第15章 分離分析法導(dǎo)論

1、1 fundamental of chromatograph analysis 2 第一節(jié)概述第一節(jié)概述 n通常將先分離后分析先分離后分析的儀器分析方法稱為分離 分析法； n試樣中組分性能上的差異性能上的差異：吸附、分配、交換、 遷移速率等。 n包括色譜（氣相色譜氣相色譜、高效液相色譜高效液相色譜）、高效 毛細管電泳法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。 3 色譜法的特點色譜法的特點 （1 1）分離效率高分離效率高 復(fù)雜混合物，有機同系物、異構(gòu)體。手性異構(gòu)體。 （2 2）靈敏度高靈敏度高 可以檢測出g.g-1(10-6)級甚至ng.g-1(10-9)級的物質(zhì)量。 （3 3）分析速度快分析速度快 一般在幾分鐘

2、或幾十分鐘內(nèi)可以完成一個試樣的分析。 （4 4）應(yīng)用范圍廣應(yīng)用范圍廣 氣相色譜：沸點低于400的各種有機或無機試樣的分析。 液相色譜：高沸點、熱不穩(wěn)定、生物試樣的分離分析。 不足之處：不足之處： 被分離組分的定性較為困難。 4 第二節(jié)第二節(jié) 色譜分析法及其基本概念色譜分析法及其基本概念 一一. .色譜分析法簡介色譜分析法簡介 固定相固定相； 流動相流動相。 5 色譜法色譜法 當混合物隨流動相流經(jīng)色譜柱時，就會與固定相當混合物隨流動相流經(jīng)色譜柱時，就會與固定相發(fā)生作用發(fā)生作用， 由于各組分性質(zhì)結(jié)構(gòu)上的由于各組分性質(zhì)結(jié)構(gòu)上的差異差異，與固定間發(fā)生作用力的大小、強，與固定間發(fā)生作用力的大小、強 弱不

3、同，使得各組分被固定相弱不同，使得各組分被固定相保留時間保留時間不同，從而按一定次序由不同，從而按一定次序由 固定相中流出。固定相中流出。 與適當?shù)闹髾z測方法結(jié)合，實現(xiàn)混合物中各組分的分離與檢測；與適當?shù)闹髾z測方法結(jié)合，實現(xiàn)混合物中各組分的分離與檢測； 兩相兩相及及兩相的相對運動兩相的相對運動構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ)。構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ)。 6 二二. .色譜法分類色譜法分類 (1)(1)氣相色譜氣相色譜：流動相為流動相為氣體氣體（稱為（稱為載氣載氣）。）。 按按分離柱分離柱不同可分為：不同可分為：填充柱色譜填充柱色譜和和毛細管柱色譜毛細管柱色譜； 按按固定相固定相的不同又分為：的不同又分為：氣固

4、色譜氣固色譜和和氣液色譜氣液色譜 7 液相色譜液相色譜 (2)(2)液相色譜液相色譜：流動相為流動相為液體液體（也稱為淋洗液）。（也稱為淋洗液）。 按固定相的不同分為：液固色譜和液液色譜。按固定相的不同分為：液固色譜和液液色譜。 8 (3)(3)其他色譜方法其他色譜方法 薄層薄層色譜和色譜和紙紙色譜：色譜： 比較簡單的色譜方法。比較簡單的色譜方法。 凝膠凝膠色譜法色譜法： 超臨界超臨界色譜色譜: : CO2流動相。流動相。 高效毛細管高效毛細管電泳電泳: : 九十年代快速發(fā)展、特九十年代快速發(fā)展、特 別適合生物試樣分析分離的別適合生物試樣分析分離的 高效分析儀器。高效分析儀器。 9 三、色譜流

5、出曲線與術(shù)語三、色譜流出曲線與術(shù)語 1.1.色譜圖色譜圖 無試樣通過檢測器時，檢無試樣通過檢測器時，檢 測到的信號即為基線。色譜分測到的信號即為基線。色譜分 析時，混合物中各組分經(jīng)色譜析時，混合物中各組分經(jīng)色譜 柱分離后，隨流動相依次流出柱分離后，隨流動相依次流出 色譜柱，經(jīng)檢測器把各組分的色譜柱，經(jīng)檢測器把各組分的 濃度信號轉(zhuǎn)變成電信號，再記濃度信號轉(zhuǎn)變成電信號，再記 錄下來。錄下來。 色譜圖即檢測器產(chǎn)生的信色譜圖即檢測器產(chǎn)生的信 號強度對時間號強度對時間t 作的圖。作的圖。 10 2.2.基線基線 無試樣通過檢測器時，檢無試樣通過檢測器時，檢 測到的信號即為基線。測到的信號即為基線。 3.

6、3.峰高、峰寬及面積峰高、峰寬及面積 11 4.4.色譜保留值色譜保留值 是色譜定性分析的依據(jù)。是色譜定性分析的依據(jù)。 兩套參數(shù)：兩套參數(shù)：時間時間/體積體積 （1）時間表示的保留值）時間表示的保留值 保留時間（保留時間（tR）：）：組分組分 從進樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時從進樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時 所需的時間；所需的時間； 死時間（死時間（t ）： ）：不能被不能被 固定相滯留的組分，從進樣到出固定相滯留的組分，從進樣到出 現(xiàn)峰最大值所需的時間現(xiàn)峰最大值所需的時間； 調(diào)整保留時間調(diào)整保留時間（tR）：）： tR= tRtM 12 （2）體積表示的保留值）體積表示的保留值 保留體積（保留體積（

7、VR）：）： VR = tRF0 F0為柱出口處的載氣流量，為柱出口處的載氣流量， 單位：單位：m L / min。 死體積（死體積（VM）：）： VM = tM F0 調(diào)整保留體積調(diào)整保留體積(VR)： V R = VR VM 13 （3） 相對保留值相對保留值2,1 組分組分2與組分與組分1調(diào)整保留值之比：調(diào)整保留值之比： r21 = t R2 / t R1= V R2 / V R1 相對保留值只與柱溫相對保留值只與柱溫 和固定相性質(zhì)有關(guān)，與其和固定相性質(zhì)有關(guān)，與其 他色譜操作條件無關(guān)，它他色譜操作條件無關(guān)，它 表示了固定相對這兩種組表示了固定相對這兩種組 分的選擇性。分的選擇性。 14

8、1. 1. 氣相色譜分離過程氣相色譜分離過程 當試樣由載氣攜帶進入色當試樣由載氣攜帶進入色 譜柱與固定相接觸時，被固定譜柱與固定相接觸時，被固定 相溶解或吸附相溶解或吸附; ; 隨著載氣的不斷通入，被隨著載氣的不斷通入，被 溶解或吸附的組分又從固定相溶解或吸附的組分又從固定相 中揮發(fā)或脫附中揮發(fā)或脫附; ; 揮發(fā)或脫附下的組分隨著揮發(fā)或脫附下的組分隨著 載氣向前移動時又再次被固定載氣向前移動時又再次被固定 相溶解或吸附相溶解或吸附; ; 隨著載氣的流動，溶解、隨著載氣的流動，溶解、 揮發(fā)，或吸附、脫附的過程反揮發(fā)，或吸附、脫附的過程反 復(fù)地進行。復(fù)地進行。 四、色譜分離過程四、色譜分離過程 1

9、5 2. 2. 分配系數(shù)分配系數(shù)（ partion factor） K 組分在固定相和流動相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、組分在固定相和流動相間發(fā)生的吸附、脫附，或溶解、 揮發(fā)的過程叫做揮發(fā)的過程叫做分配過程分配過程。在一定溫度下，組分在兩相間。在一定溫度下，組分在兩相間 分配達到平衡時的濃度（單位：分配達到平衡時的濃度（單位：g / mL）比，稱為分配系數(shù)，）比，稱為分配系數(shù)， 用用K 表示，即：表示，即： M s c c K 組分在流動相中的濃度組分在流動相中的濃度 組分在固定相中的濃度組分在固定相中的濃度 16 3.3.分配比分配比 （partion radio）k 在實際工作中，也常用分

10、配比來表征色譜分配平在實際工作中，也常用分配比來表征色譜分配平 衡過程。分配比是指在一定溫度下，組分在兩相間衡過程。分配比是指在一定溫度下，組分在兩相間 分配達到平衡時的質(zhì)量比：分配達到平衡時的質(zhì)量比： M s m m k 組組分分在在流流動動相相中中的的質(zhì)質(zhì)量量 組組分分在在固固定定相相中中的的質(zhì)質(zhì)量量 分配比也稱：分配比也稱： 容量因子容量因子(capacity factor)；容量比；容量比(capacity factor)； 17 4. 保留比保留比Rs與分配比與分配比k的關(guān)系的關(guān)系 u u R S S k m m mm m RS 1 1 1 1 M s Ms s 若組分和流動相通過長

11、度為若組分和流動相通過長度為L的分離柱，需要的時間分別為的分離柱，需要的時間分別為tR和和tM，則：，則： u L t u L t M S R ; 由以上各式，可得：由以上各式，可得： tR = tM(1+k) M R M MR t t t tt k 18 第三節(jié)色譜分析的基本理論第三節(jié)色譜分析的基本理論 色譜理論需要解決的問題：色譜分離過程的熱力學和動色譜理論需要解決的問題：色譜分離過程的熱力學和動 力學問題。影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效力學問題。影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效 與分離度的評價指標及其關(guān)系。與分離度的評價指標及其關(guān)系。 組分保留時間為何不同？色譜峰為

12、何變寬？組分保留時間為何不同？色譜峰為何變寬？ 組分保留時間組分保留時間：色譜過程的熱力學因素控制；：色譜過程的熱力學因素控制； （組分和固定液的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)）（組分和固定液的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)） 色譜峰變寬色譜峰變寬：色譜過程的動力學因素控制；：色譜過程的動力學因素控制； （兩相中的運動阻力，擴散）（兩相中的運動阻力，擴散） 兩種色譜理論：兩種色譜理論：塔板理論塔板理論和和速率理論速率理論； 19 一、基本理論一、基本理論 1.1.塔板理論塔板理論（plate theory） - 柱分離效能指標柱分離效能指標 是一種半經(jīng)驗理論是一種半經(jīng)驗理論； 20 2. 2. 速率方程（也稱范速率方程（也稱范. .

13、弟姆特方程式）弟姆特方程式） -影響影響 柱效的因素柱效的因素 H = A + B/u + Cu H：理論塔板高度；：理論塔板高度； u：載氣的線速度：載氣的線速度(cm/s)； A：渦流擴散項；：渦流擴散項； B/u：分子縱向擴散項：分子縱向擴散項 Cu：傳質(zhì)阻力項。：傳質(zhì)阻力項。 減小減小A、B、C三項可提高柱效；存在著最佳流速。三項可提高柱效；存在著最佳流速。 A、B、C三項各與哪些因素有關(guān)？三項各與哪些因素有關(guān)？ 21 A. 渦流擴散項 n原因：組分碰到固定相顆粒，形成垂直方向“渦流”； n結(jié)果：導(dǎo)致到達檢測器有先有后，色譜峰形變寬； n改善：提高固定相的顆粒細度和均勻性及填充均勻性

14、（與流動相性質(zhì)、流動相速率無關(guān)）； n注：主要描述液相色譜， n對于空心毛細管柱，A=0 22 B/u 分子擴散項 n原因：組分在柱子中的濃度梯度差濃度梯度差； n結(jié)果：組分分子不能同時到達檢測器，峰形變 寬； n改善：高流速載氣，較低柱溫，相對分子量較 大的氣體作載氣。 n注：主要描述氣相色譜，且氣細管柱大于填充 柱。 23 Cu 傳質(zhì)阻力項 n組分在氣相和液相兩相間進行反復(fù)分配時，遇到阻組分在氣相和液相兩相間進行反復(fù)分配時，遇到阻 力。力。 n傳質(zhì)阻力包括傳質(zhì)阻力包括流動相傳質(zhì)阻力流動相傳質(zhì)阻力Cm和和固定相傳質(zhì)阻力固定相傳質(zhì)阻力 Cs，液相傳質(zhì)阻力大于氣相傳質(zhì)阻力。，液相傳質(zhì)阻力大于氣相

15、傳質(zhì)阻力。 n即：即： C =（Cm + Cs） 24 3. 3. 載氣流速與柱效載氣流速與柱效- -最佳流速（氣相色譜）最佳流速（氣相色譜） C B A2 載氣流速高時：載氣流速高時： 傳質(zhì)阻力項是影響柱效傳質(zhì)阻力項是影響柱效 的主要因素，的主要因素，流速流速 ，柱效，柱效 , , 右圖曲線的右邊。右圖曲線的右邊。 載氣流速低時：載氣流速低時： H - u曲線與最佳流速：曲線與最佳流速： 由于流速對這兩項完全相反的作用，流速對柱效的總影由于流速對這兩項完全相反的作用，流速對柱效的總影 響使得存在著一個響使得存在著一個最佳流速最佳流速值（即以塔板高度值（即以塔板高度H H對應(yīng)載氣流速對應(yīng)載氣流

16、速 u u作圖，曲線最低點的流速即為作圖，曲線最低點的流速即為最佳流速。）最佳流速。） 分子擴散項成為影響柱效的分子擴散項成為影響柱效的 主要因素，主要因素，流速流速 ，柱效，柱效 ， 右圖曲線的左邊。右圖曲線的左邊。 C B u最佳= H最小= 25 4. 速率理論的要點速率理論的要點 (1) (1)組分分子在柱內(nèi)運行的組分分子在柱內(nèi)運行的多路徑與渦流擴散多路徑與渦流擴散、濃度梯度所、濃度梯度所 造成的造成的分子擴散分子擴散及及傳質(zhì)阻力傳質(zhì)阻力使氣液兩相間的分配平衡不能瞬使氣液兩相間的分配平衡不能瞬 間達到等因素是造成色譜峰擴展柱效下降的主要原因。間達到等因素是造成色譜峰擴展柱效下降的主要原

17、因。 (2)通過選擇適當?shù)墓潭ㄏ嗔６?、載氣種類、液膜厚度及載通過選擇適當?shù)墓潭ㄏ嗔６?、載氣種類、液膜厚度及載 氣流速可提高柱效。氣流速可提高柱效。 (3) (3)速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導(dǎo)。 闡明了流速和柱溫對柱效及分離的影響。闡明了流速和柱溫對柱效及分離的影響。 (4) 各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴散項的影各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴散項的影 響減小，使柱效提高，但同時傳質(zhì)阻力項的影響增大，又使響減小，使柱效提高，但同時傳質(zhì)阻力項的影響增大，又使 柱效下降；柱溫升高，有利于傳質(zhì)，但又加劇了分子擴散的柱

18、效下降；柱溫升高，有利于傳質(zhì)，但又加劇了分子擴散的 影響，選擇最佳條件，才能使柱效達到最高。影響，選擇最佳條件，才能使柱效達到最高。 26 三、三、分離度分離度 又稱分辨率，為相鄰兩色譜峰的保留值之差與兩峰又稱分辨率，為相鄰兩色譜峰的保留值之差與兩峰 寬度總和的一半的比值。寬度總和的一半的比值。 塔板理論和速率理論都難以描述難分離物質(zhì)對的實際分離程度。塔板理論和速率理論都難以描述難分離物質(zhì)對的實際分離程度。 即柱效為多大時，相鄰兩組份能夠被完全分離。即柱效為多大時，相鄰兩組份能夠被完全分離。 難分離物質(zhì)對的分離度大小受色譜過程中兩種因素的綜合影響：難分離物質(zhì)對的分離度大小受色譜過程中兩種因素的

19、綜合影響： 保留值之差保留值之差色譜過程的熱力學因素；色譜過程的熱力學因素； 區(qū)域?qū)挾葏^(qū)域?qū)挾壬V過程的動力學因素。色譜過程的動力學因素。 色譜分離中的四種情況如圖所示：色譜分離中的四種情況如圖所示： 27 討論：討論： 色譜分離中的四種情況的討論：色譜分離中的四種情況的討論： 柱效較高，柱效較高，K(分配系數(shù)分配系數(shù))較大較大,完全分離；完全分離； K不是很大，柱效較高，峰較窄，基本上完全分離；不是很大，柱效較高，峰較窄，基本上完全分離； 柱效較低，柱效較低，K較大較大,但分離的不好；但分離的不好； K小，柱效低，分離效果更差。小，柱效低，分離效果更差。 28 一、色譜定性鑒定方法一、色譜定

20、性鑒定方法 利用保留值定性利用保留值定性：通過對比試樣中具有與純物質(zhì)相同保通過對比試樣中具有與純物質(zhì)相同保 留值的色譜峰，來確定試樣中是否含有該物質(zhì)及在色譜圖中留值的色譜峰，來確定試樣中是否含有該物質(zhì)及在色譜圖中 的位置。不適用于不同儀器上獲得的數(shù)據(jù)之間的對比。的位置。不適用于不同儀器上獲得的數(shù)據(jù)之間的對比。 利用加入法定性利用加入法定性：將純物質(zhì)加入到試樣中，觀察各組分將純物質(zhì)加入到試樣中，觀察各組分 色譜峰的相對變化。色譜峰的相對變化。 29 又稱又稱Kovats指數(shù)指數(shù)()，它采用一系列物質(zhì)來作為定性的參照，是一，它采用一系列物質(zhì)來作為定性的參照，是一 種重現(xiàn)性較好的定性參數(shù)。種重現(xiàn)性較

21、好的定性參數(shù)。 測定方法：測定方法： 30 3.與其他分析儀器聯(lián)用的定性方法 Sampl e Sampl e Gas Chromatograph (GC) Mass Spectrometer (MS) Separatio n Identificatio n 31 二、二、 色譜定量分析方法色譜定量分析方法 （1）峰高）峰高（h）乘半峰寬乘半峰寬（Y1/2）法：法：近似將色譜峰當作等 腰三角形。此法算出的面積是實際峰面積的0.94倍： A = 1.064 hY1/2 （2）峰高乘平均峰寬法）峰高乘平均峰寬法：當峰形不對稱時，可在峰高0.15 和0.85處分別測定峰寬，由下式計算峰面積： A =

22、h（Y 0.15 + Y 0.85 ）/ 2 （3）峰高乘保留時間法）峰高乘保留時間法：在一定操作條件下，同系物的半 峰寬與保留時間成正比，對于難于測量半峰寬的窄峰、重疊 峰（未完全重疊），可用此法測定峰面積： A = hbtR （4）自動積分和微機處理法）自動積分和微機處理法 32 2. 校正因子 試樣中各組分質(zhì)量與其色譜峰面積成正比，即試樣中各組分質(zhì)量與其色譜峰面積成正比，即： m i = fi Ai 絕對校正因子絕對校正因子：比例系數(shù)f i ，單位面積對應(yīng)的物質(zhì)量： f i =m i / Ai 定量校正因子與檢測器響應(yīng)值成倒數(shù)關(guān)系： f i = 1 / Si 相對校正因子相對校正因子：f i 即組分的絕對校正