抗原抗體反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

1、 The combining site of an antibody is located in the Fab portion of the molecule and is constructed from the hypervariable regions of the heavy and light chains. X-Ray crystallography studies of antigens and antibodies interacting shows that the antigenic determinant nestles in a cleft formed by the

2、 combining site of the antibody as illustrated in Figure. Thus, our concept of Ag-Ab reactions is one of a key (i.e. the Ag) which fits into a lock (i.e. the Ab). 4 types of noncovalent forces 抗原抗體反應(yīng)的基本類型抗原抗體反應(yīng)的基本類型 1. Precipitation- 2. Agglutination- 3. Radioimmunoassay 4. Enzyme-linked Immunosorbe

3、nt Assay 5. Immunofluorescence 6. Western Blotting 7. Flow Cytometry and Fluorescence 8. Immunoelectron Microscopy 本次實(shí)驗(yàn)涉及的抗原抗體反應(yīng)本次實(shí)驗(yàn)涉及的抗原抗體反應(yīng) 1. 沉淀反應(yīng)（沉淀反應(yīng)（Precipitation）- 可溶性抗原可溶性抗原與與 相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下發(fā)生結(jié)合而出現(xiàn)的沉淀相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下發(fā)生結(jié)合而出現(xiàn)的沉淀 現(xiàn)象?，F(xiàn)象。 2. 凝集反應(yīng)（凝集反應(yīng)（Agglutination）- 顆粒性抗原顆粒性抗原 與相應(yīng)抗體結(jié)合后所呈現(xiàn)的肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)與相應(yīng)抗體結(jié)合后

4、所呈現(xiàn)的肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn) 象。象。 沉淀反應(yīng)分類沉淀反應(yīng)分類: 液相沉淀：以無(wú)機(jī)鹽緩沖液為介質(zhì)。液相沉淀：以無(wú)機(jī)鹽緩沖液為介質(zhì)。 瓊脂擴(kuò)散：以凝膠為介質(zhì)。瓊脂擴(kuò)散：以凝膠為介質(zhì)。 - radial immunodiffusion （單相擴(kuò)散） - double immunodiffusion （雙相擴(kuò)散） 凝膠免疫電泳：在直流電場(chǎng)中進(jìn)行的凝膠擴(kuò)散。凝膠免疫電泳：在直流電場(chǎng)中進(jìn)行的凝膠擴(kuò)散。 - rocket immunoelectrophoresis （火箭電泳） 沉淀反應(yīng)特點(diǎn)沉淀反應(yīng)特點(diǎn): 液相沉淀：液相沉淀： Ag、Ab自由接觸，需時(shí)短。自由接觸，需時(shí)短。 瓊脂擴(kuò)散：瓊脂擴(kuò)散： Ag、Ab

5、在固相化的凝膠中擴(kuò)散，比液相慢，但在固相化的凝膠中擴(kuò)散，比液相慢，但AgAb 復(fù)合物不易散開(kāi)，位置穩(wěn)定，適合染色分析，可長(zhǎng)期保存復(fù)合物不易散開(kāi)，位置穩(wěn)定，適合染色分析，可長(zhǎng)期保存 結(jié)果。結(jié)果。 凝膠免疫電泳：凝膠免疫電泳： 在電場(chǎng)下擴(kuò)散和反應(yīng)速度加快，節(jié)省時(shí)間。在電場(chǎng)下擴(kuò)散和反應(yīng)速度加快，節(jié)省時(shí)間。 電場(chǎng)規(guī)定了擴(kuò)散方向，使反應(yīng)集中，靈敏度提高。電場(chǎng)規(guī)定了擴(kuò)散方向，使反應(yīng)集中，靈敏度提高。 1:21:41:8 1:16 1:32 50ul 稀釋液稀釋液 50ul 血清血清 50ul 50ul 倍比稀釋：倍比稀釋： 1234 15管分別加入管分別加入50 l 稀釋液稀釋液 加入加入50 l 原液于

6、第原液于第1管，這樣第管，這樣第1管被稀釋為管被稀釋為1：2 No. C1:11:21:41:81:16 從從1管吸出管吸出50 l ，加入，加入2管，管，2管的濃度為管的濃度為1管的一半（管的一半（1：2） 倍倍 比比 稀稀 釋釋 template agarose slide 1:32, 1:16, 1:8,1:4,1:2的標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)品 1:32, 1:16, 1:8,1:4,1:2,sample 電電 泳泳 + 將瓊脂板放入電泳槽將瓊脂板放入電泳槽 電泳電泳: 80v, 23h. - （-） （+） 5. 取出瓊脂板，在取出瓊脂板，在0.5%考馬斯亮藍(lán)中染色，考馬斯亮藍(lán)中染色，6%醋酸醋

7、酸 脫色。脫色。 6. 從加樣孔的圓心到峰尖量取各孔樣品沉淀峰的高度。從加樣孔的圓心到峰尖量取各孔樣品沉淀峰的高度。 以抗原濃度為橫坐標(biāo)以抗原濃度為橫坐標(biāo), 峰高為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。峰高為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)樣品中抗原的含量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)樣品中抗原的含量。 Rocket electrophoresis Ag Ab throughout agarose gel + - Double Immunodifusion 2 4 3 1 6 5 2 4 3 1 6 5 直接直接凝集試驗(yàn)?zāi)囼?yàn)-血型鑒定血型鑒定 實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理： 血型抗原紅細(xì)胞表面的同種異型抗原血型

8、抗原紅細(xì)胞表面的同種異型抗原 以人類紅細(xì)胞表面以人類紅細(xì)胞表面A A、B B抗原不同：抗原不同：A A、B B、ABAB、O O 血型血型 同一人血清中不含與本人血型抗原相應(yīng)的抗體：同一人血清中不含與本人血型抗原相應(yīng)的抗體： 表型表型 血型抗原血型抗原血型抗體血型抗體 A型型 A 抗抗 B B型型 B 抗抗A AB型型 AB O型型 H 抗抗A抗抗B 由抗由抗A A單抗及抗單抗及抗B B單抗可以通過(guò)凝集現(xiàn)象鑒定人單抗可以通過(guò)凝集現(xiàn)象鑒定人ABOABO血血 型。型。 凝集現(xiàn)象凝集現(xiàn)象 血型血型 抗抗A單抗單抗抗抗B單抗單抗 + -? - +? - -? + +? 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 玻片法：玻片法

9、： 1. 采集志愿者靜脈血采集志愿者靜脈血2ml, 注入盛有肝素的無(wú)菌小瓶注入盛有肝素的無(wú)菌小瓶 中，輕輕搖勻，使血液抗凝。中，輕輕搖勻，使血液抗凝。 2. 取清潔載玻片，用記號(hào)筆劃分取清潔載玻片，用記號(hào)筆劃分A、B兩半。兩半。 3. 于于A側(cè)中央加抗側(cè)中央加抗A試劑試劑（藍(lán)色）（藍(lán)色），B側(cè)加抗側(cè)加抗B試劑試劑 （黃色）（黃色）各一滴。各一滴。 4. 用滴管取受檢者全血加入至玻片中的抗用滴管取受檢者全血加入至玻片中的抗A、B試劑，試劑， 搖動(dòng)玻片使充分混勻，觀察并以有無(wú)凝集判定結(jié)搖動(dòng)玻片使充分混勻，觀察并以有無(wú)凝集判定結(jié) 果。果。 間接凝集抑制試驗(yàn)原理間接凝集抑制試驗(yàn)原理 假設(shè)某種抗原已存在

10、于體液中，如假設(shè)某種抗原已存在于體液中，如HCG在尿液中；在尿液中； 如果將其相應(yīng)抗體與尿液反應(yīng)，則抗體將與其中的如果將其相應(yīng)抗體與尿液反應(yīng)，則抗體將與其中的 抗原（抗原（HCG）結(jié)合；結(jié)合； 當(dāng)抗體隨后與乳膠抗原（乳膠為載體，當(dāng)抗體隨后與乳膠抗原（乳膠為載體，HCG為半抗為半抗 原）反應(yīng)時(shí)，由于抗體已優(yōu)先與尿液中的原）反應(yīng)時(shí)，由于抗體已優(yōu)先與尿液中的HCG結(jié)合，結(jié)合， 因此其不能與乳膠抗原反應(yīng)因此其不能與乳膠抗原反應(yīng); 無(wú)凝集或稱為凝集抑制現(xiàn)象。無(wú)凝集或稱為凝集抑制現(xiàn)象。 間接凝集抑制試驗(yàn)間接凝集抑制試驗(yàn) The combining site of an antibody is locate

11、d in the Fab portion of the molecule and is constructed from the hypervariable regions of the heavy and light chains. X-Ray crystallography studies of antigens and antibodies interacting shows that the antigenic determinant nestles in a cleft formed by the combining site of the antibody as illustrat

12、ed in Figure. Thus, our concept of Ag-Ab reactions is one of a key (i.e. the Ag) which fits into a lock (i.e. the Ab). 2 4 3 1 6 5 直接直接凝集試驗(yàn)?zāi)囼?yàn)-血型鑒定血型鑒定 實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理： 血型抗原紅細(xì)胞表面的同種異型抗原血型抗原紅細(xì)胞表面的同種異型抗原 以人類紅細(xì)胞表面以人類紅細(xì)胞表面A A、B B抗原不同：抗原不同：A A、B B、ABAB、O O 血型血型 同一人血清中不含與本人血型抗原相應(yīng)的抗體：同一人血清中不含與本人血型抗原相應(yīng)的抗體： 表型表型 血型抗原血型抗原血型抗體血型抗體 A型型 A 抗抗 B B型型 B 抗抗A AB型型 AB O型型 H 抗抗A抗抗B 間接凝集抑制試驗(yàn)原理間接凝集抑制試驗(yàn)原理 假設(shè)某種抗原已存在于體液中，如假設(shè)某種抗原已存在于體液中，如HCG在尿液中；在尿液中； 如果將其相應(yīng)抗體