富營(yíng)養(yǎng)化池塘底泥和上覆水體細(xì)菌解磷特性的初步研究

1、富營(yíng)養(yǎng)化池塘底泥和上覆水體細(xì)菌解磷特性的初步研究摘要：對(duì)天津市東麗區(qū)和西青區(qū)兩個(gè)富營(yíng)養(yǎng)化池塘中的細(xì)菌及其解磷特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，兩池塘的底泥及水體中芽孢桿菌占優(yōu)勢(shì)；兩池塘中的細(xì)菌都不能分解無機(jī)磷；西青區(qū)池塘中可分解有機(jī)磷的細(xì)菌達(dá)到80%，東麗區(qū)的為46%。關(guān)鍵詞：富營(yíng)養(yǎng)化池塘;細(xì)菌;解磷特性abstract: the bacteria and their phosphorolysis characteristics of two eutrophic ponds in dongli district and xiqing district were studied. the results

2、 show that the bacilli occupied dominant positions in water bodies and substrate sludge of the two eutrophic ponds. and the bacteria in two ponds couldnt decompose inorganic phosphorus.in xiqing district, the bacteria which could decompose organic phosphorus account for 80% of the total, while the s

3、ame ones account for 46% in dongli distrcit.key words: eutrophic pond; bacteria; phosphorolysis characteristics1 引言 我國(guó)是漁業(yè)生產(chǎn)大國(guó)，水產(chǎn)品產(chǎn)量居世界第一位，淡水養(yǎng)殖面積600萬公頃，規(guī)模化、集約化的養(yǎng)殖在給人們帶來豐富優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)品的同時(shí)，也產(chǎn)生了大量高濃度的氮磷廢水，引發(fā)了水體重度富營(yíng)養(yǎng)化，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及人類生存環(huán)境造成嚴(yán)重危害，而導(dǎo)致其富營(yíng)養(yǎng)化的主要限制性營(yíng)養(yǎng)元素是氮和磷，其主要來源則是池塘內(nèi)源即底泥。據(jù)報(bào)道，美國(guó)epa 在1998 年的調(diào)查報(bào)告中指出，引起美國(guó)魚類消費(fèi)事件的

4、元兇是池塘底泥。因此，底泥被稱為養(yǎng)殖水體中污染物質(zhì)的“庫(kù)”和“源”，水體中大量的殘余飼料、有機(jī)肥料、死亡的生物體、生物排泄物及其分解產(chǎn)物不斷通過沉淀、吸附、生物吸收等多種途徑進(jìn)入底泥，并在一定條件下釋放出氮和磷進(jìn)入上覆水體，引發(fā)水體進(jìn)一步富營(yíng)養(yǎng)化，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成極大危害。因此近些年來，隨著對(duì)底泥在水體污染上作用的認(rèn)識(shí)，越來越多的學(xué)者把研究目光投向底泥，取得了一些成果。如，研究表明，氮在底泥中以有機(jī)氮為主，平均占總氮的90%左右；磷則以無機(jī)磷的形式在底泥中積累，約占總磷的80-85%。另有資料報(bào)道，湖水中硝酸鹽的濃度對(duì)底泥中磷的釋放也有明顯作用，當(dāng)水體中硝酸鹽高于某一濃度時(shí)，底泥就容易釋放磷酸

5、鹽。另外，磷的釋放作用與磷存在的形態(tài)相關(guān)。學(xué)者宋春雷認(rèn)為，池塘底泥中高磷負(fù)荷可能是直接觸發(fā)微囊水華的主要原因。還有研究表明，應(yīng)用微生物制劑對(duì)養(yǎng)殖水體氮、磷污染進(jìn)行修復(fù)是一種比較有效的方式，這項(xiàng)技術(shù)在國(guó)內(nèi)外已經(jīng)得到重視，已有不少成功的范例。在海水養(yǎng)殖方面，光合細(xì)菌能夠降低蝦池水中有害物質(zhì)含量，氨氮含量平均降低0.4 mg/l，并能增加池水的do含量，平均增加112 mg/l，對(duì)改善蝦池生態(tài)環(huán)境有明顯效果；莫照蘭等在實(shí)驗(yàn)室條件下篩選到10株對(duì)蝦池富營(yíng)養(yǎng)有機(jī)物具有較高降解性能的細(xì)菌，包括弧菌屬、假單胞菌屬、發(fā)光桿菌屬、氣單胞菌屬和枯草桿菌，結(jié)果表明，這些細(xì)菌消化對(duì)蝦餌料的效果很明顯；鄒玉霞等進(jìn)行了蝦

6、池環(huán)境生物修復(fù)作用菌的分離、篩選和固定化研究，篩選出了有效作用菌株。淡水養(yǎng)殖方面，用自制的懸浮生物膜在工廠化養(yǎng)殖中應(yīng)用時(shí)可以使氨氮和亞硝酸氨保持在安全水平，因此，工廠化養(yǎng)殖系統(tǒng)應(yīng)用懸浮生物膜是可行的；某些微生物(如光合細(xì)菌、諾卡氏菌、大型綠藻、席藻、螺旋藻和小球藻等)和微生物制劑(如光合細(xì)菌制劑、芽孢桿菌制劑、clear2flo1200菌劑和高效復(fù)合微生物菌群等)均具有良好的凈化水質(zhì)的效果。此外，通過在底泥- 水界面噴灑土著微生物、促生劑、共代謝底物等,對(duì)老化蝦塘進(jìn)行底泥生物修復(fù),促進(jìn)底泥微生物繁殖,底泥有機(jī)質(zhì)在微生物作用下, 迅速分解, 釋放nh3 、h2s 等有害氣體,使底泥好氧層加厚,黑

7、泥層(厭氧層) 減薄,通過在上海泰賢和廣東徐聞的老化蝦塘生物修復(fù)試驗(yàn),底泥修復(fù)3 d 之后,肉眼可見底泥表面黑土層慢慢發(fā)白,大量氣體逸出,底泥好氧層明顯加厚,呈黃褐色。底泥好氧層加快底泥微量營(yíng)養(yǎng)的釋放,有利于提高藻類多樣性,穩(wěn)定藻相,同時(shí)也可阻隔下層黑臭底泥有毒物質(zhì)釋放,泥水界面好氧微生物相強(qiáng)化底泥對(duì)池塘殘餌、糞便等有機(jī)污染物分解能力,加快池塘生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量循環(huán),提高池塘自凈能力。另外，我國(guó)著名學(xué)者李秋芬曾從蝦池底泥中分離，篩選出多株蝦池有機(jī)物的有效降解菌，并在模擬條件下，發(fā)現(xiàn)微生物的環(huán)境修復(fù)作用能明顯改善蝦池環(huán)境。但土著微生物生長(zhǎng)速度太慢，代謝活性不高，對(duì)有機(jī)底泥的降解效率很有限。而

8、另一著名學(xué)者蔡惠鳳在實(shí)驗(yàn)室模擬生態(tài)條件下，運(yùn)用投放微生物制劑等方法對(duì)養(yǎng)殖水體池塘底泥進(jìn)行生物生態(tài)修復(fù)，其處理均有一定效果，但在作用的最初階段能促進(jìn)上覆水體浮游藻類的大量繁殖，并在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)引起水體氨氮、硝態(tài)氮含量升高。也有學(xué)者研究了池塘底泥中的微生物類群，包括參與氨化作用的好氧菌(或芽胞桿菌) 、兼性厭氧菌(如變形桿菌和假單胞菌) 以及厭氧菌(如腐敗梭狀芽胞桿菌) ，以及假單胞菌屬、發(fā)光桿菌屬、弧菌屬、芽孢桿菌屬，此外還包括部分真菌(如鏈球菌) 和放線菌(如鏈霉菌) ，但由于研究還處于初級(jí)階段，并沒有得出具體治理方案。總的來看，人們對(duì)水體底泥氮、磷造成污染等研究起步較晚，尤其是關(guān)于水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)

9、系統(tǒng)中底泥氮、磷變化的研究更是少之又少。關(guān)于利用微生物底泥修復(fù)的研究，也主要局限在水體氨氮、硝氮、亞硝態(tài)氮、磷酸鹽量上的變化，而對(duì)底泥中的有效微生物缺少深入系統(tǒng)的研究探討。由于研究不系統(tǒng)、不全面、不深入，所以人們利用微生物對(duì)富營(yíng)養(yǎng)化的治理方法都缺少有力的科學(xué)數(shù)據(jù)支撐，從而限制了這一研究領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展。正是由于前人對(duì)這一方面研究的不夠透徹，才導(dǎo)致了本應(yīng)在治理水體富營(yíng)養(yǎng)化中起重要作用的微生物治理方法沒有得到很好的應(yīng)用。因此，我們就更有必要分離、篩選底泥中的有效微生物，進(jìn)而，篩選出最為適合治理水體富營(yíng)養(yǎng)化的菌群，而在底泥中篩選的菌群又屬于土著微生物，這種土著微生物能否有較高的治理能力，則需要進(jìn)一步

10、鑒定。對(duì)治理能力不高的土著微生物加以誘變、培養(yǎng)，找出治理能力、效果最好的微生物，并與外源微生物相結(jié)合，進(jìn)一步改良用微生物治理水體富營(yíng)養(yǎng)化的方法，這項(xiàng)技術(shù)必將代替現(xiàn)行的用化學(xué)試劑治理水體富營(yíng)養(yǎng)化的方法，成為在水污染治理方面新的發(fā)展趨勢(shì)。為了治理底泥，控制水體富營(yíng)養(yǎng)化，人們通常是向池塘中投放大量化學(xué)藥劑，這勢(shì)必會(huì)造成水環(huán)境的二次污染，直接或間接影響到人體健康。因此，人們開始著力研究另一種在達(dá)到目的同時(shí)，又不會(huì)造成二次污染的良方，即向池塘生態(tài)體系中投放有益微生物，對(duì)池塘底泥和水體進(jìn)行生物修復(fù)，降低池塘底泥有機(jī)物含量，使泥水界面形成好氧微生物相，強(qiáng)化底泥對(duì)有機(jī)污染物分解能力和池塘的自凈能力，提高藻類多

11、樣性指數(shù)，穩(wěn)定藻相，增加水體溶氧，從而改善水質(zhì)，降低治理成本，實(shí)現(xiàn)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展。在這個(gè)研究過程中，首先要做的，也是最重要的一步就是從底泥和上覆水體中分離、篩選有效微生物。因此，了解池塘底泥和上覆水體中菌群的組成，從中選出有效微生物，用池塘底泥的生物修復(fù)，對(duì)減輕水體富營(yíng)養(yǎng)化有著十分重要的意義。研究表明，有生物修復(fù)作用的微生物種類很多，例如：光合細(xì)菌，它能夠降低池水中有害物質(zhì)含量，并能增加池水的do含量，對(duì)改善水體生態(tài)環(huán)境有明顯效果；弧菌屬、假單胞菌屬、發(fā)光桿菌屬、氣單胞菌屬和枯草桿菌等具有較高降解性能；諾卡氏菌、大型綠藻、席藻、螺旋藻和小球藻具有良好的凈化水質(zhì)的效果。本課題選擇了富營(yíng)養(yǎng)化池塘

12、做為研究對(duì)象，通過對(duì)從其底泥和上覆水體中分離菌種分析表明：在富營(yíng)養(yǎng)化的池塘上覆水體及底泥中含有多種可以利用有機(jī)磷的細(xì)菌，這類細(xì)菌大都含有芽孢，有些菌含有類脂粒，異染粒等特殊結(jié)構(gòu)，但這些細(xì)菌并不能夠利用無機(jī)磷，這從一個(gè)側(cè)面反映出富營(yíng)養(yǎng)化池塘中大量含有的是有機(jī)磷，因此才會(huì)有大量的解有機(jī)磷的細(xì)菌，而無機(jī)磷含量應(yīng)該不是很高。從這一結(jié)果可以得知，如果能夠大量降解池塘中的有機(jī)磷，應(yīng)該對(duì)其降低池塘富營(yíng)養(yǎng)化會(huì)有很大幫助。2 試驗(yàn)材料及方法2.1 試驗(yàn)樣品采集本試驗(yàn)樣品分別來源于天津市東麗區(qū)華明鎮(zhèn)永和村的富營(yíng)養(yǎng)化蝦池的上覆水體（a1）、底泥（a2）和天津市西青區(qū)南河鎮(zhèn)南河村已八年未清池的富營(yíng)養(yǎng)化魚池的上覆水體（

13、b1）、底泥（b2）。兩池塘每年夏季發(fā)生富營(yíng)養(yǎng)化，造成大批魚、蝦死亡。其底泥于上覆水體的化學(xué)性質(zhì)見表1和表2。表1 不同池塘底泥化學(xué)性質(zhì)池塘全磷（g/kg）全氮（g/kg）pha21.073.58.4b21.023.28.3表2 不同池塘上覆水體化學(xué)性質(zhì)池塘全磷（g/kg）全氮（g/kg）pha10.141.28.56b10.111.18.26按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，水體的全磷含量應(yīng)該低于0.02mg/l,全氮含量應(yīng)該低于0.3mg/l。通過表1和表2能夠說明兩池塘的氮、磷含量嚴(yán)重超標(biāo)。2.2 菌種的分離與純化2.2.1 儀器與設(shè)備試驗(yàn)中用到的儀器與設(shè)備有：培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、顯微

14、鏡等。2.2.2菌種的分離2.2.2.1培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，其配方是：5g牛肉膏，10g蛋白胨，nacl 5g,瓊脂20g，1000ml蒸餾水，121滅菌20min，測(cè)定其池塘水樣ph偏堿性，因此，選用ph為89，與測(cè)定一致。2.2.2.2 接菌 樣品稀釋 水和泥的倍倍稀釋分別論述分別取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7為預(yù)試驗(yàn)之稀釋倍數(shù)，量取1ml水樣，加入99ml無菌水中，充分搖勻，此時(shí)，稀釋度為10-2 ，用移液槍吸取1ml10-2水樣，加入9ml無菌水中，用吸打混勻方法將其充分混合，此時(shí)，稀釋度為10-3，再吸取1ml水樣加入9ml無菌水，混勻后為1

15、0-4稀釋度，以此類推，至10-7稀釋度。 涂布平板分離 用加液槍吸取一定量樣品，每稀釋度接入兩個(gè)平板中，每平板中加入兩滴（每滴約為0.05ml），用刮鏟將樣液刮勻。細(xì)菌培養(yǎng) 將涂布好的平板倒置于37培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24-36小時(shí)后觀察結(jié)果。單菌落觀察 找到合適的稀釋度，在此稀釋度中菌落數(shù)約為30-300個(gè)之間，且菌落獨(dú)立分開，不緊鄰成片，一般此時(shí)的菌落可視為單菌落。2.2.3 菌種的純化2.2.3.1菌落篩選將上述平板中的菌落以其菌落形態(tài)、菌落顏色、表面特性等為依據(jù)，進(jìn)行初步挑選，將選好的菌落用標(biāo)簽紙進(jìn)行標(biāo)記，以備分離單菌落之用。2.2.3.2菌種純化 接種 在固體肉湯培養(yǎng)基上將挑選好的菌

16、落用劃線分離法進(jìn)行純化。其方法是：用接種環(huán)以無菌操作法從菌落上挑菌少許，用左手托起培養(yǎng)基平板，以拇指和食指夾住皿蓋兩側(cè)，其余三個(gè)手指托住皿底，拇指稍向上掀蓋即可打開一縫隙，右手把已取好菌的接種環(huán)迅速由縫隙伸入平板內(nèi)，在培養(yǎng)基一側(cè)做第一次連續(xù)的劃線，約劃4-5條，然后，取出接種環(huán)灼燒，左手隨即將皿蓋合上，并將平皿向右轉(zhuǎn)60度角，再按上述方法作第二次劃線，劃線時(shí)接種環(huán)須通過第一次劃過的一條或兩條線，約劃3-4條，再轉(zhuǎn)動(dòng)平皿約60度角，灼燒接種環(huán)后再作第三次劃線。細(xì)菌培養(yǎng) 將劃線后的培養(yǎng)皿倒置于37培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，此培養(yǎng)基亦為牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。鏡檢 將培養(yǎng)出單菌落的菌種進(jìn)行染色觀察，觀察是否

17、是只包含一種細(xì)菌，若視野中只存在一種形態(tài)的細(xì)菌，說明分離成功，此時(shí)，菌種可初步被認(rèn)為是單菌落。2.3 菌株的形態(tài)觀察2.3.1 革蘭氏染色2.3.1.1 染色劑結(jié)晶紫混合液 碘液 脫色液 復(fù)染液2.3.1.2 染色步驟用接種環(huán)挑取少許菌苔，涂布于干凈的玻片上的一滴無菌水或蒸餾水中，風(fēng)干固定。用結(jié)晶紫的混合液染1min后，用水洗。碘液作用1min，水洗，吸干。用95%乙醇或丙酮乙醇溶液脫色，流滴至洗脫液至無色（約30s）。用蕃紅液染2-3min，水洗，風(fēng)干。2.3.1.3 結(jié)果觀察深紫色為革蘭氏染色陽性菌；紅色為革蘭氏染色陰性菌。2.3.2 鞭毛染色2.3.2.1 染色劑甲液：丹寧酸 5.0g、

18、fecl3 1.5g、福爾馬林（15%）2.0ml、naoh（1%）1.0ml、蒸餾水100ml 乙液：agno3 2.0g、蒸餾水100ml。待agno3溶解后，取出10ml備用，向其余的90ml agno3液中滴加濃氫氧化銨，則形成很濃的沉淀，再連續(xù)滴加氫氧化銨到剛?cè)芙獬恋沓蔀槌吻迦芤簽橹?，再將取出的agno3液慢慢滴入，出現(xiàn)薄霧，輕輕搖后薄霧消失，繼續(xù)滴入agno3液至薄霧剛不消失為止。2.3.2.2 染色步驟涂片：在載玻片的一端滴一滴蒸餾水，用接種環(huán)挑取斜面上少許菌苔，在載玻片的水滴中輕沾幾下，將玻片傾斜，使菌液緩慢流到另一端，然后平放在空氣中干燥。涂片干燥后，滴加甲染液10min，用

19、蒸餾時(shí)沖洗，干燥或?qū)埶疄r干或用乙液沖去殘水后，加乙液染30-60s，加熱，使其稍冒蒸汽而染液不干，冷卻后用蒸餾水沖洗。2.3.2.3 結(jié)果觀察鏡檢時(shí)多觀察幾個(gè)視野，菌體為深褐色，鞭毛為褐色。2.3.2.4 注意事項(xiàng)菌種為16-24h為宜，染液最好當(dāng)日配，最好充分洗凈甲液后再加乙液，否則會(huì)影響染色效果。2.3.3 莢膜染色2.3.3.1 染色劑剛果紅 2%水溶液、明膠0.01%-0.1%水溶液、鹽酸 1%、呂氏美藍(lán)（乙醇美藍(lán)飽和液約2%）30ml、koh水溶液（0.01%）100ml2.3.3.2 染色步驟將剛果紅水溶液和明膠水溶液各滴一滴于干凈的載玻片上；用接種環(huán)蘸取細(xì)菌培養(yǎng)物或懸浮液在玻片

20、上與上述兩滴溶液混勻并風(fēng)干；滴加1%的鹽酸沖洗，使涂片呈藍(lán)色用蒸餾水漂洗，除去鹽酸用美藍(lán)復(fù)染1min風(fēng)干后鏡檢。2.3.3.3 鏡檢有莢膜的菌，菌體藍(lán)色，莢膜不著色背景藍(lán)紫色；無莢膜的菌，菌體藍(lán)色，背景藍(lán)紫色。由于干燥菌體收縮，菌體四周也可能有一圈狹窄的不著色環(huán)，但不是莢膜，莢膜不著色部分寬。2.3.3.4 注意事項(xiàng)莢膜的產(chǎn)生與培養(yǎng)基有關(guān)，所以應(yīng)選用合適的培養(yǎng)基。有些動(dòng)物致病菌僅在動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)時(shí)形成莢膜，而在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)不形成莢膜。不同的種產(chǎn)生莢膜的時(shí)間不盡相同，必要時(shí)可在不同時(shí)間觀察。有時(shí)菌體著色差。2.3.4 異染粒染色2.3.4.1染劑甲液 ：甲苯胺藍(lán)0.15g、孔雀綠0.20g、冰醋

21、酸1ml、乙醇（95%）2ml、蒸餾水100ml；乙液：碘2g、碘化鉀3g、蒸餾水300ml2.3.4.2 染色步驟按常規(guī)方法涂片。用甲液染5min。傾去甲液，用乙液沖去甲液，并染1min。水洗，吸干2.3.4.3 鏡檢異染粒呈黑色，其他部分呈暗綠色或淺綠色。2.4.5 類脂粒（phb聚-羥基丁酸）顆粒染色2.3.5.1 染劑0.3%的蘇丹黑：蘇丹黑b0.3g、乙醇（70%）100ml，混合后用力振蕩，放置過液備用。脫色劑：二甲苯。復(fù)染劑：0.5%番紅水溶液2.3.5.2 染色步驟按常規(guī)法涂片。用蘇丹黑染10min。 用水洗去染劑，用濾紙將水吸干。用二甲苯?jīng)_洗涂片至無色素洗脫。用0.5%番紅復(fù)

22、染1-2min。水洗、吸干。2.3.5.3 鏡檢類脂粒染成藍(lán)黑色，菌體其他部分呈紅色。2.4 對(duì)解磷菌的篩選2.4.1用固體培養(yǎng)基篩選 (1)用有機(jī)磷培養(yǎng)基篩選（包括培養(yǎng)基，接種，培養(yǎng)，解磷圈觀察） 有機(jī)磷培養(yǎng)基配方：蛋白胨10g，牛肉膏3g，nacl 5g,瓊脂15g，蒸餾水1000ml，ph7.0，滅菌，臨用時(shí)每50ml中加入新鮮蛋黃液3ml（蛋黃與生理鹽水等比例混合），但應(yīng)注意：雞蛋蛋殼在臨用前用酒精消毒。用倍倍稀釋法（方法同上）進(jìn)行篩選。由于前面已作過預(yù)試驗(yàn)，所以可直接選取稀釋度較為合適的10-2、10-3、10-4三個(gè)稀釋度進(jìn)行稀釋并涂布。挑選菌種 將有機(jī)磷培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的帶有解磷圈的

23、菌落用標(biāo)簽紙加以標(biāo)記。將以標(biāo)記的菌種進(jìn)行純化，即用劃線法將其分離成單菌落（分離劃線方法同上）。鏡檢 檢驗(yàn)其菌落是否為一種細(xì)菌所組成。將其接入試管，進(jìn)行保藏，每種菌轉(zhuǎn)接兩管。再次配制有機(jī)磷培養(yǎng)基，將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上分離出的菌種，以及用有機(jī)磷培養(yǎng)基篩選出有解磷圈的菌種和無機(jī)磷培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng)的菌種同時(shí)應(yīng)用點(diǎn)接法接入有機(jī)磷培養(yǎng)基，即用接種環(huán)沾取少量菌種，輕輕點(diǎn)在培養(yǎng)基表面，點(diǎn)樣數(shù)沒有嚴(yán)格規(guī)定，只要使點(diǎn)樣點(diǎn)較為分散即可，然后將培養(yǎng)基置于37下培養(yǎng)24h，并對(duì)其解磷圈進(jìn)行觀察。(2)用無機(jī)磷培養(yǎng)基進(jìn)行篩選無機(jī)磷培養(yǎng)基配方：葡萄糖 10g，酵母粉0.5g，cacl2 0.1g，mgso4.7h2o

24、 0.3g，蒸餾水1000ml，瓊脂20g，滅菌。臨時(shí)用每50ml中加入10ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100g/kg的cacl2和1ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100g/kg的k2hpo4混合液，混勻，用0.1mol/l的naoh溶液調(diào)節(jié)ph為7.0。無機(jī)磷培養(yǎng)基配方：葡萄糖10g，(nh4)2so4 0.5g，kcl 0.3g mgso4.7h2o 0.3g，nacl 0.3g，caco3 5g，feso4.7h2o 0.06g，mnso4.4h2o 0.06g，ca3(po4)2 5g，瓊脂18-20g用倍倍稀釋法（方法同上）進(jìn)行篩選。由于前面已作過預(yù)試驗(yàn)，所以可直接選取稀釋度較為合適的10-2、10-3、10-4

25、三個(gè)稀釋度進(jìn)行稀釋并涂布。挑選菌種 將無機(jī)磷培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落用標(biāo)簽紙加以標(biāo)記。將以標(biāo)記的菌種進(jìn)行純化，即用劃線法將其分離成單菌落（分離劃線方法同上）。鏡檢 檢驗(yàn)其菌落是否為一種細(xì)菌所組成。將其接入試管，進(jìn)行保藏，每種菌轉(zhuǎn)接兩管。再次配制無機(jī)磷培養(yǎng)基，將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上分離出的菌種，以及用有機(jī)磷培養(yǎng)基篩選出有解磷圈的菌種和無機(jī)磷培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng)的菌種同時(shí)應(yīng)用點(diǎn)接法接入兩種無機(jī)磷培養(yǎng)基，即用接種環(huán)沾取少量菌種，輕輕點(diǎn)在培養(yǎng)基表面，點(diǎn)樣數(shù)沒有嚴(yán)格規(guī)定，只要使點(diǎn)樣點(diǎn)較為分散即可，然后將培養(yǎng)基置于37下培養(yǎng)24h，并對(duì)其解磷圈進(jìn)行觀察。3.試驗(yàn)結(jié)果與討論3.1試驗(yàn)結(jié)果3.1.1分離純化結(jié)果3.

26、1.1.1從上覆水體及底泥中分離純化的細(xì)菌共有28種，經(jīng)各種染色觀察后其形態(tài)特征見 表3 表3 上覆水體與底泥中菌群組成菌種號(hào)有無鞭毛革蘭氏染色有無異染粒有無類脂粒有無莢膜簡(jiǎn)單形態(tài)描述a1w2-1有g(shù)+無無無有芽孢，菌體為桿狀b1y4-1無g+無有無有芽孢，菌體為桿狀b1y2-3無g+有有無無芽孢，菌體為桿狀b1y2-4無g+無無無無芽孢，菌體為桿狀b1y2-5無g+無無無無芽孢，菌體為桿狀b1y2-6有g(shù)+無無無有芽孢，菌體為桿狀b1y2-7無g+有無無無芽孢，菌體為桿狀b1y2-8有g(shù)+無無無有芽孢，菌體為梭狀b1y2-9無g+有有無無芽孢，菌體為短桿狀b1n3-2無g+有無有無芽孢，菌體

27、為短桿狀b2w2-1有g(shù)+無有無有芽孢，菌體為短桿狀b2w2-2無g+無無無無芽孢，菌體為短桿狀a2y3-2有g(shù)+無無無有芽孢，菌體為梭狀a2y3-1有g(shù)+有有無有芽孢，菌體為梭狀b2n3-1無g+無無無有芽孢，菌體為梭狀b2n3-2無g+無無無無芽孢，菌體為桿狀b2n3-5無g+有無無無芽孢，菌體為桿狀b2n3-6無g+有有無無芽孢，菌體為短桿狀a2n3-1無g+無無無有芽孢，菌體為桿狀a2n3-2無g+無無無無芽孢，菌體為桿狀a2n3-3無g+無有有無芽孢，菌體為桿狀a2n3-4無g+無無無有芽孢，菌體為梭狀a2n3-5無g+有無無無芽孢，菌體為桿狀a2n3-6無g+有有無無芽孢，菌體為球

28、狀a2n3-7無g+無有無無芽孢，菌體為四聯(lián)球狀a2n3-8無g+無無有有芽孢，菌體為梭狀a2n3-9無g+有有無無芽孢，菌體為桿狀a2n3-11無g+無無無無芽孢，菌體為桿狀3.1.2解有機(jī)磷細(xì)菌3.1.3 解無機(jī)磷細(xì)菌3.1.2.1應(yīng)用固體培養(yǎng)基篩選結(jié)果在有機(jī)磷培養(yǎng)基和無機(jī)磷培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選有機(jī)磷培養(yǎng)基上出現(xiàn)解磷圈，說明該種菌能夠利用有機(jī)磷。如圖1 圖1 有機(jī)磷培養(yǎng)基上出現(xiàn)的解磷圈用分離出的28種菌在有機(jī)磷培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，有18種菌出現(xiàn)明顯的解磷圈；用分離出的這28種菌在無機(jī)磷培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，沒有一種菌出現(xiàn)解磷圈。3.2討論在有機(jī)磷培養(yǎng)基和無機(jī)磷培養(yǎng)基上同時(shí)都進(jìn)行了篩選，有機(jī)磷培養(yǎng)基上

29、生長(zhǎng)的菌落周圍出現(xiàn)了解磷圈，因此可以基本判定這些菌有解有機(jī)磷的能力，但無機(jī)磷培養(yǎng)基上接入的菌種雖然也能生長(zhǎng)，但沒有明顯的解磷圈。開始時(shí)，我認(rèn)為是我在配制培養(yǎng)基時(shí)出現(xiàn)了問題，為此，我又做了一次重復(fù)試驗(yàn)，但其結(jié)果與第一次結(jié)果相同，還是沒有一個(gè)菌有解磷圈。為了排除是因?yàn)榕囵B(yǎng)基不當(dāng)而導(dǎo)致出現(xiàn)這種情況，我又應(yīng)用了另一種經(jīng)改良過且被別人證明有效的無機(jī)磷培養(yǎng)基配方進(jìn)行了培養(yǎng)，但結(jié)果相同，都是沒有出現(xiàn)解磷圈，因此，可基本判定這28種菌沒有解無機(jī)磷的能力，這也從一個(gè)側(cè)面反映出這兩個(gè)富營(yíng)養(yǎng)化池塘中富含的磷為有機(jī)磷，有機(jī)磷含量超標(biāo)是導(dǎo)致其富營(yíng)養(yǎng)化的一個(gè)主要方面，從而，我們可以了解到如果想要解決這類池塘的富營(yíng)養(yǎng)化問題，應(yīng)該從解決有機(jī)磷含量入手，相對(duì)而言，其無機(jī)磷含量并不是一個(gè)重要的影響因素。參考文獻(xiàn)：1宋春雷,曹秀云,劉兵欽,等.池塘水化與底層磷營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的關(guān)系j.水生生物學(xué)報(bào),2005,28(1):7-12.2陳華林,陳英旭.污染底泥修復(fù)技術(shù)進(jìn)展j.農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù),2006,21（2）：179-182.3謝駿,方秀珍,郁桐炳.池塘氮循環(huán)中各種細(xì)菌與理化因子的相關(guān)性研究j.水生生物學(xué)報(bào),2008,26（2）：180