有機溶劑沉淀法分離與純化蛋白質(zhì)

1、有機溶劑沉淀法分離與純化蛋白質(zhì)有機溶劑能降低溶液的電解常數(shù)，從而增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，導致溶解度的降低；另外，有機溶劑與水的作用，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，故蛋白質(zhì)在一定濃度的有機溶劑中的溶解度差異而分離的方法，稱“有機溶劑分段沉淀法”，它常用于蛋白質(zhì)或酶的提純。使用的有機溶劑多為乙醇和丙酮。 高濃度有機溶劑易引起蛋白質(zhì)變性失活，操作必須在低溫下進行，并在加入有機溶劑時注意攪拌均勻以避免局部濃度過大。由此法析出的沉淀一般比鹽析容易過濾或離心沉降，分離后的蛋白質(zhì)沉淀，應立即用水或緩沖液溶解，以降低有機溶劑濃度。 操作時的ph值大多數(shù)控制在待沉淀蛋白質(zhì)的等電點附近，有機溶劑在中性鹽存在時能增

2、加蛋白質(zhì)的溶解度，減少變性，提高分離的效果，在有機溶劑中添加中性鹽的濃度為0.05mol/l左右，中性鹽過多不僅耗費有機溶劑，可能導致沉淀不好。 沉淀的條件一經(jīng)確定，就必須嚴格控制，才能得到可重復的結(jié)果。有機溶劑濃度通常以有機溶劑和水容積比或用百分濃度表示。有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)分辨力比鹽析法好，溶劑易除去；缺點是易使酶和具有活性的蛋白質(zhì)變性。故操作時要求條件比鹽析嚴格。對于某些敏感的酶和蛋白質(zhì)，使用有機溶劑沉淀尤其要小心。 有機溶劑沉淀法溶劑的選擇原則就是：與水可以混溶，不與蛋白反應，沉淀效應良好，無毒等。一般就是乙醇丙酮。方法就是調(diào)節(jié)適當?shù)膒h，ph調(diào)節(jié)適當會使沉淀效果好很多，等電點附近比較好

3、。加入前將有機溶劑低溫處理，緩慢加入，邊加邊緩慢攪拌（可以冰浴），靜置15min后離心。蛋白溶液濃度不要太低，否則蛋白容易變性，5mg/ml以上吧。一般加丙酮的話，體積百分含量2050%即可。至于加鹽的話，可以在加有機溶劑前加入，濃度不要太大，否則如你所說，沉淀太猛，失去分級的效果。如果加nacl，濃度0.05mol/l左右即可。固相析出分離法 改變?nèi)芤簵l件，使溶質(zhì)以固體形式從溶液中分出的操作技術(shù)稱為固相析出分離法。析出物為晶體時稱為結(jié)晶；析出物為無定形固體稱為沉淀法。固相析出法主要有鹽析法，有機溶劑沉淀法，等電點沉淀法，結(jié)晶法等。鹽析法是利用各種生物分子在濃鹽溶液中溶解度的差異，通過向溶液中

4、引入一定數(shù)量的中性鹽，使目的物或雜蛋白以沉淀析出，達到純化目的的方法。鹽析的機制：高濃度的中性鹽溶液中存在著大量的帶電荷的鹽離子，它們能夠中和生物分子表面的電荷，使之賴以穩(wěn)定的雙電層受損，從而破壞分子外圍的水化層；另外，大量鹽離子自身的水合作用降低了自由水的濃度，從另一方面摧毀了水化層，使生物分子相互聚集而沉淀。有機溶劑沉淀法向水溶液中加入一定量親水性的有機溶劑，降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出的分離純化方法。主要機理：（1)親水性有機溶劑加入溶液后降低了介質(zhì)的介電常數(shù)，使得溶質(zhì)分子之間的靜電引力增加，聚集形成沉淀。(2)水溶性有機溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度，壓縮了親水溶質(zhì)分子表面原有

5、水化層的厚度，降低了它的親水性，導致脫水凝集。等電點沉淀法兩性電解質(zhì)，在溶液ph處于等電點（pi）時分子表面凈電荷為零，導致賴以穩(wěn)定的雙電層及水化膜的削弱或破壞，分子間引力增加，溶解度降低。調(diào)節(jié)溶解的ph值，使兩性溶質(zhì)溶解度下降，析出沉淀的操作。結(jié)晶法改變?nèi)芤旱哪承l件，使其中的溶質(zhì)以結(jié)晶態(tài)析出的過程稱作結(jié)晶。（一）鹽析結(jié)晶法這是生化制藥中應用最多的結(jié)晶方法。其作用是通過向結(jié)晶溶液中引入中性鹽，逐漸降低溶質(zhì)的溶解度使其過飽和，經(jīng)過一定時間后晶體形成并逐漸長大。（二）透析結(jié)晶（三）有機溶劑結(jié)晶（四）等電點結(jié)晶（五）溫度誘導結(jié)晶有機溶劑沉淀法有機溶劑沉淀法 概念 利用與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙

6、醇、丙酮等)能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低而沉淀的方法，稱為有機溶劑沉淀。有機溶劑沉淀法 原因 有機溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的主要原因是加入有機溶劑使水溶液的介電常數(shù)降低，因而增加了兩個相反電荷基團之間的吸引力，促進了蛋白質(zhì)分子的聚集和沉淀。有機溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的另一種解釋認為與鹽析相似，有機溶劑與蛋白質(zhì)爭奪水化水，致使蛋白質(zhì)脫除水化膜，而易于聚集形成沉淀。有機溶劑沉淀法 影響因素 (一)有機溶劑的選擇 在實際生產(chǎn)中，常用的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、氯仿等。丙酮的介電常數(shù)小，沉淀能力強；而乙醇無毒，廣泛應用于藥品生產(chǎn)中。 (二)溫度的控制 有機溶劑沉淀時，溫度是重要的控制指標。根據(jù)沉淀對象不同，采用的溫度不同，為防止生物大分子在較高溫度時發(fā)生變性，一般要求在低溫下進行，同時還要考慮有機溶劑與水混合時的放熱現(xiàn)象。 (三)ph值 等電點時，蛋白質(zhì)的溶解度最低。在有機溶劑沉淀時，應選擇ph值在等電點附近，但是ph值的控制還必須考慮目的藥物的穩(wěn)定性條件，一般生產(chǎn)中常用緩沖液來控制溶液的ph值。 (四)離子強度 在有機溶劑和水的混合液中