分光光度計(jì)基本原理與結(jié)構(gòu)

1、 許多化學(xué)物質(zhì)具有顏色，有些無顏色的化 合物也可以與顯色劑作用，生成有色物質(zhì)。 實(shí)踐證明，有色溶液的濃度越大，顏色越 深；濃度越小，顏色越淺。因此，可以通 過比較溶液顏色深淺的方法來確定有色溶 液的濃度，對溶液中所含的物質(zhì)進(jìn)行定量 分析?；诒容^顏色深淺對溶液進(jìn)行定量 分析的方法稱為比色分析法。 溶液為什么會有顏色，顏色又為什么與濃 度有關(guān)呢？下面就討論這個問題。 一、光的互補(bǔ)及有色物質(zhì)的顯色原理 1光的波粒二象性 光是能的一種表現(xiàn)形式，是電磁波的一種。 光在真空中以直線方式傳播，在不同的介 質(zhì)處發(fā)生反射、折射、衍射、色散、干涉 和偏振等現(xiàn)象?？捎貌ㄩL、頻率、傳播速 度等參量來描述，即光具有“

2、波動性”。 光的顏色即由光的波長決定，人眼能感覺 到的光稱為可見光，其波長在400750nrn 之間。在可見光之外是紅外光和紫外光。 同時，光也具有“粒子性”，光電效應(yīng)就 是一個很好的例子。光的粒子性理論認(rèn)為， 光是由“光子”（或稱“光量子”）所組 成。在輻射能量時，光是以一份一份的能 量E的形式輻射的，同時光被吸收時，能量 也是一份一份被吸收的。這每一份能量的 大小為h。光子的能量與波長的關(guān)系為 E=h= hc 式中E為光子的能量（J：焦耳），為頻 率，h為普朗克常數(shù)（6.6310-34JS）， c為光速，為光的波長 因此，不同波長的光，其能量不同，短波能量大，長波 能量小。 2。光的顯色原

3、理 若把某兩種顏色的光，按一定的強(qiáng)度比例混合，能夠 得到白色光，則這兩種顏色的光叫做互補(bǔ)色。圖41中 處于直線關(guān)系的兩種光為互補(bǔ)色。如綠光和紫光為互補(bǔ) 色，黃光和藍(lán)光為互補(bǔ)色等等。 各種溶液會呈現(xiàn)出不同的顏色，其原因是溶液中有色質(zhì) 點(diǎn)（分子或離子）選擇性地吸收某種顏色的光。實(shí)驗(yàn)證 明：溶液所呈現(xiàn)的顏色是其主要吸收光的互補(bǔ)色。如一 束白光通過高錳酸鉀溶液時，綠光大部分被選擇吸收， 其它的光透過溶液。從互補(bǔ)色示意圖可以看出，透過光 中只剩下紫色光，所以高錳酸鉀溶液呈紫色。 二、朗伯-比爾（Lambert-Beer）定律 溶液顏色的深淺與濃度之間的關(guān)系可以用 吸收定律來描述。它是由朗伯定律和比爾 定

4、律相結(jié)合而成的，所以叫朗伯-比爾定律。 原子吸收分光光度計(jì)也符合這個定律。 溶液對光的吸收 當(dāng)一束強(qiáng)度為I的平行單 色光照到溶液時，一部分光被溶液吸收， 一部分光被界面散射，其余的光則透過溶 液，如圖4-2所示 有： I0=I a+ I r+ I t I0-入射光強(qiáng)度 I a-吸收光強(qiáng)度 I r-反射光強(qiáng)度 I t-透射光強(qiáng)度 通常由于I r很小可忽略不計(jì)，上式可簡化為 I0=I a+ I t 透射光I t與入射光強(qiáng)度I0之比為透光率或透光度， 用T表示： T= I t/ I a 透光率的負(fù)對數(shù)稱為吸光度或光密度或消光度， 用A表示： A=lgT=lg1/T=lgI a/ I t 吸光度越大，

5、表示該物質(zhì)對光的吸收越強(qiáng)。 透光度和吸光度都是用來表示入射光被吸 收的程度，它們之間可據(jù)式相互換算。 實(shí)驗(yàn)證明，單色光經(jīng)過有色溶液時，透 過溶液的光強(qiáng)度不僅與溶液的濃度有關(guān)， 而且還與溶液的厚度以及溶液本身對光的 吸收性能有關(guān)。其規(guī)律可用下式表示為 AKCL 式中：A（E）吸光度（或叫做光密 度，也可用D表示）； K某溶液的消光（吸收）系數(shù)； C溶液的濃度； L光程，即溶液的厚度。 消光系數(shù)K是一個常數(shù)。一種有色溶液對于 一定波長（單色光）的入射光的K值具有一 定的數(shù)值。若溶液的濃度以摩爾升表示， 溶液厚度以厘米表示，則此時的K值稱為摩 爾消光系數(shù)。摩爾消光系數(shù)是有色化合物 的重要特性之一，根

6、據(jù)這個數(shù)值的大小， 可以估計(jì)顯色反應(yīng)的靈敏程度。 從上式可以看出，當(dāng)K和L不變時，光密 度E與溶液濃度C成正比關(guān)系，也可以說， 當(dāng)一束單色入射光經(jīng)過有色溶液且入射光、 消光系數(shù)和溶液厚度不變時，吸光度A是隨 著溶液濃度而變化的。 這種單色光與有色溶液的關(guān)系稱為朗伯-比 爾定律。光電比色計(jì)和分光光度計(jì)的比色 分析方法就是根據(jù)這一定律來進(jìn)行的。但 是，朗伯-比爾定律只適用于單色光和低濃 度的有色溶液。 三、朗伯-比爾定律的應(yīng)用 1等吸光度法 從朗伯-比耳定律可知，當(dāng)用同一光源照 射同一物質(zhì)的不同濃度溶液時，若吸光度 相等，則兩溶液各自的濃度和透光液層厚 度的乘積也相等。利用此關(guān)系在可見光區(qū) 用眼作

7、檢測器（目視比色法），即可求出 待測溶液的濃度。 2計(jì)算法 根據(jù)被測溶液濃度的大致范圍，先配制 一已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用同樣的方法處 理標(biāo)準(zhǔn)溶液與被測溶液，使其成色后，在 同樣的實(shí)驗(yàn)條件下用同一臺儀器分別測定 它們的吸光度。 在標(biāo)準(zhǔn)溶液中：As=KsCsLs 在待測溶液中：Ax=KxCxLx 如果測定時選用相同厚度的比色皿使L相 等，并使用同一波長的單色光，保持溫度 相同，則K也相等。將兩式相除可得 As/ Ax=Cs/Cx 由此可見，在滿足上述條件下，吸光度與 溶液成正比。如果設(shè)計(jì)一種儀器，可以測 量吸光度A值，則待測溶液的濃度即可求出 Cx=Ax/ As Cs 由于儀器的性能和實(shí)驗(yàn)環(huán)境在不

8、斷的變 化，所以在采用計(jì)算法時，必須每次都要 對標(biāo)準(zhǔn)液和被測液進(jìn)行測量，然后利用上 式進(jìn)行計(jì)算，否則會帶來較大的測量誤差。 由于一般光電比色計(jì)在結(jié)構(gòu)上有不少偏 離朗伯一比耳定律的地方，故欲得到較準(zhǔn) 確的結(jié)果，常采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。 3標(biāo)準(zhǔn)曲線法 這種方法分以下幾步： （1）先配制五種以上標(biāo)準(zhǔn)濃度的溶液。 （2）測出每種溶液的吸光度A。 （3）做AC標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖43所示。 有了標(biāo)準(zhǔn)工作曲線便可對溶液進(jìn)行測量。 在同樣的條件下，用儀器測出A后，查標(biāo)準(zhǔn) 曲線即可得被測溶液的濃度值Cx。 由于光電比色計(jì)工作在可見光區(qū)，只適合在 有限個波長下測量，且波長的半寬度大。因 此，它不能滿足不同分析工作的需要。

9、其次， 光電比色計(jì)的靈敏度也低。為了克服以上不 足，便發(fā)展了性能更好的分析方法：紫外- 分光光度法。它利用單色器分光，其單色光 純度高，波長范圍寬，并可連續(xù)變化，解決 了光電比色計(jì)存在的問題。 一、分光光度計(jì)基本原理和結(jié)構(gòu) 分子，包括雙原子分子的光譜，要比原子 光譜復(fù)雜得多。這是由于在分子中，除了 電子相對于原子核的運(yùn)動外，還有核間相 對位移引起的振動和轉(zhuǎn)動。這三種運(yùn)動能 量都是量子化的，并對應(yīng)有一定的能級。 分子的總能量可以認(rèn)為是這三種能量的總 和，即 E=E。E振E轉(zhuǎn) 當(dāng)用頻率為的電磁波照射分子，而該分子 的較高能級與較低能級之差E恰好等于該 電磁波的能量 h時，即有 E=h 這里，h為普

10、朗克常數(shù)。此時，在微觀上出 現(xiàn)分子由較低的能級躍遷到較高的能級， 在宏觀上則表現(xiàn)為透射光的強(qiáng)度變小。若 用一連續(xù)輻射的電磁波照射分子，將照射 前后光強(qiáng)度的變化轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，并記?下來，就可以得到一張光強(qiáng)度變化對波長 的關(guān)系曲線圖分子吸收光譜圖。 紫外-可見區(qū)的分子吸收光譜一般是譜帶較 寬的帶狀光譜，它是由于電子能級躍遷而 產(chǎn)生的光譜，因此又叫做電子光譜。 分子吸收光譜與物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)有關(guān)， 吸光度的大小與物質(zhì)的含量有關(guān)，我們利 用吸收光譜的形狀和吸收程度的大小即可 對物質(zhì)進(jìn)行定性和定量的分析。這種分析 方法叫做分光光度法。 二、分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu) 與光電比色計(jì)相比，在結(jié)構(gòu)上分光光度計(jì) 用單

11、色器代替了濾光片，其它部分兩者比 較相似。 （）單色器：單色器是指一個光學(xué)系統(tǒng)，它 比濾光片能更有效地提供帶寬窄的單色光。單 色器的主要組件是玻璃棱鏡、復(fù)合濾光片或光 柵。來自光源的光線，可直接通過單色器的狹 縫，照到分光部件上。單色器的效率比普通濾 光片高。在紫外和可見光范圍內(nèi)，半寬度不超 過1nm。 1棱鏡單色器 從幾何光學(xué)我們知道，當(dāng)一束光從一種介質(zhì)射 到另一種介質(zhì)時，在界面會發(fā)生折射和反射， 如圖4-3所示。設(shè)入射角為i，折射角為，則其 折射率n為: n = Sini/sin 不同的光學(xué)材料具有不同的折射率，這是 眾所周知的。即使使用同一種光學(xué)材料， 以相同的人射角照射，若波長不同，得

12、到 的折射角也不一樣。透明物質(zhì)的折射率n和 入射光波長的關(guān)系可以用下列經(jīng)驗(yàn)式表示： n AB/2C/4 式中A、B、C的數(shù)值與物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)。 從式中可以看出，波長越長，折射率越小。 一束復(fù)合光進(jìn)入棱鏡，由于不同波長的光， 其折射率不同，通過棱鏡后，復(fù)色光就按 不同的波長分開來了，如圖44所示。 實(shí)驗(yàn)證明，棱鏡的色散具有非線性，即 譜線彎曲；不同波長區(qū)域色散效果不同， 紅端色散差，紫端色散較好。雖然在實(shí)際 應(yīng)用中的棱鏡單色器與圖示的不盡相同， 然而它們的工作原理是一樣的。 2光柵單色器 衍射光柵也可用作單色器。衍射光柵是由 一系列刻劃在高光潔度反射表面上溝紋組 成的。溝紋排列異常密集，每英寸長

13、度上 有15000或30000條。將光柵放在一平行光 束里，光柵的一面被照亮，這一面可看作 是塊非常小的反射鏡。 從溝紋反射鏡反射出的光線相重疊，發(fā)生 干涉，如圖45所示。另一方面，如果在 光線方向上的溝紋條數(shù)是波長的整數(shù)倍時， 光線就被溝紋分開，這種波就是同向的， 射線被反射。當(dāng)它不是波長的整數(shù)倍時， 光線被抵消，沒有反射現(xiàn)象。改變光線照 到光柵上的角度，就可以改變反射光的波 長。 射線波長與反射角的關(guān)系，如下式： m = 2dsin 式中，d 是溝紋之間的距離，是光柵常數(shù)； m是干涉價數(shù)。當(dāng)m=1時，為一階譜； m=2時，為二階譜。 光柵的分辨能力取決于它的mN值，N是光 柵上總溝紋數(shù)或總

14、條數(shù)。條數(shù)多時，一階 譜的分辨力高。與棱鏡相比，光柵的分辨 能力更高些，并能用于所有譜段范圍，光 柵的色散呈線性。 光柵的表面鍍有鋁膜，質(zhì)地松軟，極易擦 傷。所以在維護(hù)時嚴(yán)禁用任何擦拭物擦拭， 更不能用手去觸摸，否則，會造成永久損 壞。也不準(zhǔn)用嘴去吹光柵上的灰塵。光柵 萬一臟了，可以用洗耳球吹去表面上的灰 塵。如不奏效，可以在光柵上均勻地涂上 一層粘膠棉（俗稱火棉膠）液，等膠液干 了以后，將液膜輕輕揭下。此法可以將光 柵上的臟物去掉?，F(xiàn)在有的光柵已鍍有保 護(hù)膜。 （二）準(zhǔn)直鏡和聚光鏡：準(zhǔn)直鏡用來減小 光束的尺寸并提供平行光，其多由凹面鏡 制成。凹面鏡的反射鏡面大都是鍍鋁的。 在可見光區(qū)，鋁膜外

15、面常常再鍍上一層 SiO2保護(hù)層。但在紫外區(qū)，為了保證較高 的反射效率。常常不鍍此SiO2保護(hù)膜，這 種準(zhǔn)直鏡的維護(hù)方法與光柵相同。 聚光鏡為一凸透鏡。點(diǎn)光源發(fā)出的光， 經(jīng)聚光鏡后，變成平行光，然后再進(jìn)入棱 鏡（或光柵）色散系統(tǒng)。色散后的平行光 再經(jīng)聚光鏡會聚后，照射到比色皿上。 三、分光光度計(jì)的光學(xué)系統(tǒng)簡介 分光光度計(jì)的光學(xué)系統(tǒng)有許多類型，不 同類型的光學(xué)系統(tǒng)，對測量方法和結(jié)果都 有一定影響，下面，我們介紹幾種常用分 光光度計(jì)的光學(xué)系統(tǒng)。 （）單光束光學(xué)系統(tǒng)：它是分光光度計(jì) 中最簡單的和應(yīng)用最普遍的一種。它的特 點(diǎn)是只有一條光束。通過交換參比和樣品 的位置，使其分別進(jìn)入光路。在參比（溶 劑）

16、進(jìn)入光路時，調(diào)零。然后將樣品進(jìn)入 光路的信號和參比信號進(jìn)行比較，就可在 顯示器上讀出樣品的透過率和吸光度。結(jié) 構(gòu)如圖46所示。 單光束分光光度計(jì)由于在每個波長都需要變換參 比和樣品的位置，所以只能手動，不能掃描吸收 光譜。它的結(jié)構(gòu)比較簡單，使用也有一定限制， 但如配置程序控制和打印裝置，則對一些常規(guī)的 定量測定（如醫(yī)院化驗(yàn)室）還是比較適用的。 國產(chǎn)754型、WFDSA型、WFZ800D型分光 光度計(jì)，以及國外的貝克曼DU型、島津 QC50、 QR50、日立 EPU2A型、希爾格 H700型、C 4型等都屬于這種類型的儀器。 （二）雙光束光學(xué)系統(tǒng)：單光束分光光度 計(jì)雖簡單價廉，但有如下缺陷：即它

17、要求 在整個測定過程中光源必須穩(wěn)定不變；另 外光電轉(zhuǎn)換器和放大器如有不規(guī)則的特性 會給測量結(jié)果帶來誤差。為克服上述缺點(diǎn)， 設(shè)計(jì)了雙光束分光光度計(jì)。其結(jié)構(gòu)示意圖 如圖4-7所示。 雙光束分光光度計(jì)的光路設(shè)計(jì)基本與單光 束相似。差別在于雙光束分光光度計(jì)的單 色器的出射狹縫和樣品室之間加了一個光 束分裂器或斬波器，它的作用是以一定頻 率把一個光束交替分成兩路。使一路經(jīng)過 參比溶液，另一路經(jīng)過樣品溶液，然后由 一個檢測器交替接收（或兩個匹配檢測器 分別接收）參比信號和樣品信號。接收的 光信號轉(zhuǎn)變成電信號后，由前置放大器放 大，最后由顯示系統(tǒng)顯示透光度或吸光度。 為了保持參考光路在不同的波長有恒定光 電

18、流輸出，常采用兩種設(shè)計(jì)方法： 一種是采用光電倍增管，電壓恒定，但狹 縫寬度隨波長而變化；另一種是采用狹縫 寬度恒定，但光電倍增管電壓隨波長而變 化。后者便于在相同測定條件下對一些數(shù) 據(jù)進(jìn)行比較，雙光束方式測定程序大大簡 化，不僅可直接讀數(shù)、記錄結(jié)果和數(shù)字顯 示，而且可進(jìn)行“全波段自動掃描”，實(shí) 現(xiàn)自動化分析，直接打印出分析結(jié)果，再 加上附件的設(shè)置，更加擴(kuò)展了它的使用范 圍。因此雙光束分光光度計(jì)發(fā)展很快，使 用更加普遍，比單光束分光光度計(jì)要優(yōu)越 得多。 雙光束分光光度計(jì)種類很多，大致可分為中低 檔和高檔兩類。中低檔的如上海第三分析儀器廠 的710型（自動記錄）、730型（數(shù)字顯示）、 740型。

19、日本島津公司的UV260，日立公司的 U1000/2000，Unicam公司的Pu-8600型， Varian公司的DMS系列，Perkinelmer公司的3、 15、17型等。高檔的一般都采用微機(jī)控制操作 和處理數(shù)據(jù)，既可記錄、打印，又有屏幕顯示。 且大多采用雙單色器，使分辨率提高，雜散光減 少此種類型的儀器如 PerkinElmer公司的 Lambda9型，Beckman公司的DU60、70型， PyEUnicam公司的Pu8800型，島津公司的 UV265型，日立公司的U3200U3400型， Varian公司的22002300系列等。 （三）雙波長雙光束分光光度計(jì)：由于單、雙 光束分光

20、光度計(jì)都不能克服因非特征吸收信號 （如試液混濁引起的散射，比色皿-空氣界面與 比色皿-溶液界面的折射差別等）的影響而帶來 測量中的誤差。為此提出了雙波長測定法，用雙 波長分光光度計(jì)來測定高濃度試樣的混濁試樣以 及多組分混合物的定量分析具有很大的優(yōu)越性， 提高了靈敏度和準(zhǔn)確度。Chance實(shí)驗(yàn)室在1951 年首先設(shè)計(jì)了世界上第一臺雙波長分光光度計(jì)。 以后Aminco-Bow-man公司、日立公司和島津公 司等先后研制設(shè)計(jì)了各種類型的雙波長分光光度 計(jì)，如156型、365型、556型和557型；UV300 型、UV-3000型等。 從圖48可知雙波長分光光度計(jì)的基本原理是： 從同一個光源發(fā)出的光分成兩束，分別經(jīng)過兩個 單色器，得到兩束具有不同波長（1和2）的單 色光，利用切光器使這兩束光以一定的時間間隔 交替地照射到同一個試樣池。經(jīng)過光電倍增管和 電子控制系統(tǒng)，在記錄器上顯示出兩束光（1和 2）的吸光度差A(yù)，即A=A1A。只要1 和2選擇得適當(dāng)（被測物在一個波長上有最大吸 收峰，在另一個波長上則不吸收或很少吸收；而 非檢測物對兩種波長的吸收是相同的），A就 為消除了非特征吸