可見分光光度法和紫外分光光度法

1、1 Visible Spectrophotometry and Ultraviolet Spectrophotometry 內容提要 1. 物質的吸收光譜 2. 分光光度法基本原理 透光率和吸光度 LambertBeer定律 3. 可見分光光度法 分光光度計 測定方法 4. 提高測量靈敏度和準確度的方法 5. 紫外分光光度法簡介 教學基本要求 1. 掌握分光光度法的基本原理，LambertBeer定 律以及透光率、吸光度、摩爾吸光系數等基本 概念及相互關系。 2. 熟悉物質對光的選擇性吸收，吸收光譜的意義； 可見分光光度法的測定方法標準曲線法和標 準對照法。 3. 了解光的基本性質，光的加和性

2、；分光光度計的 基本構造；提高測量靈敏度和準確度的方法； 紫外分光光度法的一般概念。 第一節(jié) 物質的吸收光譜 一、物質對光的選擇性吸收 n光照射某物質，物質能夠吸收光，使原有的 基態(tài)轉為激發(fā)態(tài)，只有當分子的能量(h)與被 照射物質粒子的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量之差(E) 相等時才能被吸收。 M(基態(tài))+ h M*(激發(fā)態(tài)) n物質對光的吸收具有選擇性，若溶液選擇性 地吸收了某種顏色的光，則溶液呈吸收光的 互補光。 第一節(jié) 物質的吸收光譜 互補色光示意圖互補色光示意圖 第一節(jié) 物質的吸收光譜 二、物質的吸收光譜 n將不同波長的單色光依次通過有色溶液，測 量溶液的吸光度A(absorbance)。 n以波

3、長為橫坐標，吸光度A為縱坐標作圖， 得吸收曲線，或稱吸收光譜。 n吸收光譜中，吸光度最大處的波長為最大吸 收波長，用max表示。 n一般，max是定性鑒別物質的基礎 。 n不同濃度的溶液，max不變，濃度與峰值成正 比，這是進行定量分析的依據。 第一節(jié) 物質的吸收光譜 三(鄰二氮菲)合鐵(II)離子的吸 收光譜圖（absorptionspectrum) max=510nm 不同濃度的溶液，max不變， 濃度與峰值成正比。 第二節(jié) 分光光度法基本原理 一、透光率 (transmittance)和 吸光度(absorbance) n入射光強度I0，吸收光 強度Ia，透過光強度It， 反射光強度為I

4、r I0 Ia + It + Ir n被測溶液和參比溶液的 吸收池同樣材料和厚度， 反射光強度影響相互抵 消，上式簡化為 I0 Ia + It 一、透光率和吸光度 n透射光的強度It與入射光強度I0之比稱為透光 率(transmittance)，用T表示 n透光率的負對數稱為吸光度，用符號A表示。 A愈大，溶液對光的吸收愈多。 0 t I I =T t 0 lglg I I =T-=A 第二節(jié) 分光光度法基本原理 二、LambertBeer定律 nLambert- Beer定律： A =bc 溶液厚度b，單位cm；濃度c，單位molL-1； 摩爾吸光系數(molar absorptivity

5、) 單位:Lmol -1cm-1 n若用質量濃度代替c A ab 質量吸光系數(apercentange absorptivity) 單位:Lg -1cm-1 na和可通過下式相互換算 aM 第二節(jié) 分光光度法基本原理 當溶液組成表度為10 gL-1時，吸光系數可用 比吸光系數 表示， 與和a的關系分別為： % cm E 1 1 % cm E 1 1 M E cm 10 %1 1 %1 1 1 . 0 cm E 第二節(jié) 分光光度法基本原理 透光率T與溶液濃度c (或液層厚度b)之間的 關系也可以以指數函數關系來表示： - lgT bc T 10-bc 第二節(jié) 分光光度法基本原理 應用Lambe

6、rtBeer定律時，需注意以下幾點： LambertBeer定律僅適用于單一波長的單色光。 入射光的波長范圍越寬，則測定結果越容易偏 離LambertBeer定律。 吸收過程中各物質間無相互作用，但各物質的 吸光度具有加和性。即 A Aa+ Ab + Ac + 入射光波長不同時，摩爾吸光系數也不同。摩 爾吸光系數越大，溶液對入射光的吸收就越強， 測定的靈敏度就越高。 分光光度法僅適用于微量組分的測定。(或a)確 定是在低濃度下測定吸光度A，通過計算求出。 第二節(jié) 分光光度法基本原理 例13-1 已知某化合物的相對分子質量為251， 將 此 化 合 物 用 乙 醇 作 溶 劑 配 成 濃 度 為

7、 0.150mmolL-1的溶液，在480nm波長處用 2.00cm吸收池測得透光率為39.8%，求該化 合物在上述條件下的摩爾吸光系數及質量吸 光系數a。 第二節(jié) 分光光度法基本原理 解： 由LambertBeer定律可得 已知 c 0.15010-3molL-1，b 2.00cm， T 0.398 代入 cb T cb A lg 113 14 cmmolL101.33 2.00cmLmol101.50 lg0.398 )(480nm cb A 11 1 113 cmg5.30L mol251g cmmolL101.33 (480nm) (480nm) M a 第二節(jié) 分光光度法基本原理 例

8、 測試酶與腺苷酸(AMP)體系的吸光度 如下：A(280nm) 0.46， A(260nm) 0.58 試計算每一組分的濃度。 已知：酶的(280nm) 2.96104Lmol-1cm-1 (260nm) 1.52104Lmol-1cm-1 AMP的(280nm) 2.4103Lmol-1cm-1 (260nm) 1.5104Lmol-1cm-1 吸收池厚度為1.00cm。 第二節(jié) 分光光度法基本原理 解：設酶和AMP的濃度分別為y和z 因吸收光的加和性 為260nm 0.58 1.521041.00 y+1.51041.00 z 為280nm 0.46 2.961041.00 y+2.410

9、31.00 z 解方程得：y 1.410-5 （molL1） z 2.510-5 （molL-1） 即 酶的濃度為1.410-5 molL1， AMP的濃度為2.510-5 molL-1 。 第二節(jié) 分光光度法基本原理 第三節(jié) 可見分光光度法 一、分光光度計 (spectrophotomete ) n主要部件 光源 單色器 檢測器 吸收池 指示器 光源：鎢燈，發(fā)出3203200nm的連續(xù)光譜， 單色器：以棱鏡或光柵分光，提供單色光。 吸收池：分光光度計中用來盛放溶液的容器。 檢測器：通過吸收池的光轉換為光電流，再 經放大輸入指示器，然后顯示。 指示器：顯示A或T 。 (a)自準式單色器示意圖

10、(b)棱鏡對光的色散作用 (c)平面反射光柵 第三節(jié) 可見分光光度法 二、測定方法 標準曲線法 n取系列濃度標準溶液， 測定吸光度A，作吸光 度A對溶液濃度c的圖， 得過坐標原點的直線。 1.在相同條件下，測量被 測溶液的吸光度，在標 準曲線上查得溶液度。 維生素B12的標準曲線 第三節(jié) 可見分光光度法 標準對照法 n預先配制一個與待測液濃度相接近的標準溶 液(其濃度用cs表示)，測得其吸光度為As，再 測定待測液的吸光度Ax，則待測液濃度cs可從 下式求得 s s c A A c x x 第三節(jié) 可見分光光度法 第四節(jié) 提高測量靈敏度和準確度的方法 一、分光光度法的誤差 儀器測定誤差 n光電

11、管靈敏性差、光源 不穩(wěn)定及讀數不準。 n透光率誤差T引起濃度 誤差c： 1.透光率20% 65%，A 為0.20.7時，濃度相對 誤差較小。 測量誤差和透光率的關系 TT T c c lg 0.434 溶液偏離Beer定律 偏離Beer定律，A-c 曲線彎曲。主要原 因： 化學因素 吸光物 質發(fā)生解離、締合、 溶劑化等現象； 光學因素 復色光 引起對Beer定律 的偏離。 主觀誤差 兩種不同吸光系數的混 合光對Beer定律的偏離 第四節(jié) 提高測量靈敏度和準確度的方法 二、提高測量靈敏度和準確度的方法 選擇適當的顯色劑 靈敏度高 選擇性好 顯色劑在測定波長處無明顯吸收 反應生成的有色化合物組成恒定。 第四節(jié) 提高測量靈敏度和準確度的方法 選擇合適的測定條件 入射光波長的選擇 顯色劑的用量 溶液的酸度 顯色時間和溫度 空白溶液的選擇 溶劑空白 試劑空白 試樣空白 共存離子的干擾及其 消除 控制顯色反應的酸 度 加入掩蔽劑 分離干擾離子 第四節(jié) 提高測量靈敏度和準確度的方法 第五節(jié) 紫外分光光度法簡介 一、752型分光光度計 n紫外分光光度法適用測定在近紫外區(qū) (200380nm)有特征吸收的物質。 n752型分光光度計裝有可轉換的適用于可見分 光光度法的鎢燈光源和適用于紫外分光光度 法的氫燈光源(發(fā)射20040