受許多因素影響，實驗的穩(wěn)定性和重復(fù)性差，首先是顯性遺傳，不能識別雜合 子位點，這使得遺傳分析相對復(fù)雜，在基因定位、作連鎖遺傳圖時，會因顯性遮蓋作用而使計算位點間遺傳距離的準(zhǔn)確性屬特異性和基因組的結(jié)構(gòu)，合成一套引物可以用于不同生物基因組分析，用一個引物就可擴增出許多片段，而且不需要同位素，安全性好。當(dāng)然,RAPD技術(shù)受許多因素影響，實驗的穩(wěn)定

6、性和重 復(fù)性差，首先是顯性遺傳，不能識別雜合子位點，這使得遺傳分析相對復(fù)雜，在基因定位、作連鎖遺傳圖;其次,RAPD對反應(yīng)條件相當(dāng)敏感，包括時,會因顯性遮蓋作用而使計算位點間遺傳距離的準(zhǔn)確性下降 模板濃度、Mg2 +濃度,所以實驗的重復(fù)性差1.1.3 AFLP標(biāo)記技術(shù)擴增片段長度多態(tài)技術(shù)(AFLP),又名限制片段選擇擴增技術(shù)(Selective restriction fragmentamplifi2cation ,SRFA), 于 1993 年由荷蘭 KEYGENE 公司的 Zabean 和 Vos 等發(fā)明 并已。AFLP 是近年來迅速發(fā)展起來的一種分子標(biāo)記技術(shù)，它將基因組DNA用成對的限制

7、性內(nèi)切酶雙酶切后產(chǎn)生的片段用接頭(與互補)連接起來，并通過5 端與接頭互補的半特異性引物擴增得到大量DNA片段，從而形成指紋圖譜的分子標(biāo)記技術(shù)。AFLP指紋呈式共顯性和顯隱性遺傳。優(yōu)點：它兼具RAPD與RFLP的優(yōu)點，有較高的穩(wěn)定性，用少量的選擇性引物能在較短時間內(nèi)檢測 到大量位點，并且每對引物所檢測到的多個位點都或多或少地在多條染色體上，各染色體上AFLP標(biāo)記的數(shù)目與染色體長度呈正相關(guān)(r = 0. 501),而一對引物獲得的標(biāo)記涉及的染色體數(shù)與標(biāo)記數(shù)呈正相關(guān)(r = 0. 826)。因此，通過少量效率高的引物組合，可獲得覆蓋整個基因組的AFLP標(biāo)記。目前,AFLP作為一種高效的指紋技術(shù)，已

8、在遺傳育種研究中發(fā)揮它的優(yōu)勢。缺點：不過也有研究認(rèn)為,AFLP對基因組純度和反應(yīng)條件要求較高，另外用于遺傳作圖時，少數(shù)的 標(biāo)記與圖譜緊密度有出入。此外，在RAPD和RFLP技術(shù)基礎(chǔ)上建立了 SCAR(Sequeneecharacterize damplified regio ns ,序列特異性擴增區(qū)域 )、CAPS(Cleaved ampli2fiedpolymorphic sequenee , 酶切擴增多態(tài)序列 )和 DAF(DNA am2plified fingerprints ,DNA擴增指紋)等標(biāo)記技術(shù)。這些技術(shù)的出現(xiàn)，進一步豐富、完善了第1代分子標(biāo)記技術(shù)，增加了人們對DNA多 態(tài)性的

9、研究手段。1.2第2代分子標(biāo)記在真核生物基因組中存在許多非編碼的重復(fù)序列，如重復(fù)單位長度在 1565個核苷酸的小衛(wèi)星DNA(Minisatellite DNA),重復(fù)單位長度在 26個核苷酸的(Microsatellite DNA) 。小衛(wèi)星和分布于整個基因組的不同位點。由于重復(fù)單位的大小和序列不同以拷貝數(shù)不同，從而構(gòu)成豐富的長度多態(tài)性。Moore 等于1991 年結(jié)合PCR 技術(shù)創(chuàng)立了 SSR (Simple sequenee repeat ,簡單重復(fù)序列)標(biāo)記技術(shù)。SSR也稱,是一類由幾個(多為15個)堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA 序列，其中最常見的是雙核苷酸重復(fù)，即(CA) n和(

10、TG) n ,每個微衛(wèi)星DNA的核心序列結(jié)構(gòu)相同，重復(fù)單位數(shù)目1060個，其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。不同遺傳材料重復(fù)次數(shù)不同，導(dǎo)致了 SSR長度的高度變異性，這一變異性正是SSR標(biāo)記產(chǎn)生的基礎(chǔ)。SSR標(biāo)記的基本原理：根據(jù)微衛(wèi)星重復(fù)序列兩 端的特定短序列設(shè)計引物通過PCR反應(yīng)擴增微衛(wèi)星片段。由于核心序列重復(fù)數(shù)目不同，因而擴增出不 同長度的PCR產(chǎn)物,這是檢測DNA多態(tài)性的一種有效方法。微衛(wèi)星序列在群體中通常具有很高的多 態(tài)性，而且一般為共顯性，因此是一類很好的分子標(biāo)記。目前已利用構(gòu)建了人類、小鼠、大鼠、水稻、 小麥、玉米等物種的染色體遺傳圖譜。優(yōu)點：這些已被廣泛應(yīng)用于基因定位及克隆、

11、疾病診斷、親緣分析或品種鑒定、農(nóng)作物育種、進化研究等領(lǐng)域。此外,SSR標(biāo)記不僅能夠鑒定純合體和雜合體，而且結(jié)果更加可靠，方法簡單，省時省力。1.2. 2 ISSR標(biāo)記技術(shù)。ISSR即內(nèi)部簡單重復(fù)序列，是一種新興的分子標(biāo)記技術(shù)。 1994年Zietkiewicz 等對SSR技術(shù)進 行了發(fā)展，建立了加錨微衛(wèi)星寡核苷酸 (Anchored microsatellite oligo nucleotides)技術(shù)。他們用加錨定的微衛(wèi)星寡核苷酸作引物 ，即在SSR的5 端或3端加上24個隨機選擇的核苷酸，這可引起特定位點退火，從而導(dǎo)致與錨定引物互補的間隔不太大的重復(fù)序列間的基因組節(jié)段進行PCR擴增。這類標(biāo)

12、記又被稱為 ISSR ( In ter2simplesequenee repeat )、ASSR(Anchored simple sequenee repeats)或 AMP2PCR 。在所用的兩翼引物中，可以一個是ASSR引物，另一個是隨機引物。如果一個是5 端加錨的ASSR引物,另一個是隨機引物，則被稱為RAMP技術(shù)19。用于ISSR2PCR擴增的引物通常為1618個堿基序列， 由14個堿基組成的串聯(lián)重復(fù)和幾個非重復(fù)的錨定堿基組成，從而保證了引物與基因組 DNA中SSR的5 或末端結(jié)合通過PCR反應(yīng)擴增SSR之間的DNA 片段。優(yōu)點：SSR在真核生物中的分布是非常普遍的，并且進化變異速度非

13、?？?，因而錨定引物的ISSR2PCR可以檢測基因組許多位點的差異。與SSR2PCR相比，用于ISSR2PCR的引物不需要預(yù)先的DNA 測序，也正因如此，有些ISSR引物可能在特定基因組 DNA中沒有配對區(qū)域而無擴增產(chǎn)物，通常為顯性標(biāo)記，呈孟德爾式遺傳，且具有很好的穩(wěn)定性和多態(tài)性。1.3第3代分子標(biāo)記1.3. 1 SNP標(biāo)記技術(shù)。單核苷酸多態(tài)性(Single nueleotidepolymorphism，SNP)被稱為第3代DNA 分子標(biāo)記，是指同一位點的不同等位基因之間個別核苷酸的差異，這種差異包括單個堿基的缺失或插入，更常見的是單個核苷酸的替換，且常發(fā)生在嘌呤堿基(A與G)和嘧啶堿基(C與T

14、)之間。SNP標(biāo)記可幫助區(qū)分兩個 個體遺傳物質(zhì)的差異，被認(rèn)為是應(yīng)用前景最好的遺傳標(biāo)記。目前，已有2 000多個標(biāo)記定位于人類染色 體上，在擬南芥上也已發(fā)展出 236個SNP標(biāo)記。在這些SNP標(biāo)記中大約有 30 %包含限制性位點的多態(tài)性。優(yōu)點：檢測SNP的最佳方法是 DNA 芯片技術(shù)，最新報道的微芯片電泳(Microchip electrophoresis),可以高速度地檢測臨床樣品的SNP ,它比毛細(xì)管電泳和板電泳的速度可分別提高10和50倍。SNP與第1代的RFLP及第2代的SSR標(biāo)記的不同有 2個方面淇一 ,SNP不再以 DNA片段的長度變化作為檢測手段，而直接以序列變異作為標(biāo)記；其二,SNP標(biāo)記分析完全摒棄了經(jīng) 典的凝膠電泳，代之以最新的DNA芯片技術(shù)。1.3. 2 EST 標(biāo)記技術(shù)。表達序列標(biāo)簽(Expressed sequenee Tag , EST)是美國國立衛(wèi)生研究院 (National Institutes ofHealth ,NIH)的生物學(xué)家Ven ter于1991年提出的。隨著人類基因組計劃的開展 ，EST技術(shù)首先被廣泛應(yīng)用于尋找人類新基因，繪制人類基因組圖譜，識別基因組序列編碼區(qū)等研究領(lǐng)域，之后又被廣泛應(yīng) 用于植物基因組研究。EST是指在來源于不同組織的 cDNA 文庫中隨機挑選克隆、測序，得到部分cDNA 序列,一個EST對應(yīng)于某一種