第九節(jié)--疏水作用色譜

1、實用標(biāo)準文檔 第九節(jié) 疏水作用色譜 疏水作用色譜( Hydrophobic interaction chromatography HIC )是采用 具有適度疏水性的填料作為固定相， 以含鹽的水溶液作為流動相， 利用溶質(zhì)分子 的疏水性質(zhì)差異從而與固定相間疏水相互作用的強弱不同實現(xiàn)分離的色譜方法。 關(guān)于在疏水作用色譜條件下進行分離的概念最早在 1948 年就由 Tiselius 提 出，該技術(shù)真正得到發(fā)展和應(yīng)用是在 20 世紀 70 年代早期開發(fā)出一系列適合進 行疏水作用色譜的固定相以后。 此后隨著新型色譜介質(zhì)的開發(fā)生產(chǎn)和對機理認識 的逐步深人，該技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用， 并且隨著高效疏水作用色譜介

2、質(zhì)的出現(xiàn)， HIC 已在 HPLC 平臺上被使用，稱為高效疏水作用色譜( High performance hydrophobic interaction chromatography HP-HIC)。 由于疏水作用色譜的分離原理完全不同于離子交換色潛或凝膠過濾色譜等 色譜技術(shù)， 使得該技術(shù)與后兩者經(jīng)常被聯(lián)合使用分離復(fù)雜的生物樣品。 目前該技 術(shù)的主要應(yīng)用領(lǐng)域是在蛋白質(zhì)的純化方面， 成為血清蛋白、 膜結(jié)合蛋白、核蛋白、 受體、重組蛋白等，以及一些藥物分子，甚至細胞等分離時的有效手段。 一、疏水作用色譜基本原理 (一 ) 疏水作用 疏水作用是一種廣泛存在的作用， 在生物系統(tǒng)中扮演著重要角色， 它

3、是球狀 蛋白高級結(jié)構(gòu)的形成、 寡聚蛋白亞基間結(jié)合、 酶的催化和活性調(diào)節(jié)、 生物體一些 小分子與蛋白質(zhì)結(jié)合等生物過程的主要驅(qū)動力， 同時也是磷脂和其他脂類共同形 成生物膜雙層結(jié)構(gòu)并整合膜蛋白的基礎(chǔ)。 根據(jù)熱力學(xué)定律，當(dāng)某個過程的自由能變化(8)為負值時，該過程在熱力學(xué) 上是有利的，能夠自發(fā)發(fā)生，反之則不能。而根據(jù)熱力學(xué)公式 3= H 一 TS（6.9-1） 式中，AG是由該過程的燴變（AH），熵變（篤）和熱力學(xué)溫度（T）決定的。當(dāng) 疏水性溶質(zhì)分子在水中分散時，會迫使水分子在其周圍形成空穴狀結(jié)構(gòu)將其包 裹，此有序結(jié)構(gòu)的形成會導(dǎo)致熵的減?。êV0），致使M為正值，在熱力學(xué)上不 利。在疏水作用發(fā)生時，疏

4、水性溶質(zhì)分子相互靠近，疏水表面積減少，相當(dāng)一部 分水分子從有序結(jié)構(gòu)回到溶液相中導(dǎo)致熵值增加 （篤0），引入了負的G，從而 在熱力學(xué)上有利。 因此非極性分子間的疏水作用不同于其他的化學(xué)鍵， 而是由自 由能驅(qū)動的疏水分子相互聚集以減少其在水相中表面積的特殊作用。 （二） 生物分子的疏水性 對于小分子物質(zhì)， 根據(jù)其極性的人小可以分為親水性分子和疏水性分子， 一 般來說親水性的小分子是很難與 HIC 介質(zhì)發(fā)生作用的。但對于疏水作用色譜的 主要對象生物大分子如蛋白質(zhì)而言， 其親水性或疏水性是相對的， 即使是親水性 分子也會有局部疏水的區(qū)域，從而可能與 HIC 介質(zhì)發(fā)生疏水作用，因此能夠根 據(jù)其疏水性的相

5、對強弱不同進行分離。 以蛋白質(zhì)為例， 球狀蛋白質(zhì)在形成高級結(jié)構(gòu)時， 總體趨勢是將疏水性氨基酸 殘基包裹在蛋白質(zhì)分子部而將親水性氨基酸殘基分布在分子表面。 但實際上真正 能完全包裹在分子部的氨基酸側(cè)鏈僅僅占總氨基酸側(cè)鏈數(shù)的 20% 左右，其余均 部分或完全暴露在分子表面。 蛋白質(zhì)表面的疏水性是由暴露在表面的疏水性氨基 酸的數(shù)量和種類， 以及部分肽鏈骨架的疏水性所決定的。 因而可以認為蛋白質(zhì)分 子表面含有很多分散在親水區(qū)域的疏水區(qū) （疏水補?。?，它們在 HIC 過程中起著重 要的作用。然而研究表明不同的球狀蛋白質(zhì)的疏水表面占分子表面的比例差異并 不大，但即使是疏水表面比例非常接近的蛋白質(zhì)，其在 H

6、IC 中的色譜行為卻可 能有很大的差別。 造成這一現(xiàn)象的原因是蛋白質(zhì)分子表面的不規(guī)則性， 即使是球 狀蛋白質(zhì)， 其分子表面也遠非平滑球面， 而是粗糙而復(fù)雜的， 由于空間位阻的關(guān) 系，有些疏水補丁是無法與 HIC 介質(zhì)發(fā)生作用的，因此蛋白質(zhì)在 HIC 中的色譜 行為不僅取決于分子表面疏水區(qū)的大小和疏水性的強弱， 還取決于其疏水區(qū)在分 子表面的分布。 （二 ） 生物分子與疏水作用色譜介質(zhì)間的作用 HIC 介質(zhì)是在特定的基質(zhì)如瓊脂糖上連接疏水配基如烷基或芳香基團組成 的。HIC介質(zhì)與具有疏水性的生物分子間的作用被認為與疏水性分子在水溶液體 系中的自發(fā)聚集一樣， 是由熵增和白由能的變化所驅(qū)動的。 鹽類

7、在疏水作用中起 著非常重要的作用， 高濃度鹽的存在能與水分子發(fā)生強烈作用， 導(dǎo)致可以在疏水 分子周圍形成空穴的水分子減少， 促進了疏水性分子與色譜介質(zhì)的疏水配基之間 發(fā)生結(jié)合。因此在 HIC 過程中，在樣品吸附階段采用高鹽濃度的溶液，使得目 標(biāo)分子結(jié)合在色譜柱中， 而在洗脫階段， 采用降低洗脫劑中鹽濃度的方式使溶質(zhì) 與色譜介質(zhì)間的疏水作用減弱， 從而從色譜柱中解吸而被洗脫下來。 對于以芳香 基團作為疏水配基的色譜介質(zhì)來說， 還存在潛在的發(fā)生n - n作用的可能當(dāng)待分離 物質(zhì)表面具有芳香基時，就會表現(xiàn)出疏水作用和n - n作用的混合分離模式。 較大的生物分子與色譜介質(zhì)發(fā)生結(jié)合時的情況是比較復(fù)雜的

8、， 一般來說每個 分子被吸附的過程都會有一個以上的配基參與， 換句話說，分子在色譜介質(zhì)上發(fā) 生的結(jié)合是多點結(jié)合。 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)吸附過程是多步反應(yīng)過程， 其中的限速步驟并 非酶與色譜介質(zhì)接觸的過程， 而是酶在色譜介質(zhì)表面發(fā)生緩慢的構(gòu)象改變和重新 定向的步驟。 （四） 疏水作用色譜與反相色譜的區(qū)別 從理論上看， HIC 和 RPC 是兩種密切相關(guān)的液相色譜技術(shù)，它們都是基于 生物分子表面的疏水區(qū)域與色譜介質(zhì)上的疏水配基（烷基或芳香基 ） 之間的疏水 相互作用，然而在分子水平的色譜機理以及實踐層面上這兩種技術(shù)是有所不同 的。RPC介質(zhì)上疏水配基的取代程度大大高于 HIC介質(zhì)。RPC介質(zhì)可以認為是 連續(xù)

9、的疏水相，其配基如C4C 18烷基的取代程度通常在數(shù)百微摩/rnL凝膠；而 HIC 介質(zhì) 上配 基如 C2C 8 烷基或簡單芳香基的取代 程度 通 常在 1050mmol/mL 凝膠圍，可以看作是不連續(xù)（低密度分布）的疏水相，在與生 物分子結(jié)合時由一個或數(shù)個配基參與。那么很顯然，疏水溶質(zhì)與 RPC 介質(zhì)間的 作用力要比 H I C 介質(zhì)強得多， 需要使用有機溶劑梯度等劇烈的洗脫條件才能將 溶質(zhì)從色譜柱中洗脫下來， 對于球狀蛋白質(zhì)， 在這樣劇烈的洗脫條件下往往會發(fā) 生變性，因此 RPC 更適合在水 -有機溶劑體系中具有良好穩(wěn)定性的肽和小分子蛋 白質(zhì)的分離純化。而 HIC 過程的洗脫條件要溫和得多

10、，通常降低洗脫劑的鹽濃 度就能達到目的，因此 H IC 既利用了蛋白質(zhì)的疏水性質(zhì)，又能夠在更為極性和 低變性的環(huán)境中進行，因而在蛋白質(zhì)的純化中有著更為廣泛的應(yīng)用。 盡管這兩種技術(shù)都是利用生物分子的疏水性質(zhì)進行分離， 但由于在吸附的分 子機理上存在差異， 它們對于同一組樣品的選擇性往往是不同的。 例如，有人研 究用疏水色譜柱 TSK Gel Phenyl-5-PW 和反相色譜柱 SynChropak 對12 種常 見蛋白質(zhì)進行色譜，對選擇性作了比較，如表 6.9-1 所示，各種蛋白質(zhì)被洗脫的 順序全然不同。 表6.9-112種蛋白質(zhì)在疏水色譜柱和反相色譜柱中的選擇性比較 在 TSK Ge! Ph

11、tnyl-5-PW 就水 色置陀Q中呻槌值時側(cè)/Dim 在歸成?血即撫反相色SHIH 申的 0,6 ltri X )7. 3 卵淸莖白 昭 IS. 5 8.5 14. 3 卩mg齬懺曲 5.3 10.fi IX 6 a篌童？1盍fl 喩 . 1 l. 8 扎過訊北徇需 IS. 5 帥.3 T止情白章白 17. J W.B Ifc t 疏水作用色譜：色譜柱尺寸55mm X200mm，流動相A為含I.Omol/LNaSO 4的1mmol/L 磷酸鉀緩沖液（PH7.0），流動相B為10mmol/L 磷酸鉀緩沖液（pH7.0），梯度為 20mi n0100%B ，流速為 1mL/min 。 反相色譜：

12、色譜柱尺寸 4.6mm X50mm，流動相A為0.1% TFA水溶液（pH2.0），流動相 B為含0.1% TFA的60%異丙醉溶液，梯度為 20min0100%B ，流速為1mL/min 。 （五）影響疏水作用色譜過程的參數(shù) 影響疏水作用色譜過程的因素來自于固定相類型、流動相組成和色譜條件。 1. 固定相 固定相條件，包括采用基質(zhì)的類型、配基的種類和取代程度都會影響對樣品 的分離效果，這也是色譜時合理選擇色譜介質(zhì)的依據(jù)。 疏水配基的種類直接決定著目標(biāo)分子在色譜時的選擇性，是選擇疏水作用色 譜介質(zhì)時首先要考慮的問題。常見的配基包括烷基和芳香基兩大類，其中烷基配 基與溶質(zhì)間顯示出單純的疏水作用，

13、 而芳香族配基往往由于和溶質(zhì)間存在n - n作 用而呈現(xiàn)出混合模式的分離行為。對于烷基配基，烷基的鏈長決定著色譜介質(zhì)疏 水性的強弱，同時還影響著色譜介質(zhì)的結(jié)合容量。在其他條件相同的情況下， HIC介質(zhì)對蛋白質(zhì)的結(jié)合容量隨著烷基鏈長的增加而增加。 在配基種類確定的情況下，取代程度的高低決定著 HIC 介質(zhì)的結(jié)合容量和 疏水作用強度。 在色譜介質(zhì)上配基取代程度較低時， 隨著取代程度的增加。 色譜 介質(zhì)對蛋白質(zhì)的結(jié)合容量會增加， 這是由于配基數(shù)量的增加使得蛋白質(zhì)在色譜介 質(zhì)表面的結(jié)合位點增多， 從而單位體積的色譜介質(zhì)能夠吸附更多的溶質(zhì)分子。 但 是當(dāng)取代程度達到一定數(shù)值后， 結(jié)合容量就會趨于穩(wěn)定，

14、此時進一步提高取代程 度并不能再增加結(jié)合容量。 這是由于空間位阻決定了單位色譜介質(zhì)表面只能結(jié)合 特定數(shù)量的蛋白質(zhì)，因此當(dāng)這些表面飽和后結(jié)合容量就不再隨取代程度而變化 了。但是需注意的是取代程度的進一步上升將會使得與每個蛋白質(zhì)發(fā)生作用的配 基數(shù)量增加，從而使蛋白質(zhì)更為牢固地結(jié)合于色譜介質(zhì)上而難以洗脫。 基質(zhì)同樣會對色譜結(jié)果產(chǎn)生影響， 具有相同配基種類和取代程度但不同基質(zhì) 的吸附劑會具有不同的選擇性。通常 HIC 介質(zhì)所采用的是高度親水性的基質(zhì)。 2. 流動相 流動相條件對 HIC 的影響主要表現(xiàn)在所用鹽的種類和濃度、流動相的 pH ， 以及其他添加劑的影響。 HIC 過程是在高鹽濃度下實現(xiàn)樣品的

15、吸附， 而后在低鹽 濃度下完成洗脫過程。顯然，流動相中鹽的種類和濃度是 HIC 中至關(guān)重要的參 數(shù)。 不同的離子，特別是陰離子在 HIC 中的作用是不同的。有些離子存在于溶 液中時會促進蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀， 它們能夠增加疏水作用； 而另一些離子的存在卻 會促進蛋白質(zhì)的溶解， 稱為促溶鹽類， 它們的存在會破壞疏水作用。 Hofmeister 系列指出了不同離子對疏水作用的影響（表 6.9-2 ），表中左邊的離子能夠促進 疏水作用，因而經(jīng)常在 HIC 中使用，而右邊的離子屬于促溶離子，它們能破壞 疏水作用，有時在對色譜介質(zhì)進行清洗時可以用來洗脫一些結(jié)合特別牢固的雜 文案大全 實用標(biāo)準文檔 質(zhì)。 除離刊

16、旳巴5（獷訊（：00- xr ,Br- 3斤丄甌J- rSCN- 附真子楓仙尺旳心+LPMg 3時 置白應(yīng)氓釈盤靜用應(yīng)判片 在所用鹽的種類已經(jīng)確定的情況下，鹽濃度的高低會影響到溶質(zhì)分子與色譜 介質(zhì)的結(jié)合強度及色譜介質(zhì)的結(jié)合容量。鹽濃度的升高能促進疏水作用，因此 HIC通常都是在高鹽濃度下加樣并完成吸附，而通過降低洗脫劑中鹽濃度的方法 進行洗脫。除此之外，色譜過程的起始鹽濃度的高低還會影響色譜介質(zhì)對蛋白質(zhì) 的結(jié)合容量。 流動相的pH對色譜行為的影響比較復(fù)雜。多數(shù)情況下pH升高會使得疏水 作用減弱，而降低pH則增強此作用力，但是對于一些等電點較高的蛋白質(zhì)，在 高的pH下卻能夠牢固地結(jié)合在HIC介質(zhì)

17、上。 流動相中的其他添加劑主要指能夠減弱疏水作用的醇類、去污劑、促溶鹽類 等，它們的存在能有效地將溶質(zhì)分子從 HIC介質(zhì)上洗脫下來，同時它們還會影 響分離過程的選擇性。但是它們的存在一般會破壞蛋白質(zhì)等生物大分子的本間結(jié) 構(gòu)，使后者喪失部分或全部活性，所以在HIC過程中盡量避免使用此類試劑。 3. 色譜條件 除了固定相和流動相之外，色譜過程中的一些其他條件，例如溫度、流速等 也會影響到色譜結(jié)果。其中溫度對 HIC的影響比較復(fù)雜，根據(jù)疏水性溶質(zhì)在水 相中相互作用的理論，一方面疏水作用隨溫度的升高而增強， 但另一方面溫度的 升高會對蛋白質(zhì)的構(gòu)象狀態(tài)和在水中的溶解性等產(chǎn)生影響，從而表現(xiàn)為復(fù)雜的特 征，

18、由于溫度對疏水作用的明顯影響，在執(zhí)行一個特定的色譜任務(wù)時應(yīng)當(dāng)維持恒 定的溫度。流速對 HIC 的影響與其他色譜技術(shù)類似，然而由于 HIC 的分離對象 主要是蛋白質(zhì)這類大分子。 對流速的敏感性相對較低， 因此流速的選擇主要考慮 分離時間和色譜介質(zhì)類型等因素。 二、疏水作用色譜介質(zhì) （一 ） 疏水作用色譜介質(zhì)的基本結(jié)構(gòu) HIC 介質(zhì)的結(jié)構(gòu)與其他吸附技術(shù)所用的吸附劑類似， 由作為骨架的基質(zhì)和參 與疏水作用的配基。 許多類型的基質(zhì)都可以用來合成 HIC 介質(zhì)，但是使用最為廣泛的是瓊脂糖、 硅膠和有機聚合物等。 瓊脂糖凝膠是很早就被采用的一種基質(zhì)， 至今仍被大圍地 使用，其優(yōu)點是親水性強， 表面經(jīng)基密度

19、非常大， 衍生化后可以產(chǎn)生取代程度和 結(jié)合容量較大的 HIC 介質(zhì)，并且其大孔結(jié)構(gòu)可以容納體積很大的分子，適合于 大分子蛋白質(zhì)的分離，而且 pH 穩(wěn)定性良好。硅膠的特點是硬度大，夠承受很高 的流速和壓力， 有良好的機械穩(wěn)定性， 能適合于在 HP-HIC 系統(tǒng)中使用。 但是其 表面可供衍生的基團少， pH 穩(wěn)定性也差（ pH28 圍穩(wěn)定），因此其應(yīng)用受到了 限制。但隨后誕生了聚合物包裹技術(shù)， 在硅膠或其他有機聚合物表面包裹一層帶 有可衍生基團的高分子材料， 從而克服了硅膠基質(zhì)的上述缺點， 使其具備良好的 色譜性能而被廣泛地使用。 HIC 介質(zhì)所用的疏水配基分為烷基和芳香基， 與反相色譜介質(zhì)相比，

20、 其烷基 通常在 C8 以下，而很少使用疏水性更強的具有更長碳鏈的烷基，芳香基則多為 苯基。圖 6.9-1 顯示了幾種經(jīng)常使用的疏水配基連接至基質(zhì)的情況。 OH |-0CHjCH CH； O- CH* (a) TS OH OCH g CH 一 CH2 _ O-l-KCHjh （d）新戊基 文案大全 圖6.9-1偶聯(lián)至基質(zhì)的常見配基類型 方框部分為疏配基；斜杠部分代表基質(zhì)；剩余部分是將配基連接至基質(zhì)的基團 將疏水配基偶聯(lián)至基質(zhì)的方法視基質(zhì)的表面基團而定， 其中最有代表性的是 羥基，瓊脂糖基團帶有大量的羥基、而硅膠及其他聚合物基質(zhì)也會因表面包裹修 飾后帶上羥基。將疏水配基連接至羥基通常是使用帶有環(huán)

21、氧化物基團的配基分子 與羥基發(fā)生成醚反應(yīng)而形成穩(wěn)定的共價鍵，環(huán)氧化物基團反應(yīng)后開環(huán)形成配基與 基質(zhì)之間的連接部分 式中 R疏水配基；M 基質(zhì)。 通過調(diào)節(jié)兩種反應(yīng)物的比例可以方便地控制所得疏水作用色譜介質(zhì)的配基密度。 （二）常見疏水作用色譜介質(zhì)的種類 表6.9-3列出了部分已經(jīng)商品化的HIC介質(zhì)（包括部分色譜柱）的類型及特性。 表6.9-3部分商品化的HIC介質(zhì)和色譜柱的類型及特性 配種嶷 特性 J.T. Btfcer Hl Propyl 片 華脈証氐血穩(wěn)汁舊聞?chuàng)砗?，?檢 3t*nnijftl 27nm 爭域并J齬罷.粒樓別鬥i t-BurrlHIC T PharinjLtifl Phenyl

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26、是難以預(yù)測的，因此確定疏水作用色譜介質(zhì)時帶有經(jīng)驗性。然而色譜過程中需要 采用的流速和承受的壓力在選擇基質(zhì)種類時必須予以考慮，若操作過程在HPLC 系統(tǒng)中進行，則應(yīng)當(dāng)選用機械強度較大的剛性基質(zhì)。此外，若待分離物質(zhì)是分子 量很大的蛋白質(zhì)，并且樣品量也較大，則應(yīng)當(dāng)選擇大孔型基質(zhì)，如瓊脂糖凝膠， 這樣能夠獲得較高的結(jié)合容量；若待分離物質(zhì)為較小的分子，或者樣品量很小， 但對于分辨率的要求較高， 則可以考慮選用孔徑較小的基質(zhì)甚至非孔型基質(zhì)， 以 便獲得較高的柱效和良好的分辨率。 疏水配基類型和取代程度實際上決定了色譜介質(zhì)的疏水性強弱和結(jié)合容量 的高低，配基 （烷基 ）鏈越長，取代程度越高，則疏水性越強；反

27、之，鏈長越短， 取代程度低，則疏水性越弱。在 HIC 介質(zhì)中，烷基配基的鏈長大多在 C4C 8， 苯基的疏水性大致與戊基相當(dāng)，不過由于可能與溶質(zhì)發(fā)生n -n相互作用，它與戊 基有著不同的選擇性，寡聚乙二醇固定相的疏水性界于丁基與苯基之間。 選用何種疏水程度的色譜介質(zhì)， 最終依據(jù)是目標(biāo)分子的疏水性強弱， 總體趨 勢是在分離疏水性弱的分子時選用疏水性強的色譜介質(zhì)， 分離疏水性強的分子時 選用疏水性弱的色譜介質(zhì)。 如果目標(biāo)分子疏水性很弱， 在分離時需要確保有足夠 強的疏水作用使其能夠與色譜介質(zhì)發(fā)生結(jié)合， 提高結(jié)合時流動相的鹽濃度是增加 疏水作用的方法之一， 但如果色譜介質(zhì)本身疏水性不夠強， 單方面提

28、高鹽濃度將 是事倍功半， 并且疏水作用色譜時鹽的消耗量很大， 鹽濃度的高低直接關(guān)系到分 離過程的成本， 另外含高濃度鹽類的廢水在排放時涉及環(huán)保問題， 因此在可能的 情況下，人們更愿意采用鹽濃度較低的流動相， 此時選用配基鏈長更長， 取代程 度更高因而有著更強疏水性的固定相將是十分有效的手段。 反之，如果日標(biāo)分子 疏水性很強，則應(yīng)當(dāng)考慮該分子是否會與色譜介質(zhì)結(jié)合得過于牢固而難以洗脫， 一般的考察方法是用不含鹽的緩沖液作為流動相， 看是否能夠?qū)⒛繕?biāo)分子從色譜 柱中洗脫， 對于特別難以洗脫的物質(zhì)， 原則上通過往流動相中加入非極性溶劑可 以達到洗脫目的， 但是對于蛋白質(zhì)等生物分子， 有機溶劑的添加很容

29、易造成其失 活，因此在這種情況下， 人們更愿意選用疏水性較弱的色譜介質(zhì)以減弱溶質(zhì)與色 譜介質(zhì)的結(jié)合強度。 由于在第一次進行色譜時， 樣品中目標(biāo)分子的疏水性并不能確定， 因此在選 擇色譜介質(zhì)前可以進行一次預(yù)備實驗對色譜介質(zhì)進行篩選。 具體的方法一般是選 出疏水性強弱存在明顯差異的幾種色譜介質(zhì)填充成很小規(guī)模的色譜柱，以含有 1mol/L硫酸銨的緩沖液作為流動相 A，不含鹽的緩沖液作為流動相 B，采用鹽 濃度下降的線性梯度進行洗脫， 觀察目標(biāo)分子與固定相結(jié)合及被洗脫的情況來確 定合適的色譜介質(zhì)。 在色譜柱的選擇方面， 由于疏水作用色譜屬于吸附色譜技術(shù)， 一般采用較粗 而短的色譜柱， 其中柱長的選擇一

30、定程度上取決于所需的分辨率， 而柱徑的大小 與分離樣品的規(guī)模有關(guān)。 （二） 樣品的準備 與其他色譜技術(shù)相比， HIC 在樣品準備方面的要求比較低， 一般來說， 往色 譜柱中加樣前無需改變樣品的緩沖液體系， 所需采取的措施是往樣品中添加足夠 濃度的鹽，使樣品溶液中的鹽濃度達到與流動相 A中基本一致，并根據(jù)需要調(diào) 節(jié)樣品溶液的 pH 使其滿足吸附條件。往樣品中添加鹽時既可以以固體形式加 入，也可以以濃縮鹽儲液形式加入， 前一種方式有時會因為局部鹽濃度過大導(dǎo)致 出現(xiàn)沉淀， 因此后一種加鹽方式更為人們所常用。 需要注意的是， 有時為了確保 目標(biāo)分子發(fā)生吸附， 需要很高的鹽濃度條件， 但在此鹽濃度下部分

31、樣品組分會發(fā) 生沉淀，為了解決此矛盾，可以采取樣品如溶液中鹽濃度適當(dāng)?shù)陀诹鲃酉郃中 鹽濃度的方式。加樣前色譜柱先用流動相 A充分平衡，加樣時雖然樣品中鹽濃 度較低，但樣品進入鹽濃度較高的色譜柱后還是能有效發(fā)生吸附。 與其他吸附色譜技術(shù)類似， HIC 的樣品體積主要受到樣品中組分濃度和色譜 介質(zhì)的結(jié)合容量的影響。 對于稀釋樣品無需濃縮可以直接加樣。 但如果遇到上述 樣品溶液鹽濃度低于流動相 A 的情況時一次加樣體積不能太大，否則無法確保 樣品有效吸附， 此時如果樣品體積較大。 可以采用將樣品分做若干份進行加樣的 方式，加完一份樣品后用一定體積的流動相 A 通過色譜柱，重新提高柱中鹽濃 度，使組分

32、完成吸附，再進行下一份樣品的加樣，如此循環(huán)直到樣品添加完畢。 對于所有色譜實驗， 黏度過大的樣品均會導(dǎo)致色譜結(jié)果不理想， 遇到這種情 況，同樣可以通過稀釋的方法降低樣品貓度。 另外在加樣前樣品中如有顆粒狀物 質(zhì)，必須通過過濾或離心的方法除去。 （三 ） 色譜條件的確定和優(yōu)化 確定色譜條件的目標(biāo)是在目標(biāo)分子達到所需純度的基礎(chǔ)上， 獲得盡可能高的 回收率，同時力求縮短分離所需時間、降低分離成本等。在 HIC 中，色譜條件 主要包括流動相A、流動相B、洗脫方式、色譜柱的柱長、流速、溫度等。 流動相 A 是色譜的起始條件，在絕大多數(shù)情況下，人們采用使目標(biāo)分子結(jié) 合至色譜柱而疏水性較弱的雜質(zhì)不被吸附而穿

33、透的方式。 此時需要確定的是流動 相 A 中緩沖液的種類、鹽的種類和濃度、 pH 等條件。確定緩沖液的種類主要考 慮所需采用的 pH ，緩沖液在此 pH 附近必須具備強的緩沖能力，此外所用緩沖 鹽不會對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性造成不利影響。 由于流動相中鹽濃度主要依靠額外添加 的鹽類維持，緩沖液中緩沖鹽本身的濃度一般不需要很高，通常 0.010.05mol/L ，僅需具有足夠的緩沖能力即可。不同鹽類疏水作用的影響在 前面已經(jīng)討論過，在HIC中最有效并且使用最廣泛的鹽是（NH4）2SO4和Na2SO4, 此外 NaCl 有時也被使用，不同鹽類除了對疏水作用的強度有影響外，在色譜中 表現(xiàn)出的選擇性也會不盡相

34、同。所以鹽的濃度也隨樣品中目標(biāo)分子的疏水性而 異，使用（NH4）2SO4作為色譜鹽時常用的濃度為 0.752mol/L ，使用NaCI時 濃度多在 14mol/L 。在理想的狀態(tài)下， 所選擇的鹽的種類和濃度應(yīng)當(dāng)能夠使得 目標(biāo)分子結(jié)合在色譜柱上， 而主要的雜質(zhì)成分不被吸附而穿過色譜柱。 在試探性 實驗中，1mol/L的(NH4)2SO4是常用的條件，根據(jù)洗脫后的出峰情況再對其進 行調(diào)整。如果目標(biāo)分子在洗脫過程的早期就從色譜柱中洗脫， 可以適當(dāng)提高流動 相 A 中鹽的濃度，當(dāng)然也可換用疏水性較強的色譜介質(zhì)；如果目標(biāo)分子在洗脫 過程中很晚才被洗脫，則可以適當(dāng)降低流動相 A 中的欲濃度，或者換用疏水性

35、 較弱的色譜介質(zhì)。流動相 A 的 pH 條件對吸附過程至關(guān)重要，它直接影響著目 標(biāo)分子在色譜介質(zhì)上的結(jié)合強度及分離過程的選擇性。 但是 pH 對色譜結(jié)果的影 響并不存在一般規(guī)律， 因此色譜操作大多是在能夠使目標(biāo)蛋白保持良好穩(wěn)定性的 pH 條件下進行的。如果在這種 pH 下目標(biāo)蛋白與色譜介質(zhì)不能有效結(jié)合，或者 色譜結(jié)果選擇性不佳， 可以考慮對色譜過程的 pH 進行優(yōu)化， 即分別在具有不同 pH 的流動相條件下進行色譜分離，確定分離過程的最佳 pH 。當(dāng)然這個過程也 必須考慮到目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定性，確保色譜分離后目標(biāo)蛋白有足夠高的活性回收 率。 當(dāng)樣品被添加至色譜柱，并用 12 個柱體積的流動相 A

36、通過色譜柱完成樣 品的吸附過程后， 就要對吸附樣品進行洗脫了。 HIC 中將樣品洗脫的方式主要有 3種：采用降低流動相中鹽濃度的方式洗脫，隨著鹽濃度的下降，樣品組分與 色譜介質(zhì)間的疏水作用不斷減弱從而各組分按疏水性由弱到強的順序被洗脫， 這 是HIC中最常用的洗脫方式；通過往流動相中添加有機溶劑，例如，乙二醇、 丙醇、異丙醇等，降低流動相極性的方式洗脫， 極性的降低會大大減弱疏水作用， 從而使得一些與色譜介質(zhì)間存在強疏水作用， 較難被洗脫的組分從色譜介質(zhì)上解 吸而被洗脫， 這種方式常常與第一種方式結(jié)合使用， 即洗脫過程中在降低鹽濃度 的同時逐漸增加有機溶劑的濃度， 但由于溶劑的存在往往對生物大

37、分子的穩(wěn)定性 產(chǎn)生不利影響， 因此這種洗脫方式僅限于在溶劑中穩(wěn)定性良好的物質(zhì)的分離； 往流動相中添加去污劑等試劑進行洗脫，去污劑本身能與色譜介質(zhì)發(fā)生強烈吸 附，從而將結(jié)合在其上的目標(biāo)組分置換下來， 但是去污劑一般會破壞蛋白質(zhì)的空 間結(jié)構(gòu)，并且有的與色譜介質(zhì)結(jié)合過于牢固而難以被清洗下來， 對色譜介質(zhì)的再 次使用非常不利， 因此這種洗脫方式有較大的局限性， 一般在分離膜蛋白時會采 用。 對于最為常用的降低鹽濃度的洗脫方式， 又可分為梯度洗脫和階段洗脫， 其 概念在離子交換色譜等節(jié)中已有闡述。 在進行試探性實驗時首選梯度洗脫， 并且 一般采用簡單下降的線性梯度， 梯度的終點即流動相 B 多為不含鹽的

38、與流動相 A 具有相同 pH 的緩沖液。一方面，梯度的斜率直接影響著色譜過程的分辨率，斜 率較低的梯度能產(chǎn)生好的分辨率， 但是另一方面， 如果洗脫過程都是從 100% 的 流動相A（或者表示為0%流動相B）過渡到100%的流動相B,斜率降低會使分離 所需時間延長。 解決這一矛盾的方法有兩種， 一種是在試探性實驗后對梯度進行 優(yōu)化,采用復(fù)合梯度, 在目標(biāo)分子的洗脫峰附近降低梯度斜率以獲得足夠的分辨 率,而在其他部分提高梯度斜率以縮短色譜時間, 當(dāng)然這些部分組分間的分辨率 會變差, 但不會對目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)生影響 （圖 6.9-2 a ）。另一種優(yōu)化方法是采用低的 梯度斜率,同時根據(jù)首次色譜分離時目標(biāo)分

39、子的出峰位置適當(dāng)降低流動相 A 中 的鹽濃度或增加流動相 B 中的鹽濃度,這樣由于梯度的圍變窄,所需時間也會 縮短,從而彌補斜率降低對分離時間產(chǎn)生的不利影響。 對于特別復(fù)雜的樣品, 還 能采用凹形、 凸形等更為復(fù)雜的梯度形式以達到滿意的分辨率。 階段洗脫的優(yōu)脫 問樣有一足的優(yōu)勢在于操作簡單, 不同批次間重復(fù)性良好, 因此在大規(guī)模分離純 化中較常使用。在分析型分離時只要流動相條件選擇恰當(dāng)，階段洗脫同樣有一定 的優(yōu)勢，可以縮短分離時間，得到濃度較高的分離后產(chǎn)物，同時也能提高分辨率, 因為階段洗脫相當(dāng)于在每一階段部采用斜率為零的梯度進行洗脫（圖 6.9-2 b） 圖6.9-2 根據(jù)試探性實驗結(jié)果對洗脫進行優(yōu)化 陰影部分代表目標(biāo)分子的洗脫峰；直線代表洗脫過程中鹽濃度的變化 在HIC過程中溫度對色譜結(jié)果的影響是顯著的，這是由于溫度升高會增加 疏水作用這在前面已經(jīng)提到過。因此從溶質(zhì)結(jié)合至色譜介質(zhì)的角度看，升高溫度 是有利的，但是蛋白質(zhì)等生物大分子在較高溫度下會發(fā)生變性， 所以事實上HIC 過程并不主在升高溫度的條件下進行。 但是對于特定的分離任務(wù)，操作過程的溫 度需要保持恒定，這樣才能確保色譜結(jié)果具有良好的重復(fù)性。 （四）色譜介質(zhì)的再生、清洗和儲存 對于不同類型的色譜介質(zhì)，再生和清洗的方法有所不同。最常規(guī)的再生方法 是在洗脫過程完成后用蒸餾