食品中銅綠假單胞菌檢測(cè)

1、一、概 述 銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）俗稱綠膿桿菌， 因?yàn)樵诖x過(guò)程中產(chǎn)生水溶性的綠色色素，使傷 口與創(chuàng)面呈綠色，故名綠膿桿菌。 銅綠假單胞菌能在許多污染物質(zhì)中存活并繁殖， 生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)需求不高，善于利用各種碳源和氨化合 物作為氮源，在水、土壤、食品以及醫(yī)院等環(huán)境 廣泛存在，甚至在蒸餾水、消毒液也不例外，如 季銨類消毒液，特別是含有一些有機(jī)物的液體。 銅綠假單胞菌可由多種途徑傳播，但主要是通過(guò) 污染醫(yī)療器械、用具及帶菌醫(yī)護(hù)人員引起醫(yī)源性 感染，因此，對(duì)燒傷病房、手術(shù)器械及治療器械 應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格消毒滅菌，以保證無(wú)銅綠假單胞菌的 污染。對(duì)銅綠假單胞菌感染的治療，可應(yīng)用慶大 霉素、多粘菌素

2、B和羧芐青霉素。 銅綠假單胞菌抵抗力較其他革蘭陰性菌強(qiáng)， 561h可殺滅，對(duì)很多抗生素具有耐受性。對(duì)消 毒劑、干燥、紫外線等理化因素及不良環(huán)境抵抗 力強(qiáng)，對(duì)化學(xué)藥物的抵抗力比一般革蘭氏陰性菌 強(qiáng)大。 二、生物學(xué)特性 1. 培養(yǎng)特性 本菌屬于假單胞菌屬，是一種 非發(fā)酵革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌，菌體 細(xì)長(zhǎng)且長(zhǎng)短不一，有時(shí)呈球桿狀或線狀，成對(duì)或 短鏈狀排列。菌體的一端有單鞭毛，在暗視野顯 微鏡或相差顯微鏡下觀察可見細(xì)菌運(yùn)動(dòng)活潑。 2菌體形態(tài) 無(wú)芽孢，無(wú)夾膜，革蘭陰性桿菌，有單鞭毛 或叢鞭毛，運(yùn)動(dòng)活潑。菌體的大小為0.5 1m1.53.0m，菌體筆直或彎曲。 3、生化特性 氧化酶和過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性。O/F試驗(yàn)

3、為氧化型， 還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，分解乙酰胺產(chǎn)生氨。 98 菌株產(chǎn)生水溶性熒光色素。銅綠假單胞菌能 液化明膠，酪蛋白水解，但淀粉不水解。90 以 上的菌株產(chǎn)生藍(lán)綠色色素。 分解蛋白質(zhì)能力強(qiáng)，發(fā)酵糖類能力較低，氧化分 解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解甘露醇、乳糖及 蔗糖，能液化明膠，分解尿素，不形吲哚，氧化 酶試驗(yàn)陽(yáng)性，還原硝酸鹽產(chǎn)氣，靛基質(zhì)陰性，不 產(chǎn)硫化氫。 三、致病性 主要致病物質(zhì)是內(nèi)毒素，此外尚有菌毛、莢膜、胞外 酶和外毒素等多種致病因子?？梢鹁植炕撔匝装Y ，也可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、胃腸炎、心內(nèi) 膜炎 、膿胸，還可引起菌血癥、敗血癥及引起嬰兒嚴(yán) 重的流行性腹瀉。 WHO的HACC

4、P評(píng)估明確指出銅綠假單胞菌是嬰兒瓶裝 飲用水的危害指示菌，可造成嬰兒腹瀉。尤其是抵抗 力較差的老弱病幼孕人群，飲用含銅綠假單胞菌的瓶 裝水很可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生，患者食入103104個(gè)菌體細(xì) 胞即可被侵害。銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)還將增加亞硝酸 鹽的含量-參考文獻(xiàn)。 國(guó)內(nèi)外污染情況- 參考文獻(xiàn) 國(guó)內(nèi)污染情況： -瓶裝天然礦泉水銅綠假單胞菌的檢出率1.223.6； -瓶裝飲用純凈水銅綠假單胞菌的檢出率11.6。 國(guó)外污染情況： -Richards等在104件檢品中的4件分離到銅綠假單胞菌； -Rosenberg報(bào)告德國(guó)1.210.2的瓶裝礦泉水檢出銅 綠假單胞菌。 剛出廠的產(chǎn)品中銅綠假單胞菌數(shù)量較少，但

5、有文獻(xiàn)報(bào) 道5加侖桶裝產(chǎn)品（1531天的保存期），銅綠假單胞 菌可生長(zhǎng)繁殖達(dá)到 CFU/ml。 國(guó)內(nèi)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)：0 CFU/250ml 三、實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn) GB/T 8538-2008 銅綠假單胞菌檢測(cè)（濾膜法） 原 理 將250mL水樣用孔徑為0.45m的濾膜過(guò)濾， 并將濾膜移至CN瓊脂培養(yǎng)基上，于36士1恒 溫箱中培養(yǎng)48h，能夠在CN瓊脂上生長(zhǎng)并產(chǎn)生綠 膿菌素，或者能夠在CN瓊脂上生長(zhǎng)并且氧化酶呈 陽(yáng)性、紫外光（36020nm）照射下能發(fā)熒光、 能夠利用乙酰胺產(chǎn)氨的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌， 經(jīng)證實(shí)為銅綠假單胞菌，則其檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。 培養(yǎng)基和試劑 假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基/CN瓊脂（低溫避 光保存

6、） 金氏B 培養(yǎng)基（低溫避光保存） 乙酰胺肉湯 營(yíng)養(yǎng)瓊脂 氧化酶試劑 鈉氏試劑（配制好之后低溫避光保存） 設(shè)備和儀器 玻璃器具：所有玻璃器皿使用前需121高 壓蒸汽滅菌15分鐘 恒溫培養(yǎng)箱：361 紫外燈：波長(zhǎng)應(yīng)為36020nm 濾膜：直徑47mm，微孔徑為0.45 （處理方法： 如濾膜未經(jīng)滅菌，則使用前需先將濾膜放入燒杯中，加入蒸餾水，置于沸水浴中煮沸滅菌3次，每 次15 min。前兩次煮沸后需更換水，用蒸餾水洗滌2次3次，以除去殘留溶劑。建議使用一次性無(wú) 菌濾膜。） 顯微鏡：10100 冰箱：08 操作步驟-水樣過(guò)濾 在100級(jí)的潔凈工作臺(tái)進(jìn)行過(guò)濾操作。 首先用無(wú)菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分

7、， 將粗糙面向上，貼放在已滅菌的濾床上， 固定好濾器，將250mL水樣或稀釋液通 過(guò)孔徑0.45m的濾膜過(guò)濾，然后將過(guò)濾 后的濾膜貼在已制備好的CN瓊脂平板上， 平鋪并避免在濾膜和培養(yǎng)基之間夾留著 氣泡。 結(jié)果觀察 培養(yǎng)20h24h觀察濾膜上菌落的生長(zhǎng) 情況并計(jì)數(shù)，防止因?yàn)榕囵B(yǎng)導(dǎo)致菌落過(guò)分 生長(zhǎng)而出現(xiàn)菌落融合。（ 40h48h時(shí)更 容易觀察產(chǎn)色素情況和熒光情況）。 可疑菌落計(jì)數(shù)情況 計(jì)數(shù)所有顯藍(lán)色或綠色（綠膿色素）的菌落，初步 判定為銅綠假單胞菌。 計(jì)數(shù)濾膜上所有發(fā)熒光不產(chǎn)綠膿色素疑似銅綠假單 胞菌菌落，并進(jìn)行乙酰胺肉湯確定試驗(yàn)。 （在紫外線下檢查濾膜時(shí)，應(yīng)避免長(zhǎng)時(shí)間在紫外光 下照射，否則可能

8、會(huì)將平板上的菌落殺滅，而導(dǎo) 致無(wú)法在證實(shí)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。） 將其它所有紅褐色不發(fā)熒光的菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)、 乙酰胺肉湯、金氏B培養(yǎng)基確證實(shí)驗(yàn)。 純 化 營(yíng)養(yǎng)瓊脂：將需驗(yàn)證的可疑菌落劃線接 種營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，于361培養(yǎng) 20h24h，對(duì)可疑菌進(jìn)行純化。 將最初顯紅褐色的菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn) 氧化酶試驗(yàn) ： 原理：氧化酶（細(xì)胞色素氧化酶）是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng) 的最終呼吸酶。具有氧化酶的細(xì)菌，首先使細(xì)胞色素C氧 化，再由氧化型細(xì)胞色素C使對(duì)苯二胺氧化，生成有色的 醌類化合物。 操作：取23滴新鮮配制的氧化酶試劑滴到放于平皿里的 潔凈濾紙上。用鉑金絲接種環(huán)或玻璃棒，將適量的純種培 養(yǎng)物涂布在預(yù)備好的濾紙

9、上。在10秒內(nèi)顯深藍(lán)紫色的視為 陽(yáng)性反應(yīng)。也可以按照商品化氧化酶測(cè)試產(chǎn)品的說(shuō)明書進(jìn) 行該項(xiàng)測(cè)試。 產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)（乙酰胺肉湯） 原理：銅綠假單胞菌產(chǎn)生一種脫酰胺酶，可使 乙酰胺經(jīng)脫酰胺作用釋放氨，滴加鈉氏試劑 （碘化汞鉀），氨在堿性條件下與碘化汞鉀作 用，生成紅色的絡(luò)合物。 操作：將純培養(yǎng)物接種到裝有乙酰胺肉湯的試 管中，在361下培養(yǎng)20h24h。然后向 每支試管培養(yǎng)物加入12滴鈉氏試劑，檢查各 試管的產(chǎn)氨情況，如表現(xiàn)出從深黃色到磚紅色 的顏色變化，則為陽(yáng)性結(jié)果，否則為陰性。 產(chǎn)熒光素實(shí)驗(yàn)（金氏B培養(yǎng)基） 原理：蛋白胨提供氮源，磷酸鹽促進(jìn)熒光素 的產(chǎn)生并抑制綠膿色素的產(chǎn)生，硫酸鎂為 熒光素的產(chǎn)生提

10、供必須的陽(yáng)離子，瓊脂是 培養(yǎng)基的凝固。 操作：將上述呈紅褐色的且氧化酶反應(yīng)呈陽(yáng) 性的培養(yǎng)物接種于金氏B培養(yǎng)基上，于 361恒溫箱培養(yǎng)24h5d。 每天需取 出在紫外燈下檢查其是否產(chǎn)生熒光性，將 5d內(nèi)產(chǎn)生熒光的菌落記錄為陽(yáng)性。 計(jì)數(shù)結(jié)果說(shuō)明 菌落計(jì)數(shù)公式： NPF(cF/nF)R(cR/nR) P是呈藍(lán)/綠色的菌落數(shù)（所有證實(shí)為銅綠假單胞 菌的菌落）。 F是沒有綠膿色素但顯熒光的菌落數(shù)。 R是呈紅褐色的菌落數(shù)。 nF是進(jìn)行產(chǎn)氨測(cè)試的顯熒光菌落數(shù)。 cF是產(chǎn)氨陽(yáng)性的顯熒光菌落數(shù)。 nR是進(jìn)行產(chǎn)氨、氧化酶、金氏B培養(yǎng)基上顯熒光 測(cè)試的紅褐色菌落數(shù)。 cR是產(chǎn)氨、氧化酶、金氏B培養(yǎng)基上顯熒光測(cè)試 均

11、呈陽(yáng)性的紅褐色菌落數(shù)。 舉 例 N=17+16(2/5)+10(3/5) 17：呈藍(lán)/綠色的菌落數(shù)； 16：沒有綠膿色素但顯熒光的菌落數(shù)； 2：產(chǎn)氨陽(yáng)性的顯熒光菌落數(shù)； 5：進(jìn)行產(chǎn)氨測(cè)試的顯熒光菌落數(shù)； 10：呈紅褐色的菌落數(shù)； 3：產(chǎn)氨、氧化酶、金氏B培養(yǎng)基上顯熒光測(cè)試均 呈陽(yáng)性的紅褐色菌落數(shù)； 5：進(jìn)行產(chǎn)氨、氧化酶、金氏B培養(yǎng)基上顯熒光測(cè) 試的紅褐色菌落數(shù)。 樣品稀釋 若樣品污染嚴(yán)重，建議對(duì)樣品進(jìn)行稀 釋，如10倍遞增稀釋：取30ml樣液加入 至270ml無(wú)菌生理鹽水中，混勻，以此類 推，進(jìn)行系列稀釋。 報(bào) 告 結(jié)果以 CFU/250ml計(jì)。 其他確證試驗(yàn)方法 自動(dòng)生化鑒定儀器 生化試劑條

12、（以國(guó)標(biāo)法為參照，二者符 合率99.6- 參考文獻(xiàn)） 3、生化特性 氧化酶和過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性。O/F試驗(yàn)為氧化型， 還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，分解乙酰胺產(chǎn)生氨。 98 菌株產(chǎn)生水溶性熒光色素。銅綠假單胞菌能 液化明膠，酪蛋白水解，但淀粉不水解。90 以 上的菌株產(chǎn)生藍(lán)綠色色素。 分解蛋白質(zhì)能力強(qiáng)，發(fā)酵糖類能力較低，氧化分 解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解甘露醇、乳糖及 蔗糖，能液化明膠，分解尿素，不形吲哚，氧化 酶試驗(yàn)陽(yáng)性，還原硝酸鹽產(chǎn)氣，靛基質(zhì)陰性，不 產(chǎn)硫化氫。 培養(yǎng)基和試劑 假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基/CN瓊脂（低溫避 光保存） 金氏B 培養(yǎng)基（低溫避光保存） 乙酰胺肉湯 營(yíng)養(yǎng)瓊脂 氧化酶試劑 鈉氏試

13、劑（配制好之后低溫避光保存） 可疑菌落計(jì)數(shù)情況 計(jì)數(shù)所有顯藍(lán)色或綠色（綠膿色素）的菌落，初步 判定為銅綠假單胞菌。 計(jì)數(shù)濾膜上所有發(fā)熒光不產(chǎn)綠膿色素疑似銅綠假單 胞菌菌落，并進(jìn)行乙酰胺肉湯確定試驗(yàn)。 （在紫外線下檢查濾膜時(shí)，應(yīng)避免長(zhǎng)時(shí)間在紫外光 下照射，否則可能會(huì)將平板上的菌落殺滅，而導(dǎo) 致無(wú)法在證實(shí)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。） 將其它所有紅褐色不發(fā)熒光的菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)、 乙酰胺肉湯、金氏B培養(yǎng)基確證實(shí)驗(yàn)。 計(jì)數(shù)結(jié)果說(shuō)明 菌落計(jì)數(shù)公式： NPF(cF/nF)R(cR/nR) P是呈藍(lán)/綠色的菌落數(shù)（所有證實(shí)為銅綠假單胞 菌的菌落）。 F是沒有綠膿色素但顯熒光的菌落數(shù)。 R是呈紅褐色的菌落數(shù)。 nF是進(jìn)行產(chǎn)氨測(cè)試的顯熒光菌落數(shù)。 cF是產(chǎn)氨陽(yáng)性的顯熒光菌落數(shù)。 nR是進(jìn)行產(chǎn)氨、氧化酶、金氏B培養(yǎng)基上顯熒光 測(cè)試的紅褐色菌落數(shù)。