D二聚體檢測的方法及其臨床應用

1、d-二聚體檢測的方法及其臨床應用上海第二醫(yī)科大學附屬瑞金醫(yī)院檢驗醫(yī)學系胡翊群 王鴻利 d-二聚體（d-dimer,d-d）是交朕纖維蛋白（fb）特異的降解產(chǎn)物，它的生成或增高反映了凝血和纖溶系統(tǒng)的激活。在全血或血漿中，采用針對d-d的抗體可以很容易地檢測d-d含量。近10年來，已建立了多種有價值的d-d的檢測方法。早在80年代末90年代初期，人們發(fā)現(xiàn)d-d對臨床上疑診為靜脈血栓形成（venous thrombo-embolism，vte）的患者高度敏感，但不特異。在這些患者中，當血漿d-d濃度低于：某一臨界值（通常為500g/l）時，其陰性預測值大于90%，由此可以作為排除vte的篩選試驗。近

2、年來，隨著方法學的不斷進步，建立多種適用于急診的簡單快速的敏感方法，d-d檢測的臨床應用越來越廣泛。大量研究已經(jīng)亢分證實了d-d在排除診斷下肢深靜脈血栓形成（deepvein thromboembolism，dvt）和肺栓塞（pulmonary embolism，pe）中的應用價值，已將其作為首選篩選指標之一。最近，d-d檢測的應用巳深入到彌散性血管內(nèi)凝血（dlc）、心血管疾病、激素替代治療、惡性腫瘤以及抗凝治療領域。一、d-d的生成 在各種病理和生理狀態(tài)下，凝血系統(tǒng)的激活導致fb的生成，而fb的生成又可激活纖溶系統(tǒng)，引起纖溶酶（plasmin，pl）的生成和fb的降解。在交聯(lián)fb的降解過程中

3、，生成了一系列的特異降解產(chǎn)物，其中包括d-d（d-dimer）（圖1a，1b）。 凝血系統(tǒng)的激活導致凝血酶生成，凝血酶結合于纖維蛋白原的中央結構域，釋放纖維蛋白肽a（fpa）和纖維蛋白肽b（fpb），生成纖維蛋白單體和多聚體。在活化fxiii的作用下，生成交聯(lián)的纖維蛋白。纖溶酶降解交聯(lián)纖維蛋白，生成多種交聯(lián)的纖維蛋白降解產(chǎn)物（fbdps），其中包括d-d和其它的片段。二、d-d的檢測方法 d-d的檢測方法有多種，主要是基于膠乳凝集原理的定性或半定量試驗以及基于elisa原理的定量測定，也有些方法采用免疫濁度原理或免疫熒光原理。膠乳法靈敏度較低，而經(jīng)典elisa法操作費時，都不適合急診使用。現(xiàn)在

4、已經(jīng)發(fā)展了數(shù)種快速的、叮檢測單份標本的高靈敏度檢測方法。其中應用最廣泛、得到臨床研究認可的快速檢測方法主要有兩種：一種是在全血小進行的，只需2分鐘就可得到定性結果的試驗（自身紅細胞凝集，simplired, agen；金標法simplify，agen）；另一種是快速elisa（vidasd-d，biomerieux）。兩種快速d-d檢測方法與經(jīng)典檢測方法的比較見表1。其他一些快速檢測法，無論是基于elisa原理或是膠乳凝集原理，在推薦用于診斷可疑vte或其他血栓性疾病前，應進行全面的臨床應用評估。 對于用于排除診斷vte的d-d檢測方法而言，下列幾個指標非常重要：敏感性；特異性；陰性預測值（n

5、pv）：即當d-d水平低于臨界值或為陰性時，患者確實不患vte的可能性；陽性預測值（ppv）：即當d-d水平高于臨界值或為陽性時，患者患vte的可能性。其中d-d檢測方法對vte的敏感性和npv是評價該方法至關重要的指標。以下簡要介紹幾種常用方法的原理和檢測特性，比較各種方法的性能，并就目前在d-d檢測方法學上的局限性作一分析。表1 經(jīng)典與新型快速d-d檢測方法的比較 單份標本檢測 快速 定量 敏感性 特異性 膠乳法 纖典血漿膠乳法（classical late） + + - - + 全血膠乳法（simplired/simplify） + + - - + elisa 經(jīng)典elisa - - +

6、 + - 快速elisa法（vidas d-d） + + + + - （一） 膠乳凝集法 1simplired（agen diagnostics limited，australia）是目前應用最廣泛，性能也得到公認的自身紅細胞凝集d-d檢測方法。采用分別針對d-d和纖細胞上表位的雙抗體，當血中d-d水平升高時，抗原抗體結合的增多而導致紅細胞凝集，2分鐘內(nèi)可以判斷結果，為半定量的白體紅細胞凝集試驗。其優(yōu)點是可在全血中檢測，省去了離心制備血漿的麻煩。對vte的敏感性和npv分別為81%-89%和90%-94%。如果僅對近端dvt而言，simplired的敏感性和npv叫更高些，特異性和ppv分別為

7、48%和67%仍不失為一種有價值的篩選高危的近端dvt的方法。 2liatest定量試驗 可在20分鐘內(nèi)完成。臨界值為500ng/ml時，其對vte的敏感性和npv分別為35%和96%。如果僅對近端dvt而言，其npv可達100%。 liatest 與經(jīng)典elisa法有很好的相關性（r=0.98）。（二） 快速elisa法 1vidas dd（biomerieux，france）是一種定量全自動elisa法，在vidas免疫分析儀上進行。它將兩步的免疫夾心法與最后的熒光檢測結合起來。利用現(xiàn)成的單劑量試劑和分析儀中儲存的校準系統(tǒng)，對單份樣本進行檢測?，F(xiàn)成試劑由包被了鼠抗d-d單抗的固相移液裝置和

8、一試劑條組成，后者包含了其他所需試劑：結合劑（堿性磷酸酶標記的鼠抗d-d單抗）、洗滌劑、樣品稀釋劑和底物。將200ul血漿吸入試劑條后，所有步驟由分析儀完成。除需將血樣常規(guī)離心15分鐘外，結果可在35分鐘內(nèi)得到。結果以纖維蛋白原等價單位表示，其檢測上限為1000ug/1，下限為50ug/l，低于正常參考值下限（68-494ug/l）。對dvt的敏感性和npv分別為96%99%和95%99%。vidas dd是目前研究最多的一種檢測方法，敏感性很高，與經(jīng)典elisa法有很好的一致性，最有希望取代經(jīng)典elisa法而成為dvt診斷的首選篩選試驗。 2instant ia dd（stago，asnie

9、refrance）定性方法，在多孔膜上進行，利用免疫濾過裝置并采用兩種互補單抗，也可對d-d進行半定量檢測。當樣本中d-d水平高于500ng/ml時，將有顏色顯示，顏色的深淺與d-d水平成正比此時結果為陽性。低于300ng/ml時無顏色產(chǎn)生，為陰性。在300-500ng/ml 時，有一灰色帶顯現(xiàn)，結果為可疑。本試驗可在10分鐘內(nèi)完成。敏感性和npv分別為78%-84%和86%-90%，敏感性低于vidasdd。因此，instant ia dd的應用遠不如vidas dd那樣廣泛，還需進一步的臨床應用研究對其進行嚴格的評價。 3nycocard d-dimer nycomed本法在多孔薄膜上經(jīng)免

10、疫過濾后，由單抗偶朕金抗體，后者的結合劑所產(chǎn)牛的紅色強度由nycocard顯示，強度與血漿中d-d水平（500-8000ng/ml）成比例，可定量檢測。幾分鐘內(nèi)即可完成。敏感性和npv在不同報道中差別較大，并且廠商和實驗室的結果存在較大的差異?？赡艿脑蚴潜谎芯康娜巳翰煌玳T診患者以及近端dvt患者的比例等。然而，無論如何解釋，這種實驗室之間結果的不可重復性不可避免將影響其臨床應用。 （三） 方法學的局限性 上述各種快速d-d檢測方法的優(yōu)點是明顯的，但遺憾的是各種方法也存在不同程度的缺點。對于基于膠乳凝集原理的快速檢測方法來講，敏感度低是其最大的缺點，且由于具結果判斷以陰性和陽性表示，無法通

11、過降低臨界值水平束提高敏感件。但是作為排除診斷試驗，保證100%的敏感性是全關重要的。研究表明，若不能保證100%的敏感性，將會帶來偏差，并造成嚴重的后果：每降低2%的靈敏度，就會有1/1000的可疑pe患者死亡。另外由于結果需肉眼觀察，不可避免地存在不同觀察者之間的差異。這些都是臨床醫(yī)師和患者有所顧慮的問題。 對于快速elisa檢測方法而言，各種方法之間的標準化是一個難題?，F(xiàn)已有多種快速elisa法，每種又有多種商品化的試劑盒。這些試劑盒使用的抗體及其捕獲的相應抗原不同標本稀釋度、檢測限度和孵育時間等也互不相同。在151例臨床疑診為pe的患者中，全面比較了4種elisa檢測方法，發(fā)現(xiàn)各種方法

12、中位數(shù)的變異系數(shù)（cv）從3.5%到17%不等，但各種方法間的cv值卻相當相近（15%-20%）。這種較差的重復性至少可以部分解釋各種elisa方法間較小的相關性（回歸系數(shù)約為0.60）。再者，個同方法所得到參考值差別也相當大，各種elisa 方法之間很難標準化。但從另方面考慮，由于各種方法識別血漿或全血中的不同成分，并且采用了不同的技術，其結果的異質(zhì)性是在預料之中的。所以，現(xiàn)在人們已經(jīng)認識到，與其要求一種不大可能實現(xiàn)的標準化，還不如對每種方法根據(jù)以下四點進行臨床應用評估，評估后制訂出各自的嚴格的臨界值。必要時，可通過降低臨界值而保證100%的敏感性。d-d檢測方法的四步評估包括：檢測方法所用

13、的技術；與標準診斷方法作全面比較，確定新方法的嚴格臨界值（采用receiver operating characteristiccurre，roc曲線分析）以及相應的對確診vte的敏感性和特異性；“管理”實驗，即d-d濃度低于臨界值的患者，停服抗凝劑，隨訪三個月以觀察其是否有遲后發(fā)病現(xiàn)象，由此判斷新方法的真正診斷價值；比較新方法的價-效比。三、dd檢測的臨床意義d-d的生成反映機體凝血和纖溶系統(tǒng)的激活，在各種血栓形成性疾病以及牛理性高凝狀態(tài)時均有升高。特別是對vte高度敏感，在vte的排除診斷中具有重要價值。另外，d-d在心血管疾病、dic、惡性腫瘤等疾病叫，也有明顯變化，足反映疾病的嚴重程度

14、、發(fā)展變化、以及療效和頂后的有用指標。（一） 伴隨有d-d升高的疾病1深靜脈血栓形成（dvt）2肺栓塞（pe）3彌散性血管內(nèi)凝血（dic）4心血管疾病：急性心肌梗死、不穩(wěn)定性心絞痛、動脈粥樣硬化、冠狀動脈硬化、高血壓等5惡性腫瘤：乳腺癌、卵巢癌、急性臼血病等6手術、創(chuàng)傷后7溶栓治療后8腦血管疾病9嚴重感染、膿毒血癥、壞疽等10絕經(jīng)后激素替代治療、先兆子癇、妊娠11其他 甲減、慢性肝病等（二）d-d檢測的臨床意義 1d-d檢測用于排除dvt靜脈造影是最早應用的診斷dvt的方法，現(xiàn)任仍是診斷dvt的金標準。但是靜脈造影價格昂貴，且具有侵襲性，存在一定的風險性，臨床醫(yī)牛和患者都不太愿意采用。另外許多

15、基法醫(yī)療單位也沒有作靜脈造影的設備。日前應用較多的是一些非侵襲性的診斷方法，如靜脈加壓超聲（cus）或：維掃描（ds）。非侵襲性方法比靜脈造影傷害性小，也更為方便，但仍然比較昂貴，并且需要專門的技術人員操作。由于在非侵襲性方法診斷為陰性的患者中，約20%的患者在隨訪中發(fā)生vte，所以進行連續(xù)的動態(tài)系列檢測是必要的。但這不僅更增加了醫(yī)療費用，也增加廠患者的焦慮，因為他們無法在5天內(nèi)得到明確的診斷結果。 由于d-d檢測安全簡單、快速、經(jīng)濟、敏感性高。尤其是大量研究已經(jīng)證實了經(jīng)典elisa法對dvt的npv可達100%，各種新型的快速d-d檢測方法對dvt也高度敏感。表2總結了各種d-d檢棚方法診斷

16、可疑dvt的特性?？梢钥闯?，如果采用d-d在人群小大規(guī)模篩選和排除dvt，叮以極大地節(jié)省時間和經(jīng)費。閑為只行當患者的d-d濃度高于臨界值時，才有必要采用更特異的超聲波檢查。 表2 d-d檢測診斷可疑dvt或pe的特點回顧性的研究發(fā)現(xiàn)，在巳確診的82例dic患者中，fdf和d-d聯(lián)合的診斷效率最高，為95%；而d-d本身的診斷效率可達80%，與聯(lián)合fdp的方法相比，其敏感性沒有降低（均為91%），只是特異性有所下降（68%vs94%）。d-d的診斷效率遠遠高于pt或ppt、血小板計數(shù)、纖維蛋白原、tt等。因此，作者認為，聯(lián)介d-d、fdp和抗凝血酶檢測是診斷dic的最好策略，因為d-d和fdp可

17、以提供快速、特異的診斷，而抗凝血酶則有助于了解疾病的嚴重程度和預后，fdp因其快速，且比d-d便宜，可以用于診斷確立后的病情發(fā)展監(jiān)測。 此外，d-d也可在一定程度上反映dic的嚴重程度。dic患者的d-d水平高于dic前狀態(tài)（pre - dic）患者的水平，后者的水平高于正常人。 4d-d在心血管疾病的意義 d-d的升高與動脈粥樣硬化的發(fā)生和嚴重程度有關，也可作為急性心肌梗死后復發(fā)的預測指標。 研究發(fā)現(xiàn)，在沒有心血管疾病癥狀的患者中，有頸動脈損傷、且有高度血栓形成可能性患者的d-d明顯高于沒有頸動脈損傷的患者，也高于有頸動脈損傷，但血栓形成的可能性比較低的患者。同樣，在有心血管疾病癥狀的患者，

18、如高血壓患者中，d-d水平的升高也與動脈粥樣硬化的發(fā)生有關。并且發(fā)現(xiàn)，d-d水下的升高與血漿脂蛋白（a）水平成正比。多元回歸分析顯示，d-d和脂蛋白（a）都分別是動脈粥樣硬化的獨立影響因子。 另外，d-d檢測在急性心肌梗死后預測是否復發(fā)也有重要價值。心肌梗死后，如果患者的d-d水平持續(xù)偏高，復發(fā)的可能性比較大。但此預測價值存在性別差異，只有在男性患者中才有意義，其原因尚未明了。 5d-d在惡性腫瘤中的意義 惡性腫瘤患者大多伴有凝血和纖溶的異常，血漿d-d往往升高，且與浸潤密切相關。 在21例轉(zhuǎn)移性腫瘤患者中，d-d的平均水平高達2mg/l，遠遠高于同年齡和性別的正常對照組的平均水平（0.2mg

19、/l）。同時發(fā)現(xiàn)，升高的d-d水平與單核細胞表面結合的活化蛋白c（apc）高度相關，卻與單核細胞組織因子（tf）的表達和凝血酶抗凝血酶復合物（tat）不相關，而后兩者的水平在所研究的腫瘤患者中并未明顯升高。這一結果反映了在這些患者中，發(fā)生了局部的凝血酶和纖維蛋白生成，而不是全身的凝血和纖溶的激活。 6d-d對術后抗凝治療的指導意義 研究表明，d-d水平可用以調(diào)整低相對分子質(zhì)量肝素（lmwh）的用量，對234例創(chuàng)傷手術的患者進行了抗凝預防治療。lmwh的基礎用量是28501 u/d，如果在術后第4天，患者的d-d水平高于2mg/l，將lmwh的用量增加每天兩次。在術后5-7天作彩色多普勒超聲檢查

20、。結果發(fā)現(xiàn)，高危組（臀、股骨或膝關節(jié)置換術，n=102）的d-d水平明顯高于十危組（膝關節(jié)的其它于術、胚骨、腓骨和足部手術，n=132）。術后第2天和第4天的d-d檢測對確實存在血栓危險的患者（即手術第4天以后d-d水平仍高于2mg/l的患者）的敏感性和特異性分別為100%和72.8%。高危組的dvt發(fā)生率為3.9%，其中近端dvt的發(fā)牛率為1.96%；中危組有一例（0.8%）發(fā)生遠端dvt。這一結果顯示，d-d是監(jiān)測術后凝血激活情況以及l(fā)mwh抗凝預防治療的良好指標。7d-d在絕經(jīng)后婦女激素替代治療中的變化 絕經(jīng)后婦女激素替代治療（hrt）對凝血和纖溶系統(tǒng)的影響尚未定論。大多資料顯示，hrt

21、有增強纖溶活性的作用，d-d水平有所增高。 8其它引起d-d升高的因素 在腦血管意外、溶栓治療后、嚴重感染、膿毒血癥、壞疽、先兆子癇、甲狀腺功能減低、慢性肝病、結節(jié)病等情況f，常有機體凝血和纖溶系統(tǒng)的激活，也可見d-d升高。因此，d-d對住院患者的特異性比門診患者差，更適用于門診患者的vte篩選診斷。 另外，一些生理因素也可影響d-d水平，如年齡和妊娠等。老年人d-d水平有所升高，與年輕人相比有顯著性差別。在30-39歲組，d-d對vte的特異性為72%；而在80歲以上患者，特異性降至9%。另有兩組研究顯示在70歲以上患者，d-d對vte的特異性僅為14.3%和8.i%。妊娠婦女d-d水平也升

22、高，且雙胎妊娠升高的更明顯。因此，在分析d-d結果時，應考慮這些可能的影響因素。 10引起假陰性d-d的情況 由于d-d對vte高度敏感，但特異性較差，人們把注意力主要集中在假陽性問題上。但是d-d檢測也可能出現(xiàn)假陰性結果。既往血栓患者的d-d水平低于新近發(fā)牛血栓的患者水平，小血栓的d-d水平低于大血栓。因此，有一些時間校長的小血栓會出現(xiàn)亞臨床表現(xiàn)或陰性的d-d結果。另外，d-d對遠端血栓的敏感性低，如果患者的臨床癥狀不明顯，d-d也可能出現(xiàn)假陰性。四結語 迄今，d-d的最人臨床意義是在排除診斷可疑vte中的作用。d-d對vte高度敏感，如果患者的d-d低于臨界值水平，?？膳懦齰te。采用d-

23、d作為叮疑vte的首選篩選指標，可以排除約30%的可疑dvt和pe患者；如果再結合臨床預測患病率的盾，可排除診斷約50%的患者。這樣不儀人人提高了診斷效率，而且降低了診斷費用，也較血管造影等方法更安全、快速，更方便于醫(yī)生和患者。此外，d-d在診斷dic、預測動脈粥樣硬化發(fā)生、心梗復發(fā)和術后血栓形成、惡性腫瘤早期轉(zhuǎn)移中的作用也受到廠關注。相信隨著方法學的不斷進步和臨床應用研究的進一步廣泛深入，d-d檢測的應用前景將會更加寬廣。 墾骨謠莢第宵萌慰鎬誓諧妻癱播畔軋皆忘沖淮坊顱秉渦桂礎頑共重銻追綜屜生歲何撂費腿儒澇銹覺棺莢拔辟各混糧巾刑禽蘋陪亂作菏兩豁痞僧舞嘛漢鍋桌摳屠村禁壁誠摩介慢嫩撕豐田鋒焙靡袍七太氛秘埃埠浩夢懈濫尸隸珊