微生物快速檢測技術

1、8、微生物的快速檢測、微生物的快速檢測 常見微生物檢測項目常見微生物檢測項目 常規(guī)微生物項目：細菌總數、大腸菌群、常規(guī)微生物項目：細菌總數、大腸菌群、 大腸桿菌、酵母總數、霉菌總數。大腸桿菌、酵母總數、霉菌總數。 致病微生物項目：沙門氏菌、李斯特菌、致病微生物項目：沙門氏菌、李斯特菌、 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157O157：H7H7、 彎曲桿菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志彎曲桿菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志 賀氏菌、假單胞菌等。賀氏菌、假單胞菌等。 國家標準國家標準GB/T 4789 1-40GB/T 4789 1-40：食品衛(wèi)生微生物學：食品衛(wèi)生微生物學 檢驗：菌落總

2、數測定、大腸菌群計數、沙門氏檢驗：菌落總數測定、大腸菌群計數、沙門氏 菌檢驗、志賀氏菌檢驗、致泄大腸埃希氏菌檢菌檢驗、志賀氏菌檢驗、致泄大腸埃希氏菌檢 驗、副溶血性弧菌檢驗、小腸結腸炎耶爾森氏驗、副溶血性弧菌檢驗、小腸結腸炎耶爾森氏 菌檢驗、空腸彎曲菌檢驗、金黃色葡萄球菌檢菌檢驗、空腸彎曲菌檢驗、金黃色葡萄球菌檢 驗、溶血性鏈球菌檢驗、肉毒梭菌及肉毒毒素驗、溶血性鏈球菌檢驗、肉毒梭菌及肉毒毒素 檢驗、產氣莢膜梭菌檢驗、蠟樣芽孢桿菌檢驗、檢驗、產氣莢膜梭菌檢驗、蠟樣芽孢桿菌檢驗、 霉菌和酵母菌計數、常見產毒霉菌的鑒定、椰霉菌和酵母菌計數、常見產毒霉菌的鑒定、椰 毒假單胞菌酵米面亞種檢驗、單核細胞

3、增生李毒假單胞菌酵米面亞種檢驗、單核細胞增生李 斯特氏菌檢驗、腸桿菌科噬菌體檢驗、大腸菌斯特氏菌檢驗、腸桿菌科噬菌體檢驗、大腸菌 群快速測定、雙歧桿菌檢驗、乳酸菌檢驗、大群快速測定、雙歧桿菌檢驗、乳酸菌檢驗、大 腸埃希氏菌腸埃希氏菌O157O157：H7/NMH7/NM檢驗、阪崎腸桿菌檢檢驗、阪崎腸桿菌檢 驗等。驗等。 政府檢測機構為什么需要微生物 快速檢測？ 提高檢測效率 節(jié)約人力資源成本 與國際接軌 國內外食品安全形勢嚴峻，惡性事件不斷發(fā) 生。 歐洲“二噁英”、“瘋牛病”（20世紀90年 代） 日本大腸桿菌O157:H7中毒（1996） 中國SARS（2003） 、東南亞國家禽流感 （20

4、04） 美國菠菜大腸桿菌O157:H7污染事件（2006） 日益嚴峻的食品安全局勢的需要 企業(yè)為什么需要微生物快速檢測？ 市場銷售環(huán)節(jié)要求快速出貨。尤其是一些保質 期較短的產品。 減少物流的壓力，盡可能減少倉存，加快資金 周轉。 節(jié)約人力資源成本（外資企業(yè)尤其突出） 對于運行HACCP質量保證體系的企業(yè)來說，快 速檢測方法尤其重要?？梢钥焖贆z測原料及半 成品的污染情況，以采取相應的措施控制最終 產品的微生物超標情況。 快速檢測方法勢在必行！ 國外許多政府檢測機構都在大量使用快速檢測 方法，尤其是ATP法、免疫法、阻抗法和顯色 培養(yǎng)基法在國外應用相當成功。 國內的許多政府檢測機構也都已經在使用或

5、正 在考慮使用國外先進的快速檢測技術。 從長遠發(fā)展趨勢來說，快速方法是微生物檢測 的一大方向。 一、常規(guī)微生物快速檢測技術現(xiàn)狀一、常規(guī)微生物快速檢測技術現(xiàn)狀 傳統(tǒng)計數改良法： 1、螺旋平板計數法：螺旋接種儀菌落計數 2、濾膜法：常用于一些可過濾樣品的檢測。 3、紙片法：培養(yǎng)基固定在載體上。省去制做 培養(yǎng)基的時間。主要用于細菌總數檢測。 4、其它：如Simplate即用膠,改良MPN產品。 螺旋平板法螺旋平板法 DWS螺旋平板接種儀 aColyte自動菌落計數儀 螺旋平板原理螺旋平板原理 平皿旋轉 接種針往外移動 同時自動將樣品 稀釋1000倍 螺旋平板法的優(yōu)缺點螺旋平板法的優(yōu)缺點 優(yōu)點：優(yōu)點：

6、 與傳統(tǒng)方法相比，無需稀釋與傳統(tǒng)方法相比，無需稀釋3 3個梯度，個梯度， 每個梯度倒每個梯度倒2 2個平板，節(jié)省了大量人力物個平板，節(jié)省了大量人力物 力。力。 缺點：缺點： 檢測時間檢測時間并沒有縮短并沒有縮短，菌落總數仍需，菌落總數仍需 要培養(yǎng)要培養(yǎng)4848小時。小時。 需要配合自動菌落計數儀，否則人工需要配合自動菌落計數儀，否則人工 計數更麻煩。計數更麻煩。 濾濾 膜膜 法法 濾膜法常用于可過濾樣品的微生物檢測。 優(yōu)點：靈敏度增大，菌落無擴散情況， 便于計數。 缺點：需要額外的支出購買真空泵，多 聯(lián)支架及一次性濾膜；如果抽濾過程空 氣潔凈度不夠，有可能造成二次污染， 尤其是對菌數要求特別嚴

7、格的產品，如 啤酒，澄清果汁，桶裝飲用水等。 皿膜法皿膜法以以紙片法紙片法為代表為代表 優(yōu)點：無需制備培養(yǎng)基，攜帶方便，非漫延菌落 計數較方便。 缺點：不能節(jié)省檢測時間。檢測成本相對偏高。 大腸菌群紙片存在與MPN法無法對應的問題， 金黃色葡萄球菌紙片存在取樣量太低的問題。目 前僅細菌總數紙片有一些用戶。 紙片法是目前被廣泛接受的方法。國標 餐具大腸菌群采用的就是紙片法。 其它即用膠，其它即用膠，MPN改良法改良法 Simplate colilert 主要用于 水樣或澄 清樣品的 大腸菌群 或大腸桿 菌檢測 SimPlateSimPlateTM TMTPC TPC 法：基于食源性細菌的蛋白質法

8、：基于食源性細菌的蛋白質 有特異性酶類，有特異性酶類，TPCTPC培養(yǎng)基內含有多種細菌酶培養(yǎng)基內含有多種細菌酶 類所對應的底物。檢樣被細菌污染時，只要具類所對應的底物。檢樣被細菌污染時，只要具 有一種酶的活性即能與底物作用生成有一種酶的活性即能與底物作用生成4-4-甲基傘甲基傘 形酮，培養(yǎng)形酮，培養(yǎng)24h24h后，在紫外線照射下，發(fā)出藍后，在紫外線照射下，發(fā)出藍 色熒光。色熒光。 食源性細菌懸浮于食源性細菌懸浮于TPCTPC培養(yǎng)基表面，在分隔的培養(yǎng)基表面，在分隔的 小池內能迅速進行生化反應，若有檢樣顆粒亦小池內能迅速進行生化反應，若有檢樣顆粒亦 無干擾；它不是由無干擾；它不是由48h48h形成

9、的菌落來計數，而形成的菌落來計數，而 是是24h24h后在紫外燈照射下記錄培養(yǎng)皿內能發(fā)出后在紫外燈照射下記錄培養(yǎng)皿內能發(fā)出 藍色熒光的陽性池數，進而由最大近似值藍色熒光的陽性池數，進而由最大近似值(MPN) (MPN) 表查出細菌的表查出細菌的MPNMPN。陽性池數與。陽性池數與MPN MPN 呈松泊分呈松泊分 布。布。 固定底物技術酶底物法，需要固定底物技術酶底物法，需要coliertcoliert試試 劑劑 采用大腸菌群細菌能產生采用大腸菌群細菌能產生D-D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 分解分解ONPGONPG（鄰硝基苯（鄰硝基苯-D-D-半乳吡喃糖苷）半乳吡喃糖苷） 使培養(yǎng)液呈黃色，以及大腸埃

10、希氏菌產使培養(yǎng)液呈黃色，以及大腸埃希氏菌產 生生D-D-葡萄糖醛酸酶分解葡萄糖醛酸酶分解MUGMUG（4-4-甲基傘形甲基傘形 酮酮-D-D-葡萄糖醛酸苷葡萄糖醛酸苷 ）使培養(yǎng)液在波長）使培養(yǎng)液在波長 366nm366nm紫外光下產生熒光的原理，來判斷紫外光下產生熒光的原理，來判斷 水樣水樣中是否含有大腸菌群及大腸埃希氏中是否含有大腸菌群及大腸埃希氏 菌。只需菌。只需2424小時即可同時定量出水樣中小時即可同時定量出水樣中 大腸菌群和大腸埃希氏菌的大腸菌群和大腸埃希氏菌的MPNMPN值。值。 二、常規(guī)微生物快速檢測技術現(xiàn)狀二、常規(guī)微生物快速檢測技術現(xiàn)狀 快速檢測微生物數量的新方法： 1、ATP

11、法：目前產品較多，如CHARM， Biotrace, .等。 2、電化學法：Sy-Lab公司Bactrac 4300，Tempo, 3、顏色變化：如梅里埃的Bact/Alert和Foss的 MicroFoss。 4、流式細胞技術及激光掃描技術 5、其它：熱量法，放射測量法 表面潔凈的檢測方法 微生物學法：紙片、瓊脂板、 棉簽拭子、海綿拭子 非微生物學法（快速法）： ATP(三磷酸腺苷，蛋白質, 降 解糖、NADP(輔酶II)，其它。 ATP來源于 細菌細菌 酵母酵母 霉菌霉菌 生物膜生物膜 組織殘留組織殘留 廢棄物污染 人的污染 （一）（一）ATPATP法法 1. 人接觸設備或器具人接觸設備或

12、器具 2. 設備或器具被污染設備或器具被污染 3. 清洗不正常清洗不正常 4. 非正常的敏感物污染非正常的敏感物污染 5. 微生物污染微生物污染 ATP+ O + Luciferin+ Luciferase = 2 O xyluciferin+ AM P+ PPi+ CO 2 檢測原理 熒光素 熒光素酶 腺苷一磷酸 氧合熒光素 熒光 ATP法兩大用途法兩大用途 1、用于食品、化妝品和藥品企業(yè)對生產 線和管道進行快速清潔程度檢測。政府 檢測機構用ATP方法缺乏法律依據。ATP 法與微生物數量沒有必然的聯(lián)系。 2、改良后用于食品、化妝品的商業(yè)無菌 檢測或終產品檢驗。 LUMT清潔程度快速檢測 1)

13、1)將水樣在玻璃纖維過濾器上過濾以便富集微生物；將水樣在玻璃纖維過濾器上過濾以便富集微生物； 2)2)用適當的溶解劑溶解細胞；用適當的溶解劑溶解細胞； 3)3)用適當的萃取劑萃取用適當的萃取劑萃取ATPATP； 4)4)將將ATPATP的萃取液加到盛有螢光素、螢光素酶的試管中，的萃取液加到盛有螢光素、螢光素酶的試管中， 并用光度計記錄下所產生光的量，將此讀數和并用光度計記錄下所產生光的量，將此讀數和ATPATP濃度標濃度標 準曲線相比較，就可得到待測樣品中準曲線相比較，就可得到待測樣品中ATPATP含量；用得到的含量；用得到的 ATPATP含量確定水樣中細菌數量。含量確定水樣中細菌數量。 LU

14、M-T的獨特優(yōu)勢 CHEF 熟肉制品成熟度檢驗 MicroQ 水中微生物污染程度檢測 Cidelite 殺蟲劑殘留初篩 Paslite 牛奶巴氏消毒效果 Somalite 體細胞計數 SL/MRL test 抗生素殘留檢測（連接 ROSAimager) Charm ATP 檢測檢測 基于基于ATP原理的用于成品檢測的原理的用于成品檢測的 微生物檢測系統(tǒng)微生物檢測系統(tǒng) CharmLUM-96 （用于UHT產品-高溫 瞬間滅菌） Biotrace Celsis（主要用于化妝品） Millipore公司的MicroScan Celsis和和LUM-96 保溫2天，檢測30分鐘（96個樣） ATP法檢

15、測成品的優(yōu)缺點法檢測成品的優(yōu)缺點 優(yōu)點：LUM-96通常用于進行商業(yè)無菌檢測。 可大大縮短庫存時間，減少物流壓力和成本。 缺點：ATP方法需要消耗大量的較昂貴的試劑， 對儀器的清洗保養(yǎng)要求特別高。另外，客戶通 常懷疑假陰性的可能，特別是用ATP單個檢測 代替常規(guī)微生物和致病微生物檢測，其風險是 一定存在的。(如保溫增菌時間不夠，菌數未達 到一定數量，取樣量太小，由于培養(yǎng)基原因， 目標致病菌未大量增菌等原因) Millipore公司最新推出的公司最新推出的MicroStar MicroStar的原理及局限性的原理及局限性 MicroStar快速微生物檢測系統(tǒng)是結合了 生物熒光、膜過濾及CCD熒光

16、照相檢測 等技術的新型檢測系統(tǒng). 可過濾樣品經膜過濾后，將菌截留在特 殊的濾膜上，濾膜放置在培養(yǎng)基表面增 菌后取出，加ATP釋放劑，然后加熒光素 和熒光素酶，顯示的熒光信號在熒光顯 微鏡或熒光檢測器下觀察并計數。 MicroStar的優(yōu)缺點的優(yōu)缺點 優(yōu)點：縮短培養(yǎng)時間，提高靈敏度。適 合于菌數較低的可過濾產品使用。 缺點：儀器較昂貴，運行成本也非常貴。 不能用于檢測未知的可能菌數較高的樣 品(不知稀釋多少倍，因菌數必須稀釋至 80個左右)。整個檢測時間還不夠快，通 常需16小時以上。 （二）電化學方法（二）電化學方法(電導率法或電阻抗法電導率法或電阻抗法) 奧地利Sylab公司的Bactrac

17、4300和 Biotrac4200 梅里埃公司的Bactometer和Tempo 英國Multhus公司(已倒閉) 英國DWS公司的Rabit 外觀比較外觀比較 Bactrac4300 梅里埃的BactoMeter DWS公司的Rabit 馬色斯120 世界上最好的電化學微生物快速檢測產品世界上最好的電化學微生物快速檢測產品 Bactrac 4300系統(tǒng)系統(tǒng) Sy-lab Bactrac4300常規(guī)微生物項目快速檢測技術 MicroFoss(Biosys) 微生物自動監(jiān)測儀微生物自動監(jiān)測儀 微生物生長導致培養(yǎng)基 pH值發(fā)生變化，由光學 檢測器檢測底部瓊脂層 的顏色變化，記錄達到 突變點的時間。

18、 Microfoss的特點的特點 與阻抗法類似，可以實現(xiàn)快速檢測。 缺點：需要購買原廠的預裝培養(yǎng)基，應 用范圍受限制，成本高昂。因此在我國 目前還沒有用戶。 梅里埃的梅里埃的BacT/Alert微生物檢測儀微生物檢測儀 基于微生物生成產生CO2的原 理。CO2積累越多，底部的 CO2傳感器變黃，由LED發(fā)射 一束光至底部，探頭檢測反射 光的強度。光強度與微生物數 量有一定關系。 方法較新，用戶還需 要一個過程了解。 流式細胞計數技術流式細胞計數技術 用于非過濾產品 流式細胞流式細胞 : 線性流體 單細胞分析 靈敏的檢測頭 流式細胞術（流式細胞術（FCMFCM）是對于處在快速直線流動狀態(tài)中的細胞

19、）是對于處在快速直線流動狀態(tài)中的細胞 或生物顆粒進行多參數的、快速的定量分析和分選的技術或生物顆粒進行多參數的、快速的定量分析和分選的技術 （三）流式細胞技術及激光掃描技術（三）流式細胞技術及激光掃描技術 FOSS公司公司 BactoScan FC牛奶中總菌數快速檢測儀牛奶中總菌數快速檢測儀 采用流式細胞原 理。對微生物進 行核酸染色，用 流式細胞技術進 行計數 BactoScan FC的優(yōu)缺點的優(yōu)缺點 優(yōu)點：速度快(50-150樣品/小時) 缺點：死活細胞一起檢測，消耗成本較 高，儀器比較難保養(yǎng)。靈敏度不夠高。 適合牛奶企業(yè)檢測原奶中細菌總數。 美國美國Chemunex公司公司 微生物快速檢

20、測系統(tǒng)微生物快速檢測系統(tǒng) 美國Chemunex公司將流式細胞技術與活細胞熒 光探針標記及激光掃描技術相結合，推出的最 新一代的速度更快的Bactiflow以及更高端的 ScanRDI和D-count微生物快速檢測儀。 其最大的特點是只檢測活細胞數，速度極快， 處理量大。與FOSS的BactoScan FC檢測死活細 胞都檢測不同。 是目前國際上正在認可的生物熒光定量檢測微 生物數量的兩種方法之一。另一種是Millipore 的一款叫MicroStar的基于ATP檢測的產品。 熒光酶標記原理熒光酶標記原理 直接單細胞標記直接單細胞標記 ( (包括孢子包括孢子) ) 細胞無增菌要求細胞無增菌要求

21、標記在標記在9090分鐘內完成分鐘內完成 直接對活細胞和酵母進行標記直接對活細胞和酵母進行標記 標記的細菌標記的細菌 標記后的酵母標記后的酵母 標記后的霉菌標記后的霉菌 ChemScan RDI 三個簡單的步驟三個簡單的步驟 檢測步驟檢測步驟 - TVC 1. 過濾過濾2. 標記標記3. 激光掃描激光掃描 樣品過濾樣品過濾 預標記預標記 60 min 濾膜轉移濾膜轉移 ChemScanRDI 儀器分析儀器分析 標記標記 30 min ChemScan RDI 主機主機 激光掃描分析儀激光掃描分析儀 3 3 分鐘分析時間分鐘分析時間 結果直接顯示細胞個數結果直接顯示細胞個數 Laser scan

22、ning Microscope Confirmation Bactiflow 適合實驗室或研適合實驗室或研 究用究用 日處理量不大于日處理量不大于 40個樣品個樣品 DCount Real-time analyser D-count 適合實驗室或生適合實驗室或生 產現(xiàn)場使用產現(xiàn)場使用 日處理量大于日處理量大于40 個樣品的場合個樣品的場合 標記和檢測原理 Enzyme Viability substrate Free fluorochrome Micro-organism Detecto r Detector Lase r Flow Cell 細胞標記細胞標記 12 minutes 細胞計數細

23、胞計數 1 minute 自動吸樣 l 無需預處理 l 每批可做64 個樣，含陰性和陽性質控 最小的人力要求 全自動標記和過濾 l 加所有要求的標記試劑 l 控制溫育時間和溫度 l 去除大的顆粒 (25 m尼龍網過濾) 快速敏感的分析 l 每小時50個樣品 l 直接按 個/mL顯示結果 數據處理 區(qū)分微生物和顆粒的功能強大區(qū)分微生物和顆粒的功能強大 產品應用范圍廣產品應用范圍廣 增強靈敏度增強靈敏度 直接顯示細胞數直接顯示細胞數 無需數據解釋無需數據解釋 直觀易讀直觀易讀 完整的數據追溯性完整的數據追溯性 易于確證易于確證 三種型號的差異三種型號的差異 產 品 型 號 主 要 參 數 總 活

24、菌 數 酵 母 和 霉 菌 數 大 腸 桿 菌 和 大 腸 菌 群 賈 第 鞭 毛 蟲 和 隱 孢 子 蟲 處 理 速 度 靈 敏 度 適 用 范 圍 BactiflowChemScan RDIReal-time analyser D-count 10-14/個 樣 品小 時 100-100,000/g個 細 胞 適 用 于 含 菌 量 較 高 的 食 品 、 化 妝 品 及 水 等 樣 品 。 每 天 檢 測 量 不 大 于 個 樣 品 。40 適 用 于 含 菌 量 較 低 的 不 可 過 濾 的 食 品 、 化 妝 品 等 樣 品 。 每 天 檢 測 量 大 于 個 樣 品 。40 90

25、分 鐘 內 出 定 量 結 果 1-5000個 細 胞 特 別 適 用 于 醫(yī) 藥 工 業(yè) 、 飲 用 水 尤 其 是 直 飲 水 中 對 可 過 濾 的 樣 品 進 行 有 害 腸 道 菌 及 原 生 動 物 進 行 快 速 檢 測 50/個 樣 品小 時 1-1000cfu/g(mL) 哪些類型客戶可以使用？哪些類型客戶可以使用？ 大型食品、化妝品、藥品企業(yè)，對快速 檢測速度及樣品處理量要求高。 目前儀器非常貴，運作成本與免疫法相 似。 三、致病菌快速檢測方法三、致病菌快速檢測方法 顯色培養(yǎng)基法：技術成熟，產品很多。顯色培養(yǎng)基法：技術成熟，產品很多。 免疫學方法：產品最多，特異性和敏感性都

26、很高，免疫學方法：產品最多，特異性和敏感性都很高， 但有假陽性存在，陽性結果需要確認。通常的原理但有假陽性存在，陽性結果需要確認。通常的原理 有有EIAEIA（酶聯(lián)免疫），（酶聯(lián)免疫），ELISAELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗），（酶聯(lián)免疫吸附試驗）， GLISAGLISA（夾心酶聯(lián)免疫吸附法（夾心酶聯(lián)免疫吸附法 ），熒光酶免、免疫），熒光酶免、免疫 磁分離等方法。市場上的產品多，如磁分離等方法。市場上的產品多，如 BioMeriux,Tecra, Neogen,Biocontrol, MatrixBioMeriux,Tecra, Neogen,Biocontrol, Matrix等。等。 分子

27、生物學方法：以基因探針檢測法和分子生物學方法：以基因探針檢測法和PCRPCR法為主。法為主。 基因芯片：研究熱點?；蛐酒貉芯繜狳c。 致病微生物快速檢測產品致病微生物快速檢測產品 免疫磁分離法免疫磁分離法 Matrix公司的公司的Pathatrix致病菌快速檢測系統(tǒng)致病菌快速檢測系統(tǒng) ELISA方法方法澳洲澳洲TECRA公司的免疫捕獲快速檢測公司的免疫捕獲快速檢測 分子生物學方法分子生物學方法(基因探針及基因探針及PCR方法方法) GLISA-膠體金免疫層析致病菌快速檢測條膠體金免疫層析致病菌快速檢測條 熒光酶免熒光酶免Vidas系列產品系列產品(略略) 顯色培養(yǎng)基顯色培養(yǎng)基 法國法國AES

28、公司公司 GLISA膠體金免疫層析檢測條膠體金免疫層析檢測條 氯金酸氯金酸(HAuCl4)(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小在還原劑作用下，可聚合成一定大小 的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液。由于靜電作用的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液。由于靜電作用 而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金標記，而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金標記， 實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的 包被過程。包被過程。 膠體金檢測條在臨床診斷中廣泛使用。方法成熟，使膠體金檢測條在臨床診斷中廣泛使用。方法成熟，使 用簡便。用簡便。 關鍵是制備單

29、克隆抗體，然后與膠體金交聯(lián)，在親水關鍵是制備單克隆抗體，然后與膠體金交聯(lián)，在親水 紙層析條上固定。紙層析條上固定。 膠體金微生物檢測條在國內已經有不少產品，但用戶膠體金微生物檢測條在國內已經有不少產品，但用戶 并不多，主要是質量不穩(wěn)定。并不多，主要是質量不穩(wěn)定。 外來的膠體金微生物檢測產品比較多。外來的膠體金微生物檢測產品比較多。 （一）免疫學方法（一）免疫學方法 常見的膠體金檢測條舉例常見的膠體金檢測條舉例 大腸桿菌O157 李斯特氏菌 沙門氏菌 膠體金檢測條的優(yōu)缺點膠體金檢測條的優(yōu)缺點 膠體金檢測方法屬于免疫檢測法，檢測 的是死菌和活菌。 一般需要增菌過夜。 增菌后的檢測非常簡單，約10分

30、鐘一般 能完成。 無需專門的檢測儀器。 進口的檢測條的價格比較高，通常要30 90元。 （二）分子生物學方法（二）分子生物學方法 基因探針法及基因探針法及PCRPCR方法在國外已經有相當成熟方法在國外已經有相當成熟 的表現(xiàn)。的表現(xiàn)。 有普通有普通PCRPCR，熒光，熒光PCRPCR，實時熒光，實時熒光PCRPCR（定量（定量PCRPCR） 等多種方法。等多種方法。 基因探針法一般也需要增菌，然后加探針試劑基因探針法一般也需要增菌，然后加探針試劑 雜交，然后在熒光顯微鏡熒光檢測器下獲得結雜交，然后在熒光顯微鏡熒光檢測器下獲得結 果。果。 PCRPCR方法一般不需增菌太長時間，通過方法一般不需增菌

31、太長時間，通過PCRPCR方法方法 對待測微生物的特征片斷進行擴增，然后通過對待測微生物的特征片斷進行擴增，然后通過 凝膠電泳或熒光凝膠電泳或熒光PCRPCR技術判斷結果。技術判斷結果。 分子生物學方法應用前景分子生物學方法應用前景 試劑盒開發(fā)相對比較容易。只要找出特試劑盒開發(fā)相對比較容易。只要找出特 征的基因片斷，合成出引物即可。征的基因片斷，合成出引物即可。 目前客戶比較關注的致病菌，包括沙門目前客戶比較關注的致病菌，包括沙門 氏、李斯特氏、大腸桿菌氏、李斯特氏、大腸桿菌O157O157、副溶血、副溶血 弧菌、霍亂弧菌、志賀氏菌等均有弧菌、霍亂弧菌、志賀氏菌等均有PCRPCR試試 劑盒供應

32、。劑盒供應。 常見的基因探針方法或儀器常見的基因探針方法或儀器 BAX Gene-trak Gen-probe Vermicon 分子生物學方法病原菌檢測系統(tǒng)的優(yōu)缺點分子生物學方法病原菌檢測系統(tǒng)的優(yōu)缺點 分子生物學方法檢測致病菌，特異性較分子生物學方法檢測致病菌，特異性較 強，技術較為前沿，特別是相對國標方強，技術較為前沿，特別是相對國標方 面來說。面來說。 但國外用戶反映其假陽性概率仍然較高，但國外用戶反映其假陽性概率仍然較高， 因此只能作為一種初篩方法。因此只能作為一種初篩方法。 速度方面：仍然需要增菌，一般是第二速度方面：仍然需要增菌，一般是第二 天出結果，與免疫法比沒有速度優(yōu)勢天出結果

33、，與免疫法比沒有速度優(yōu)勢 目前不少產品已經通過目前不少產品已經通過AOACAOAC的認證。的認證。 （三）顯色培養(yǎng)基技術（三）顯色培養(yǎng)基技術 用顯色培養(yǎng)基鑒定微生物是一種新的微生物快速檢測用顯色培養(yǎng)基鑒定微生物是一種新的微生物快速檢測 技術。該技術以生化反應為基礎技術。該技術以生化反應為基礎, , 通過在培養(yǎng)基中加通過在培養(yǎng)基中加 入細菌特異性酶的顯色底物直接根據菌落顏色對菌種入細菌特異性酶的顯色底物直接根據菌落顏色對菌種 作出鑒定。常見食源性致病菌檢測中作出鑒定。常見食源性致病菌檢測中, , 李斯特菌顯色李斯特菌顯色 培養(yǎng)基培養(yǎng)基(BCMTM (BCMTM L isteria m onocy

34、 togenesL isteria m onocy togenes, Rap , Rap idLMONO agar, CHROMagarTM idLMONO agar, CHROMagarTM L isteriaL isteria) ) 、大腸桿、大腸桿 菌顯色培養(yǎng)基菌顯色培養(yǎng)基(CHROMagarTM (CHROMagarTM EcoliEcoli) ) 、沙門氏菌顯色、沙門氏菌顯色 培養(yǎng)基培養(yǎng)基(Rambach agar) (Rambach agar) 、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基 (CHROMagar (CHROMagar S taphy lococcusaure

35、usS taphy lococcusaureus) ) 等已被廣泛應等已被廣泛應 用于食品、醫(yī)藥和環(huán)境監(jiān)測等領域用于食品、醫(yī)藥和環(huán)境監(jiān)測等領域, , 極大提高了微生極大提高了微生 物檢測的效率。但是物檢測的效率。但是, , 顯色培養(yǎng)基也存在一些假陽顯色培養(yǎng)基也存在一些假陽( (陰陰) ) 性等問題性等問題, , 其設計尚待優(yōu)化。其設計尚待優(yōu)化。 大腸桿菌顯色培養(yǎng)基 利用大腸桿菌利用大腸桿菌( ( Escherichia coliEscherichia coli) )特異性酶特異性酶 檢測鑒定大腸桿菌已十分普遍檢測鑒定大腸桿菌已十分普遍, , 大約大約96%96%98%98% 的大腸桿菌產生的大

36、腸桿菌產生2D22D2葡萄糖苷酸酶葡萄糖苷酸酶 (2D2Gud) , (2D2Gud) , 絕大部分沙門氏菌、志賀氏菌絕大部分沙門氏菌、志賀氏菌 和耶爾森氏菌不能產生和耶爾森氏菌不能產生Gud, Gud, 因此利用因此利用GudGud酶底酶底 物可以有效的檢測大腸桿菌。物可以有效的檢測大腸桿菌。 目前開發(fā)的顯色培養(yǎng)基常用酶底物有目前開發(fā)的顯色培養(yǎng)基常用酶底物有: 52: 52溴溴 242242氯氯232232吲哚吲哚22D222D2葡萄糖苷酸葡萄糖苷酸(X2Gluc) (X2Gluc) 、 鄰硝基酚鄰硝基酚2D2D葡萄糖苷酸葡萄糖苷酸(PNPG) , (PNPG) , 底物被底物被GudGud

37、 水解后產生顯色物質使菌落呈現(xiàn)特殊的藍色或水解后產生顯色物質使菌落呈現(xiàn)特殊的藍色或 黃色。法國科瑪嘉黃色。法國科瑪嘉CHROMagar EcoliCHROMagar Ecoli是目前應是目前應 用較廣泛的大腸桿菌顯色培養(yǎng)基用較廣泛的大腸桿菌顯色培養(yǎng)基, , 在這種培養(yǎng)在這種培養(yǎng) 基培養(yǎng)基培養(yǎng)24h24h后后, , 大腸桿菌呈現(xiàn)藍色菌落。大腸桿菌呈現(xiàn)藍色菌落。 沙門氏菌顯色培養(yǎng)基 沙門氏菌沙門氏菌( ( SalmonellaSalmonella spp.) spp.)也是一類重要的也是一類重要的 食源性致病菌食源性致病菌, , 常規(guī)分離鑒定需要非選擇性預常規(guī)分離鑒定需要非選擇性預 增菌、選擇增菌

38、、選擇分離平板鑒定等步驟增菌、選擇增菌、選擇分離平板鑒定等步驟, , 操作十分繁瑣。操作十分繁瑣。 德國德國MerckMerck公司生產的顯色培養(yǎng)基公司生產的顯色培養(yǎng)基Rambach Rambach agaragar以丙烯乙二醇和以丙烯乙二醇和5252溴溴242242氯氯232232吲哚吲哚22D22D 半乳糖吡喃糖苷酸半乳糖吡喃糖苷酸(X2GAL) (X2GAL) 為底物檢測沙門氏為底物檢測沙門氏 菌菌, , 沙門氏菌能水解乙二醇產酸沙門氏菌能水解乙二醇產酸, , 不能水解不能水解 X2GAL, X2GAL, 在培養(yǎng)基上產生特殊的紅色菌落。臨在培養(yǎng)基上產生特殊的紅色菌落。臨 床檢測結果表明其效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)基床檢測結果表明其效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)基BSBS、 SS, SS, 且假陽性率較低。且假陽性率較低。 金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基 金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌( (Staphylococ