蛋白質的研究進展

1、 蛋白質組學研究進展蛋白質組學研究進展 一、蛋白質組學的一、蛋白質組學的產(chǎn)生與發(fā)展產(chǎn)生與發(fā)展 二、蛋白質組學的相關概念二、蛋白質組學的相關概念 三、蛋白質組學研究方法概述三、蛋白質組學研究方法概述 四、蛋白質組學在腫瘤研究中的應用四、蛋白質組學在腫瘤研究中的應用 1986年，年，達爾貝科達爾貝科提出人類基因組計劃提出人類基因組計劃 1990年，美國國會批準年，美國國會批準“HGP”，9月，月，中國中國獲準獲準 加入，負責測定人類基因組序列的加入，負責測定人類基因組序列的1% 2000年年6月月26日，草圖繪制成功日，草圖繪制成功 2003年年4月月14日，人類基因組序列圖繪制成功日，人類基因組

2、序列圖繪制成功 改變花色的轉基因矮牽牛花改變花色的轉基因矮牽?；?轉入熒光素酶蛋白基因的發(fā)轉入熒光素酶蛋白基因的發(fā) 熒光煙草熒光煙草 藍色玫瑰藍色玫瑰 19941994年，澳大利亞科學家年，澳大利亞科學家WilkinsWilkins等人首次提出蛋白質組概念等人首次提出蛋白質組概念 19961996年，澳大利亞建立了第年，澳大利亞建立了第1 1個蛋白質組研究中心（個蛋白質組研究中心（APAFAPAF） 20012001年年4 4月，美國成立了國際人類蛋白質組研究組織（月，美國成立了國際人類蛋白質組研究組織（HUPOHUPO） 2020世紀世紀9090年代中期年代中期 ，蛋白質組學以細胞內全部蛋白

3、質的存在，蛋白質組學以細胞內全部蛋白質的存在 及其活動方式為研究對象及其活動方式為研究對象 各國政府支持，國際著名研究和商業(yè)機構加盟：各國政府支持，國際著名研究和商業(yè)機構加盟： n美國國家癌癥研究院美國國家癌癥研究院（National Cancer National Cancer InstituteInstitute）和）和食品藥品監(jiān)督管理局（食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Food and Drug AdministrationDrug Administration）共同投資數(shù)百萬美元建共同投資數(shù)百萬美元建 立立癌癥不同階段的蛋白質組數(shù)據(jù)庫癌癥不同階段的蛋白質組數(shù)據(jù)庫。 nCelera

4、Celera公司投資上億美元獨自啟動了全面鑒定公司投資上億美元獨自啟動了全面鑒定 和分類匯總人和分類匯總人類組織、細胞和體液中的蛋白質及類組織、細胞和體液中的蛋白質及 其異構體其異構體，構建新一代的蛋白質表達數(shù)據(jù)庫的工，構建新一代的蛋白質表達數(shù)據(jù)庫的工 作。作。 n我國也于我國也于1998年啟動了蛋白質組學研究，在中科年啟動了蛋白質組學研究，在中科 院上海生物化學研究所舉辦了兩次全國性的蛋白質組院上海生物化學研究所舉辦了兩次全國性的蛋白質組 學研討會學研討會 n2003成立了中國人類蛋白質組組織（成立了中國人類蛋白質組組織（CHHUPO），）， 并分別于并分別于2003年年9月、月、2004年

5、年8月以及月以及2005年年8月月 召開了中國蛋白質組學首屆、第二屆及第三屆學術大召開了中國蛋白質組學首屆、第二屆及第三屆學術大 會，會，2004年年10月在中國北京召開了第三屆國際蛋白月在中國北京召開了第三屆國際蛋白 質組學會議。質組學會議。 n科技部已將疾病蛋白質組研究列入我國科技部已將疾病蛋白質組研究列入我國“973”計計 劃項目和劃項目和“863”計劃項目；國家自然科學基金委員計劃項目；國家自然科學基金委員 會也將會也將“蛋白質組研究蛋白質組研究”列為重點項目。列為重點項目。 n2003年年12月月15日，國際人類蛋白質組組織負責人在北京宣布，日，國際人類蛋白質組組織負責人在北京宣布，

6、 國際人類蛋白質組計劃正式啟動，國際人類蛋白質組計劃正式啟動，“人類肝臟蛋白質組計劃人類肝臟蛋白質組計劃” 和和“人類血漿蛋白質組計劃人類血漿蛋白質組計劃”兩大項目首先開始執(zhí)行，其中兩大項目首先開始執(zhí)行，其中 “人類肝臟蛋白質組計劃人類肝臟蛋白質組計劃”由中國科學家領導執(zhí)行，這是我國由中國科學家領導執(zhí)行，這是我國 科學家第一次領導執(zhí)行重大國際科技協(xié)作計劃?？茖W家第一次領導執(zhí)行重大國際科技協(xié)作計劃。 n首次由我國科學家領導的國際重大科研合作項目首次由我國科學家領導的國際重大科研合作項目人類肝人類肝 臟蛋白質組計劃，被宣告取得階段性新進展。幾年來圍繞人類臟蛋白質組計劃，被宣告取得階段性新進展。幾年

7、來圍繞人類 肝臟蛋白質組的肝臟蛋白質組的表達譜、修飾譜及其相互作用的連鎖圖表達譜、修飾譜及其相互作用的連鎖圖等九大等九大 科研任務，我國科學家已經(jīng)成功測定出科研任務，我國科學家已經(jīng)成功測定出6788個個高可信度的中國高可信度的中國 成人肝臟蛋白質，系統(tǒng)構建了國際上第一張人類器官蛋白質組成人肝臟蛋白質，系統(tǒng)構建了國際上第一張人類器官蛋白質組 “藍圖藍圖”；發(fā)現(xiàn)了包含；發(fā)現(xiàn)了包含1000余個余個“蛋白質蛋白質-蛋白質蛋白質”相互作用的相互作用的 網(wǎng)絡圖；建立了網(wǎng)絡圖；建立了2000余株蛋白質抗體。余株蛋白質抗體。 蛋白質組學研究進展蛋白質組學研究進展 一、蛋白質組學的產(chǎn)生與發(fā)展一、蛋白質組學的產(chǎn)生

8、與發(fā)展 二、蛋白質組學的二、蛋白質組學的相關概念相關概念 三、蛋白質組學研究方法概述三、蛋白質組學研究方法概述 四、蛋白質組學在腫瘤研究中的應用四、蛋白質組學在腫瘤研究中的應用 蛋白質組是澳大利亞學者蛋白質組是澳大利亞學者WilliamsWilliams和和 WilkinsWilkins于于19941994年首先提出，源于蛋白年首先提出，源于蛋白 質（質（proteinprotein）與基因組（）與基因組（genomegenome）兩）兩 個詞的雜合個詞的雜合, ,意指意指proteins expressed proteins expressed by a genomeby a genome，

9、即，即“一個細胞或一個組一個細胞或一個組 織的基因組所表達的全部蛋白質織的基因組所表達的全部蛋白質”。 蛋白質組學的概念蛋白質組學的概念 對應于基因組的所有蛋白質構成的對應于基因組的所有蛋白質構成的 整體，不是局限于一個或幾個蛋白整體，不是局限于一個或幾個蛋白 質。質。 同一基因組在不同細胞、不同組織同一基因組在不同細胞、不同組織 中的表達情況各不相同中的表達情況各不相同 。 在空間和時間上動態(tài)變化著的整體。在空間和時間上動態(tài)變化著的整體。 蛋白質組是：蛋白質組是： 指應用各種技術手段來研究蛋白質組的一門新興科學，指應用各種技術手段來研究蛋白質組的一門新興科學， 其目的是從整體的角度分析細胞內

10、其目的是從整體的角度分析細胞內動態(tài)變化動態(tài)變化的的蛋白質組成蛋白質組成 成份、表達水平與修飾狀態(tài)成份、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質之間的相互作用，了解蛋白質之間的相互作用 與聯(lián)系，揭示蛋白質功能與細胞生命活動規(guī)律。與聯(lián)系，揭示蛋白質功能與細胞生命活動規(guī)律。 n了解某種特定的細胞、組織或器官制造的蛋白質種類；了解某種特定的細胞、組織或器官制造的蛋白質種類； n明確各種蛋白質分子是如何形成類似于電路的網(wǎng)絡的；明確各種蛋白質分子是如何形成類似于電路的網(wǎng)絡的； n描繪蛋白質的精確三維結構，揭示其結構上的關鍵部位，描繪蛋白質的精確三維結構，揭示其結構上的關鍵部位， 如與藥物結合并且決定其活性的部位。如

11、與藥物結合并且決定其活性的部位。 蛋白質組學研究進展蛋白質組學研究進展 一、蛋白質一、蛋白質組學的產(chǎn)生與發(fā)展組學的產(chǎn)生與發(fā)展 二、蛋白質組學的相關概念二、蛋白質組學的相關概念 三、蛋白質組學三、蛋白質組學研究方法概述研究方法概述 四、蛋白質組學在腫瘤研究中的應用四、蛋白質組學在腫瘤研究中的應用 蛋白質組研究更為復雜和困難：蛋白質組研究更為復雜和困難： n 蛋白質數(shù)目大大超過基因數(shù)目蛋白質數(shù)目大大超過基因數(shù)目 n 蛋白質隨時間和空間而變化蛋白質隨時間和空間而變化 當前主要任務：當前主要任務： 發(fā)展發(fā)展高通量、高靈敏度、高準確性高通量、高靈敏度、高準確性的研的研 究技術平臺是現(xiàn)在乃至相當一段時間內

12、究技術平臺是現(xiàn)在乃至相當一段時間內 蛋白質組學研究中的主要任務。蛋白質組學研究中的主要任務。 蛋白質組學研究方法概述蛋白質組學研究方法概述 一、一、蛋白質組表達模式蛋白質組表達模式的研究方法的研究方法 n蛋白質組研究中的樣品制備蛋白質組研究中的樣品制備 n蛋白質組研究中的樣品分離蛋白質組研究中的樣品分離 n蛋白質組研究中的樣品分析鑒定蛋白質組研究中的樣品分析鑒定 n蛋白質組學研究的生物信息學蛋白質組學研究的生物信息學 n定量蛋白質組學研究定量蛋白質組學研究 二、蛋白質組功能模式的研究方法二、蛋白質組功能模式的研究方法 n蛋白質翻譯后修飾的研究蛋白質翻譯后修飾的研究 n蛋白質相互作用研究技術蛋白

13、質相互作用研究技術 研究蛋白質組的研究蛋白質組的組成成分組成成分 支撐技術主要有支撐技術主要有雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳、 以質譜為代表的蛋白質鑒定技術以質譜為代表的蛋白質鑒定技術 及及生物信息學分析生物信息學分析。 蛋白質組學研究方法概述蛋白質組學研究方法概述 一、蛋白質組表達模式的研究方法一、蛋白質組表達模式的研究方法 n蛋白質組研究中的蛋白質組研究中的樣品制備樣品制備 n蛋白質組研究中的樣品分離蛋白質組研究中的樣品分離 n蛋白質組研究中的樣品分析鑒定蛋白質組研究中的樣品分析鑒定 n蛋白質組學研究的生物信息學蛋白質組學研究的生物信息學 n定量蛋白質組學研究定量蛋白質組學研究 二、蛋白質組功能

14、模式的研究方法二、蛋白質組功能模式的研究方法 n蛋白質翻譯后修飾的研究蛋白質翻譯后修飾的研究 n蛋白質相互作用研究技術蛋白質相互作用研究技術 通?？刹捎猛ǔ？刹捎眉毎蚪M織細胞或組織中的全蛋白質組分進中的全蛋白質組分進 行蛋白質組分析。行蛋白質組分析。 也可以進行也可以進行樣品預分級樣品預分級，即將細胞或組織中，即將細胞或組織中 的全體蛋白質分成不同部分，分別進行研究。的全體蛋白質分成不同部分，分別進行研究。 樣品預分級的主要方法樣品預分級的主要方法 蛋白質溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白質溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等 蛋白質定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白質定位：膜蛋白、核蛋白等 蛋白質細

15、胞器定位：線粒體、高爾基體、葉綠體等蛋白質細胞器定位：線粒體、高爾基體、葉綠體等 樣品預分級主要作用在于提高低豐度蛋白質的上樣量和檢樣品預分級主要作用在于提高低豐度蛋白質的上樣量和檢 測靈敏度測靈敏度。 臨床樣本都是由多種細胞或組織混合而成，如腫瘤臨床樣本都是由多種細胞或組織混合而成，如腫瘤 中癌變上皮細胞總是與血管、間質細胞等混雜一起。中癌變上皮細胞總是與血管、間質細胞等混雜一起。 激光捕獲顯微切割激光捕獲顯微切割(laser capture microdissection， LCM)可直接在顯微鏡下從組織切片中精確分離特可直接在顯微鏡下從組織切片中精確分離特 定的細胞或細胞群。定的細胞或細

16、胞群。 LCM具有其獨特的優(yōu)點具有其獨特的優(yōu)點 n快速簡單、有效減少交叉污染?？焖俸唵?、有效減少交叉污染。 n樣品的切割與分離由激光一步完成，并可以保持被分離的樣品的切割與分離由激光一步完成，并可以保持被分離的 樣品的完整性。樣品的完整性。 n結合免疫熒光能夠基于組織細胞的表型和功能特征進行分結合免疫熒光能夠基于組織細胞的表型和功能特征進行分 離樣品組分。離樣品組分。 n對制樣的要求靈活多樣，使用范圍較廣。對制樣的要求靈活多樣，使用范圍較廣。 通過通過LCM對組織切片進行切割與分離可以分離收集從形態(tài)對組織切片進行切割與分離可以分離收集從形態(tài) 上（普通染色），表型或功能上（熒光染色）可以辨認均一

17、性上（普通染色），表型或功能上（熒光染色）可以辨認均一性 的細胞群體，從而的細胞群體，從而克服了組織不均一克服了組織不均一的特點，提高了數(shù)據(jù)的準的特點，提高了數(shù)據(jù)的準 確性和可靠性，這在腫瘤生物學研究中具有廣泛應用。確性和可靠性，這在腫瘤生物學研究中具有廣泛應用。 蛋白質組學研究方法概述蛋白質組學研究方法概述 一、蛋白質組表達模式的研究方法一、蛋白質組表達模式的研究方法 n蛋白質組研究中的樣品制備蛋白質組研究中的樣品制備 n蛋白質組研究中的蛋白質組研究中的樣品分離樣品分離 n蛋白質組研究中的樣品分析鑒定蛋白質組研究中的樣品分析鑒定 n蛋白質組學研究的生物信息學蛋白質組學研究的生物信息學 n定量

18、蛋白質組學研究定量蛋白質組學研究 二、蛋白質組功能模式的研究方法二、蛋白質組功能模式的研究方法 n蛋白質翻譯后修飾的研究蛋白質翻譯后修飾的研究 n蛋白質相互作用研究技術蛋白質相互作用研究技術 雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳(two-dimensional electrophoresis， 2-DE)：利用蛋白質的：利用蛋白質的等電點和分子量等電點和分子量，結合凝膠化，結合凝膠化 學特性，分離各種蛋白質的方法。學特性，分離各種蛋白質的方法。 第第1向基于蛋白質的向基于蛋白質的等電點不同等電點不同用用等電聚焦分離等電聚焦分離，具有，具有 相同等電點的蛋白質無論其分子大小，在電場的作用下都相同等電點的蛋白

19、質無論其分子大小，在電場的作用下都 會用聚焦在某一特定位置即等電點處；第會用聚焦在某一特定位置即等電點處；第2向則按向則按分子量的分子量的 不同不同用用SDS-PAGE分離，把復雜蛋白混合物中的蛋白質在分離，把復雜蛋白混合物中的蛋白質在 二維平面上分開。二維平面上分開。 第一向分離第一向分離 等電聚焦等電聚焦 蛋白質是兩性分子，在不同的蛋白質是兩性分子，在不同的pH環(huán)境中可以帶正電荷、負電荷或不帶電荷。環(huán)境中可以帶正電荷、負電荷或不帶電荷。 對每個蛋白質來說都有一個特定的對每個蛋白質來說都有一個特定的pH，此時蛋白質的靜電荷為零，此，此時蛋白質的靜電荷為零，此pH值值 即該即該蛋白質的等電點蛋

20、白質的等電點(pI)。將蛋白質樣品加載至。將蛋白質樣品加載至pH梯度介質上進行電泳時，梯度介質上進行電泳時， 它會向與其所帶電荷相反的電極方向移動。在移動過程中，蛋白分子可能獲它會向與其所帶電荷相反的電極方向移動。在移動過程中，蛋白分子可能獲 得或失去質子，并且隨著移動的進行，該蛋白所帶的電荷數(shù)和遷移速度下降。得或失去質子，并且隨著移動的進行，該蛋白所帶的電荷數(shù)和遷移速度下降。 當?shù)鞍踪|遷移至其等電點當?shù)鞍踪|遷移至其等電點pH位置時，其凈電荷數(shù)為零，在電場中不再移動。位置時，其凈電荷數(shù)為零，在電場中不再移動。 聚焦是一個與聚焦是一個與pH相關的平衡過程：蛋白質以不同的速率靠近并最終停留在它相關

21、的平衡過程：蛋白質以不同的速率靠近并最終停留在它 們各自的們各自的pI值；在等電聚焦過程中，蛋白質可以從各個方向移動到它的恒定值；在等電聚焦過程中，蛋白質可以從各個方向移動到它的恒定 位點。位點。 第二向分離第二向分離 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 雙向電泳的第二向是將雙向電泳的第二向是將IPG膠條中經(jīng)過第一向分離的蛋白轉移到第二向膠條中經(jīng)過第一向分離的蛋白轉移到第二向 SDSPAGE凝膠上，根據(jù)蛋白相對分子質量或分子量凝膠上，根據(jù)蛋白相對分子質量或分子量(MW)大小與第大小與第 一相垂直的分離。一相垂直的分離。 蛋白質與十二烷基硫酸鈉蛋白質與十二烷基硫酸鈉(SDS)結合形成帶負

22、電荷的蛋白質結合形成帶負電荷的蛋白質SDS復合復合 物，由于物，由于SDS是一種強陰離子去垢劑所帶的負電荷遠遠超過蛋白質是一種強陰離子去垢劑所帶的負電荷遠遠超過蛋白質 分子原有的電荷量，分子原有的電荷量，能消除不同分子之間原有的電荷差異，從而使得能消除不同分子之間原有的電荷差異，從而使得 凝膠中電泳遷移率不再受蛋白質原有電荷的影響而主要取決于蛋白凝膠中電泳遷移率不再受蛋白質原有電荷的影響而主要取決于蛋白 質分子的質量大小質分子的質量大小，其遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關系，在蛋白質，其遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關系，在蛋白質 組研究中。需要在同樣的條件下同時走多塊膠，這對凝膠與凝膠之間組研究中。

23、需要在同樣的條件下同時走多塊膠，這對凝膠與凝膠之間 的比較十分重要的比較十分重要 可分離可分離10100 kD分子量的蛋白質分子量的蛋白質 高靈敏度和高分辨率高靈敏度和高分辨率 便于計算機進行圖像分析處理便于計算機進行圖像分析處理 與質譜分析匹配與質譜分析匹配 雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳(2-DE)技術的缺點技術的缺點 極酸、極堿性蛋白質，疏水性蛋白質，極酸、極堿性蛋白質，疏水性蛋白質， 極大蛋白質、極小蛋白質以及低豐度蛋極大蛋白質、極小蛋白質以及低豐度蛋 白質用此種技術難于有效分離。白質用此種技術難于有效分離。 膠內酶解過程費時、費力，難于與質譜膠內酶解過程費時、費力，難于與質譜 聯(lián)用實現(xiàn)自動

24、化。聯(lián)用實現(xiàn)自動化。 u 液相色譜法液相色譜法 liquid chromatography，LC u毛細管電泳法毛細管電泳法 capillary electrophoresis， CE u液相色譜液相色譜- -質譜聯(lián)用技術（質譜聯(lián)用技術（L LPLPLC-MS/MSC-MS/MS） 蛋白質混合物直接通過蛋白質混合物直接通過液相色譜分離液相色譜分離以代替以代替2-DE的的 分離，然后進入分離，然后進入MS系統(tǒng)系統(tǒng)獲得獲得肽段分子量肽段分子量，再通過，再通過串聯(lián)串聯(lián)MS 技術技術，得到部分序列信息，最后通過計算機聯(lián)網(wǎng)查詢、鑒，得到部分序列信息，最后通過計算機聯(lián)網(wǎng)查詢、鑒 定蛋白質。定蛋白質。 根據(jù)

25、蛋白根據(jù)蛋白質質帶電性及疏水性帶電性及疏水性不同，用不同，用MS分離多肽復合物。分離多肽復合物。 離子交換色譜離子交換色譜是通過溶質在離子交換色譜固定相上具有不同是通過溶質在離子交換色譜固定相上具有不同 的保留能力，而實現(xiàn)樣品分離的色譜技術，而的保留能力，而實現(xiàn)樣品分離的色譜技術，而反相液相色譜反相液相色譜 是基于是基于溶質疏水性的差異溶質疏水性的差異而實現(xiàn)分離的色譜技術。通過這兩而實現(xiàn)分離的色譜技術。通過這兩 種色譜模式的聯(lián)用，可以實現(xiàn)對種色譜模式的聯(lián)用，可以實現(xiàn)對復雜生物樣品的二維分離。復雜生物樣品的二維分離。 u多維多維色譜技術（色譜技術（LC/LC-MS/MS） u多維蛋白質鑒定技術多

26、維蛋白質鑒定技術(multidimensional protein identification technology) 將不同分離模式的將不同分離模式的 色譜柱以串聯(lián)方式合并于同一根色譜柱中進行，在同一根色譜色譜柱以串聯(lián)方式合并于同一根色譜柱中進行，在同一根色譜 柱的前半部分裝填柱的前半部分裝填強陽離子色譜填料強陽離子色譜填料，后部分裝填，后部分裝填反相液相色反相液相色 譜填料譜填料，該方法可對，該方法可對樣品量較少的蛋白質進行快速分析樣品量較少的蛋白質進行快速分析。 蛋白質組學研究方法概述蛋白質組學研究方法概述 一、蛋白質組表達模式的研究方法一、蛋白質組表達模式的研究方法 n蛋白質組研究中

27、的樣品制備蛋白質組研究中的樣品制備 n蛋白質組研究中的樣品分離蛋白質組研究中的樣品分離 n蛋白質組研究中的蛋白質組研究中的樣品分析鑒定樣品分析鑒定 n蛋白質組學研究的生物信息學蛋白質組學研究的生物信息學 n定量蛋白質組學研究定量蛋白質組學研究 二、蛋白質組功能模式的研究方法二、蛋白質組功能模式的研究方法 n蛋白質翻譯后修飾的研究蛋白質翻譯后修飾的研究 n蛋白質相互作用研究技術蛋白質相互作用研究技術 傳統(tǒng)方法：傳統(tǒng)方法： EdmanEdman降解法降解法: : EdmanEdman降解（降解（Edman degradationEdman degradation）：是測定蛋白質一級結構的方法，主要

28、）：是測定蛋白質一級結構的方法，主要 是從是從蛋白質或多肽氨基末端蛋白質或多肽氨基末端進行分析。由埃德曼（進行分析。由埃德曼（P PEdmanEdman）在上世紀）在上世紀5050 年代所創(chuàng)立。分為年代所創(chuàng)立。分為耦合、切割、萃取、轉化、鑒定耦合、切割、萃取、轉化、鑒定等幾個步驟。首先在等幾個步驟。首先在 pH9.0pH9.0的堿性環(huán)境下，將異硫氰酸苯酯的堿性環(huán)境下，將異硫氰酸苯酯(PhN=C=S(PhN=C=S，PITC)PITC)和蛋白質或多肽和蛋白質或多肽 N N端氨基酸耦合，形成苯氨基硫甲酰端氨基酸耦合，形成苯氨基硫甲酰(PTC)(PTC)衍生物；然后以三氟乙酸衍生物；然后以三氟乙酸(

29、TFA)(TFA) 處理耦合后產(chǎn)物，處理耦合后產(chǎn)物，將多肽或蛋白的將多肽或蛋白的N N一端第一個肽鍵選擇性的切斷，釋放一端第一個肽鍵選擇性的切斷，釋放 出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物；隨后萃取出釋放的氨基酸衍生物；隨后萃取出釋放的氨基酸衍生物 并在強酸性條件下轉化為穩(wěn)定的乙內酰苯硫脲氨基酸并在強酸性條件下轉化為穩(wěn)定的乙內酰苯硫脲氨基酸(PTH-(PTH-氨基酸氨基酸) )；最后；最后 以色譜法鑒定出降解下來的以色譜法鑒定出降解下來的PTH-PTH-氨基酸種類，從而得到蛋白質或氨基酸種類，從而得到蛋白質或多肽多肽N N端端 序列信息。序列信息。EdmanEd

30、man降解法的優(yōu)點是異硫氰酸苯酯與所有氨基酸殘基的反應降解法的優(yōu)點是異硫氰酸苯酯與所有氨基酸殘基的反應 產(chǎn)率和回收率都相當高，因此反應副產(chǎn)物少，用色譜可以準確鑒定。產(chǎn)率和回收率都相當高，因此反應副產(chǎn)物少，用色譜可以準確鑒定。 一些傳統(tǒng)蛋白質分析技術如蛋白質序列分析技術（一些傳統(tǒng)蛋白質分析技術如蛋白質序列分析技術（Edman 降解法降解法, 1950），仍然可用于當前蛋白質組研究），仍然可用于當前蛋白質組研究。其缺點是難其缺點是難 于實現(xiàn)高通量，同時對低豐度蛋白質的鑒定上其靈敏度難于達于實現(xiàn)高通量，同時對低豐度蛋白質的鑒定上其靈敏度難于達 到要求到要求。 A-R-G-F-L-E-K-LA-R-G

31、-F-L-E-K-L ( (得到部分序列得到部分序列) ) 491491蛋白質微蛋白質微 量序列儀量序列儀 印漬轉移 酶解 提取肽混合物 毛細管HPLC儀 收集肽于PVDF膜 PVDF膜 通過通過Edman降解對雙向凝膠上的蛋白質點進行鑒定的實驗路線降解對雙向凝膠上的蛋白質點進行鑒定的實驗路線 雙向電泳分離 新型蛋白質鑒定技術新型蛋白質鑒定技術 質譜（質譜（MSMS）法）法 基本原理基本原理：質譜法質譜法(Mass Spectrometry,MS)(Mass Spectrometry,MS)即用電即用電 場和磁場將運動的離子（帶電荷的原子、分子或分子碎片，場和磁場將運動的離子（帶電荷的原子、分

32、子或分子碎片， 有分子離子、同位素離子、碎片離子、重排離子、多電荷離有分子離子、同位素離子、碎片離子、重排離子、多電荷離 子、亞穩(wěn)離子、負離子和離子分子相互作用產(chǎn)生的離子）子、亞穩(wěn)離子、負離子和離子分子相互作用產(chǎn)生的離子） 按它們的按它們的質荷比質荷比分離后進行檢測的方法。分離后進行檢測的方法。測出離子準確質量測出離子準確質量 即可確定離子的化合物組成即可確定離子的化合物組成。樣品分子。樣品分子離子化離子化后，根據(jù)離子后，根據(jù)離子 間間質荷比（質荷比（m/zm/z）的差異來分離并確定的差異來分離并確定樣品的分子量樣品的分子量。 MAIDI-TOF ESI-MS/MS 酶解 脫 鹽 濃 縮 飛行

33、時間質譜儀飛行時間質譜儀 電噴霧串聯(lián)質譜儀電噴霧串聯(lián)質譜儀 毛細管HPLC儀 點樣板 序列標簽(PST) 數(shù)據(jù)庫搜索數(shù)據(jù)庫搜索 雙向電泳分離 蛋白質鑒定蛋白質鑒定 通過質譜對雙向凝膠上的蛋白質點進行鑒定的實驗路線通過質譜對雙向凝膠上的蛋白質點進行鑒定的實驗路線 肽 肽質指紋 （PMF） 質譜技術鑒定蛋白質路線圖質譜技術鑒定蛋白質路線圖 基質輔助激光解吸基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜電離飛行時間質譜（matrix- assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）MALDI-

34、 TOF質譜儀：靈敏度高（可達質譜儀：靈敏度高（可達fmol），分析速度快，），分析速度快， 譜圖簡單易于解析以及受緩沖液、鹽份的干擾小譜圖簡單易于解析以及受緩沖液、鹽份的干擾小 電噴霧質譜電噴霧質譜（electrospray ionization mass spectrometry， ESI-MS）電噴霧質譜儀：靈敏度高）電噴霧質譜儀：靈敏度高, 能與液相色譜、毛細管電泳等高效分離手段聯(lián)用能與液相色譜、毛細管電泳等高效分離手段聯(lián)用 主要質譜類型主要質譜類型 鑒定和注釋蛋白質的路線鑒定和注釋蛋白質的路線 基質輔助激光解吸基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜電離飛行時間質譜通過肽質譜指紋圖通過肽質

35、譜指紋圖 （peptide mass fingerprinting，PMF）和數(shù)據(jù)庫搜尋匹配）和數(shù)據(jù)庫搜尋匹配 電噴霧質譜電噴霧質譜通過測出樣品中部分肽段二級質譜信息或氨基酸通過測出樣品中部分肽段二級質譜信息或氨基酸 序列標簽和數(shù)據(jù)庫搜尋匹配序列標簽和數(shù)據(jù)庫搜尋匹配 聯(lián)合技術精確鑒定蛋白質聯(lián)合技術精確鑒定蛋白質 組織切片或印片原位質譜分析技術組織切片或印片原位質譜分析技術 兩級飛行時間串聯(lián)質譜（兩級飛行時間串聯(lián)質譜（MALDI-TOF/TOF） 傅里葉轉換回旋共振質譜（傅里葉轉換回旋共振質譜（FTMS） 表面增強激光解吸表面增強激光解吸/電離飛行時間質譜（電離飛行時間質譜（SELDI-TOF-

36、 MS） 蛋白質組學研究方法概述蛋白質組學研究方法概述 一、蛋白質組表達模式的研究方法一、蛋白質組表達模式的研究方法 n蛋白質組研究中的樣品制備蛋白質組研究中的樣品制備 n蛋白質組研究中的樣品分離蛋白質組研究中的樣品分離 n蛋白質組研究中的樣品分析鑒定蛋白質組研究中的樣品分析鑒定 n蛋白質組學研究的蛋白質組學研究的生物信息學生物信息學 n定量蛋白質組學研究定量蛋白質組學研究 二、蛋白質組功能模式的研究方法二、蛋白質組功能模式的研究方法 n蛋白質翻譯后修飾的研究蛋白質翻譯后修飾的研究 n蛋白質相互作用研究技術蛋白質相互作用研究技術 應應 用用 1、對雙向電泳結果進行圖像分析，識別差異表、對雙向電

37、泳結果進行圖像分析，識別差異表 達的蛋白質斑點；構建雙向凝膠電泳圖譜。達的蛋白質斑點；構建雙向凝膠電泳圖譜。 2、單獨或綜合運用質譜分析數(shù)據(jù)、氨基酸測序、單獨或綜合運用質譜分析數(shù)據(jù)、氨基酸測序 結果等查詢數(shù)據(jù)庫以鑒定蛋白質。結果等查詢數(shù)據(jù)庫以鑒定蛋白質。 3、構建蛋白質組數(shù)據(jù)庫。、構建蛋白質組數(shù)據(jù)庫。 蛋白質組數(shù)據(jù)庫是蛋白質組蛋白質組數(shù)據(jù)庫是蛋白質組 研究水平的標志和基礎研究水平的標志和基礎 u瑞士的瑞士的SWISS-PROT擁有目前世界上最大、種類最擁有目前世界上最大、種類最 多的蛋白質組數(shù)據(jù)庫。（多的蛋白質組數(shù)據(jù)庫。（http:/www.expasy.ch/） u目前應用最普遍的數(shù)據(jù)庫是目

38、前應用最普遍的數(shù)據(jù)庫是NRDB 和和dbEST數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)庫。 uNRDB是由是由NCBI創(chuàng)建的，是創(chuàng)建的，是NCBI的的BLAST搜索程搜索程 序的默認蛋白質序列數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫由序的默認蛋白質序列數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫由GenPept （由（由GenBank 編碼序列自動翻譯而成數(shù)據(jù)庫）、編碼序列自動翻譯而成數(shù)據(jù)庫）、 SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫、數(shù)據(jù)庫、SPupdate（每周更新的（每周更新的 SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫）、數(shù)據(jù)庫）、PIR（蛋白質信息資源（蛋白質信息資源 ）和）和 GenPeptUpdate(每天更新的每天更新的GenPept)數(shù)據(jù)庫復數(shù)據(jù)庫復合而合而 成。因此該數(shù)據(jù)庫是一個

39、較完全的，包含最新信息的成。因此該數(shù)據(jù)庫是一個較完全的，包含最新信息的 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫。 u dbEST數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫 由美國國家生物技術信息中心（由美國國家生物技術信息中心（NCBI）和歐）和歐 洲生物信息學研究所（洲生物信息學研究所（EBI）共同編輯，包括）共同編輯，包括 許多生物體的表達序列標簽（許多生物體的表達序列標簽（EST）肽）肽序列序列標標 簽簽(PST)或部分序列信息或部分序列信息 蛋白質組學研究方法概述蛋白質組學研究方法概述 一、蛋白質組表達模式的研究方法一、蛋白質組表達模式的研究方法 n蛋白質組研究中的樣品制備蛋白質組研究中的樣品制備 n蛋白質組研究中的樣品分離蛋白質組研究中的

40、樣品分離 n蛋白質組研究中的樣品分析鑒定蛋白質組研究中的樣品分析鑒定 n蛋白質組學研究的生物信息學蛋白質組學研究的生物信息學 n定量定量蛋白質組學研究蛋白質組學研究 二、蛋白質組功能模式的研究方法二、蛋白質組功能模式的研究方法 n蛋白質翻譯后修飾的研究蛋白質翻譯后修飾的研究 n蛋白質相互作用研究技術蛋白質相互作用研究技術 概念：概念：把一個基因組表達的全部蛋白質或一個復雜體系把一個基因組表達的全部蛋白質或一個復雜體系 中所有的蛋白質進行精確的定量和鑒定。中所有的蛋白質進行精確的定量和鑒定。 l 低豐度蛋白質檢測困難低豐度蛋白質檢測困難 l 蛋白質表達量差異很小，如在蛋白質表達量差異很小，如在5

41、0%以下時，精確以下時，精確 定量成為瓶頸定量成為瓶頸 l 蛋白質表達的瞬時變化蛋白質表達的瞬時變化 雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳(2-DE) 熒光差異顯示雙向電泳（熒光差異顯示雙向電泳（F-2D-DIGE） 結合了多重熒光分析的方法，在同一塊膠上共同分離多個分別由不同熒光結合了多重熒光分析的方法，在同一塊膠上共同分離多個分別由不同熒光 標記的樣品，并第一次引入了內標的概念。標記的樣品，并第一次引入了內標的概念。兩種樣品中的蛋白質采用不同的兩種樣品中的蛋白質采用不同的 熒光標記后混合，進行熒光標記后混合，進行2-DE，用來檢測蛋白質在兩種樣品中，用來檢測蛋白質在兩種樣品中表達表達情況，極情況，極

42、大地提高了結果的準確性、可靠性和可重復性大地提高了結果的準確性、可靠性和可重復性。在。在DIGE技術中，每個蛋白技術中，每個蛋白 點都有它自己的內標，并且軟件可全自動根據(jù)每個蛋白點的內標對其表達量點都有它自己的內標，并且軟件可全自動根據(jù)每個蛋白點的內標對其表達量 進行校準，保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實的。進行校準，保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實的。 原理：對于具有原理：對于具有相同離子化能力相同離子化能力的蛋白質或多肽，可以通過比較質譜峰的的蛋白質或多肽，可以通過比較質譜峰的 強度（或峰面積）得到待比較蛋白質的相對量。強度（或峰面積）得到待比較蛋白質的相對量。 蛋白質組學研究方法概述蛋白

43、質組學研究方法概述 一、蛋白質組表達模式的研究方法一、蛋白質組表達模式的研究方法 n蛋白質組研究中的樣品制備蛋白質組研究中的樣品制備 n蛋白質組研究中的樣品分離蛋白質組研究中的樣品分離 n蛋白質組研究中的樣品分析鑒定蛋白質組研究中的樣品分析鑒定 n蛋白質組學研究的生物信息學蛋白質組學研究的生物信息學 n定量蛋白質組學研究定量蛋白質組學研究 二、二、蛋白質組功能模式蛋白質組功能模式的研究方法的研究方法 n蛋白質翻譯后修飾的研究蛋白質翻譯后修飾的研究 n蛋白質相互作用研究技術蛋白質相互作用研究技術 揭示蛋白質組成員間的相互作用、相互協(xié)調的關系，并揭示蛋白質組成員間的相互作用、相互協(xié)調的關系，并 深

44、入了解蛋白質的結構與功能的相互關系，以及基因結深入了解蛋白質的結構與功能的相互關系，以及基因結 構與蛋白質結構功能的關系。構與蛋白質結構功能的關系。 主要研究目標 翻譯后修飾翻譯后修飾 糖基化糖基化 乙?；阴；?甲基化甲基化 羧基化羧基化 二硫鍵二硫鍵 磷酸化磷酸化 研究面臨的困難：研究面臨的困難： 修飾肽的檢測的高靈敏度方法修飾肽的檢測的高靈敏度方法 蛋白質翻譯后修飾的定量分析蛋白質翻譯后修飾的定量分析 合適的修飾狀態(tài)下處理和電離條件合適的修飾狀態(tài)下處理和電離條件 測定工作量巨大測定工作量巨大 生命的基本過程是不同功能蛋白質在時空上有序和協(xié)同生命的基本過程是不同功能蛋白質在時空上有序和協(xié)同

45、 作用（蛋白質復合體、多蛋白質網(wǎng)絡）作用（蛋白質復合體、多蛋白質網(wǎng)絡） 1酵母雙雜交系統(tǒng) （yeast two-hybrid system） 酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和Song等首先在研究真核基因 轉錄調控中建立 。典型的真核生物轉錄因子， 如GAL4、 GCN4等都含有二個不同的結構域： DNA結合結構域 (DNA-binding domain)和轉錄激活結構域(transcription- activating domain)。前者可識別DNA上的特異序列， 并使轉錄激活結構域定位于所調節(jié)的基因的上游， 轉 錄激活結構域可同轉錄復合體的其他成分作用， 啟動 它所調節(jié)的基因的轉錄。 主要

46、特點和優(yōu)勢主要特點和優(yōu)勢 1.使蛋白質表現(xiàn)型和基因型相聯(lián)系使蛋白質表現(xiàn)型和基因型相聯(lián)系 2.篩選篩選cDNA文庫文庫 3.真實反應體內蛋白質真實反應體內蛋白質間相互作用情況間相互作用情況 4.不需分離靶蛋白不需分離靶蛋白 5.敏感性高敏感性高 缺缺 點點 1.假陽性結果假陽性結果 2.假陰性結果假陰性結果 3.限于核內表達的蛋白質的相互作用限于核內表達的蛋白質的相互作用 4.不能檢測依靠翻譯后修飾的相互作用不能檢測依靠翻譯后修飾的相互作用 靶蛋白制備靶蛋白制備 蛋白質復合體的純化蛋白質復合體的純化 蛋白質復合體的質譜鑒定蛋白質復合體的質譜鑒定 基本步驟：基本步驟： 包括包括: 基本原理：基本原

47、理：將某種蛋白質以將某種蛋白質以共價鍵共價鍵固定在基質（如瓊固定在基質（如瓊 脂糖）上，含相互作用蛋白質的細胞裂解液過柱，先脂糖）上，含相互作用蛋白質的細胞裂解液過柱，先 用低鹽溶液洗脫下未結合的蛋白質，然后用高鹽溶液用低鹽溶液洗脫下未結合的蛋白質，然后用高鹽溶液 或或SDS溶液洗脫結合在柱子上的蛋白質，最后用多維溶液洗脫結合在柱子上的蛋白質，最后用多維 液相色譜耦聯(lián)質譜技術（液相色譜耦聯(lián)質譜技術（MDLC-ESI-MS/MS）鑒定靶）鑒定靶 蛋白的結合蛋白。蛋白的結合蛋白。 得到足夠多的保持生物活性的重組靶蛋白作為誘餌得到足夠多的保持生物活性的重組靶蛋白作為誘餌 （bait） 獲得足夠量、純

48、度高的與誘餌相互作用的蛋白質獲得足夠量、純度高的與誘餌相互作用的蛋白質 原理：以原理：以細胞內源性靶蛋白為誘餌，用抗靶蛋白抗體與細胞內源性靶蛋白為誘餌，用抗靶蛋白抗體與 細胞總蛋白進行免疫共沉淀（細胞總蛋白進行免疫共沉淀（immuno-precipitation， IP）純化靶蛋白免疫復合物，凝膠電泳分離后，質譜鑒）純化靶蛋白免疫復合物，凝膠電泳分離后，質譜鑒 定靶蛋白的結合蛋白。定靶蛋白的結合蛋白。 抗抗p53抗體與抗體與HNE1和和HNE2總蛋白進行免疫共沉淀總蛋白進行免疫共沉淀 SDS-PAGE分離免疫沉淀復合物分離免疫沉淀復合物 切取切取p53結合蛋白條帶，酶解后進行電噴霧串聯(lián)質譜結合

49、蛋白條帶，酶解后進行電噴霧串聯(lián)質譜 （LC-ESI-MS/MS）分析，得到相應的肽序列標簽）分析，得到相應的肽序列標簽 搜索數(shù)據(jù)庫搜索數(shù)據(jù)庫 生理條件下蛋白質之間的相互作用生理條件下蛋白質之間的相互作用 所有蛋白質與靶蛋白的相互作用所有蛋白質與靶蛋白的相互作用 可檢測依賴于修飾的蛋白質相互作用可檢測依賴于修飾的蛋白質相互作用 A. 靈敏性不高靈敏性不高 B. 假陽性假陽性 C. 受免疫球蛋白的干擾較大受免疫球蛋白的干擾較大 基本原理：基本原理：將高度密集排列的蛋白分將高度密集排列的蛋白分 子作為探針點陣固定在固相支持物上，子作為探針點陣固定在固相支持物上， 當與待測蛋白樣品反應時，可捕獲樣當與

50、待測蛋白樣品反應時，可捕獲樣 品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋 白進行定性和定量分析。白進行定性和定量分析。 蛋白質組學研究進展蛋白質組學研究進展 一、蛋白質組學的產(chǎn)生與發(fā)展一、蛋白質組學的產(chǎn)生與發(fā)展 二、蛋白質組學的相關概念二、蛋白質組學的相關概念 三、蛋白質組學研究方法概述三、蛋白質組學研究方法概述 四、四、蛋白質組學在腫瘤研究中的應用蛋白質組學在腫瘤研究中的應用 （一）（一）研究腫瘤發(fā)病機理、尋找用于腫瘤診斷和治療研究腫瘤發(fā)病機理、尋找用于腫瘤診斷和治療 的生物標志物的生物標志物 運用蛋白質組研究技術，通過比較腫瘤組織（細胞）和正 常組織（細胞）或腫瘤發(fā)展

51、不同階段組織中，蛋白質在表達數(shù) 量、表達水平和修飾狀態(tài)上的差異，可以發(fā)現(xiàn)與癌變相關的特 異性蛋白質，這些腫瘤相關的特異蛋白質不僅可為認識和研究 腫瘤發(fā)病機理提供線索，而且可作為腫瘤診斷和治療的生物標 志物。如Celis等對膀胱鱗狀細胞癌(SCC)和移形細胞癌（TCC） 的蛋白質組進行了比較研究，在膀胱癌病人的尿液中找到4種 與膀胱癌相關的蛋白質：其中銀屑素是SCC的生物標志，可用 于SCC的早期診斷、鑒別診斷和病情監(jiān)控。 。 （二）（二）發(fā)現(xiàn)腫瘤藥物作用的靶點發(fā)現(xiàn)腫瘤藥物作用的靶點 藥物多是通過特異地作用于體內的靶蛋白質而重新調整病人藥物多是通過特異地作用于體內的靶蛋白質而重新調整病人 的生理

52、功能達到治療目的。新的藥物靶蛋白在藥學研究中有重要的生理功能達到治療目的。新的藥物靶蛋白在藥學研究中有重要 作用?；蚪M研究提示，作用?；蚪M研究提示，控制人類疾病的潛在藥物靶蛋白控制人類疾病的潛在藥物靶蛋白，粗略，粗略 估計大約有估計大約有5000-100005000-10000個。然而在過去的個。然而在過去的100100年年發(fā)現(xiàn)的藥物靶蛋發(fā)現(xiàn)的藥物靶蛋 白只有白只有500-1000500-1000個。因此后基因組時代的一個緊迫任務是發(fā)現(xiàn)這個。因此后基因組時代的一個緊迫任務是發(fā)現(xiàn)這 些藥物靶蛋白，為開發(fā)治療人類疾病的新藥提供依據(jù)。些藥物靶蛋白，為開發(fā)治療人類疾病的新藥提供依據(jù)。 用蛋白質組研

53、究技術，通過比較腫瘤組織（細胞）和正常組用蛋白質組研究技術，通過比較腫瘤組織（細胞）和正常組 織（細胞）或腫瘤發(fā)展不同階段組織中，蛋白質在表達數(shù)量、表織（細胞）或腫瘤發(fā)展不同階段組織中，蛋白質在表達數(shù)量、表 達水平和修飾狀態(tài)上的差異，可以發(fā)現(xiàn)達水平和修飾狀態(tài)上的差異，可以發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性蛋白質腫瘤特異性蛋白質，這些，這些 蛋白質不僅可作為蛋白質不僅可作為腫瘤診斷的標志物腫瘤診斷的標志物，而且可作為，而且可作為抗腫瘤藥物作抗腫瘤藥物作 用靶點用靶點，用于，用于治療腫瘤藥物的設計和開發(fā)治療腫瘤藥物的設計和開發(fā)。 （三）（三）腫瘤藥物作用機理研究腫瘤藥物作用機理研究 目前，一些抗腫瘤藥物在體內的作用機

54、理并不清楚。應用蛋目前，一些抗腫瘤藥物在體內的作用機理并不清楚。應用蛋 白質組研究技術，分析藥物處理過的細胞白質組研究技術，分析藥物處理過的細胞/ /組織或體液表達的蛋組織或體液表達的蛋 白質組，比較治療前后的蛋白質組的差異、鑒定其中發(fā)現(xiàn)相應變白質組，比較治療前后的蛋白質組的差異、鑒定其中發(fā)現(xiàn)相應變 化的蛋白質，可揭示藥物的作用機理?；牡鞍踪|，可揭示藥物的作用機理。 如比較抗肝癌化合物如比較抗肝癌化合物OGT 719OGT 719和和5-FU5-FU處理過的腫瘤細胞株的蛋處理過的腫瘤細胞株的蛋 白質表達譜，發(fā)現(xiàn)二者處理過的細胞蛋白質表達譜發(fā)生了類似的白質表達譜，發(fā)現(xiàn)二者處理過的細胞蛋白質表達譜發(fā)生了類似的 變化，這提示變化，這提示OGT 719OGT 719與已知的與已知的5-FU5-FU的作用機制類似，其中核糖的作用機制類似，其中核糖 體體RNARNA結合蛋白（嘧啶合成過程中的一種重要蛋白）變化顯著，結合蛋白（嘧啶合成過程中的一種重要蛋白）變化顯著， 可能是二者作用