western-blot--超詳細(xì)步驟

1、一、蛋白質(zhì)的樣品制備：一、溶液：裂解液及蛋白酶抑制劑（每毫升裂解液加20ulcocktail）二、操作步驟：1、6孔板置于冰上，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次，每孔加入100l裂解液，5min后用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，用槍頭轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管中，編號置于冰上。2、以上所得的樣品用超聲細(xì)胞破碎儀超聲處理，超聲時(shí)間為3S，間歇時(shí)間為10S，重復(fù)三次。3、于4離心機(jī)（預(yù)冷）12000r離心15min，取上清，收集于0.5mlEP管中。二、蛋白濃度的測定（BCA法測定蛋白濃度）1.取標(biāo)準(zhǔn)蛋白（2mg/ml）備用。2.于標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋為2mg/ml 1mg/ml 0.5 mg/ml 0.25 mg/ml 0.

2、125mg/ml 0mg/ml，96孔板中每孔加入10ul，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，待測蛋白稀釋8倍，每孔加入10ul，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔加入BCA工作液（A液：B液=50：1混勻）90ul，37溫浴30min，酶標(biāo)儀測出各吸光度值，EXCEL輸入數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測出待測蛋白濃度。測完蛋白含量后，計(jì)算含30、50l蛋白的溶液體積即為上樣量。按上樣量取出樣品至0.5ml的EP管中，加入5SDS 上樣緩沖液至終濃度為1。后蛋白于95煮5min（干濕溫箱預(yù)熱）。樣品于-80保存。三、電泳1.制膠分離膠:電泳凝膠濃度試劑 10% H2O(ml) 4.0 30%丙烯酰胺 3.31.5mol/lTris.cl(PH

3、8.8) (ml) 2.5 10%SDS(ml) 0.1 10%AP(ml) 0.1 TEMED(l) 5總體積(ml) 10 濃縮膠試劑 濃度(5%)H2O(ml) 230%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 0.510%SDS(l) 4010%AP(l) 30TEMED(l) 4總體積(ml) 3 1、玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。2、 按前面方法配10分離膠，加入TEMED前混勻，加入TEMED后再次搖勻即可灌膠。灌膠時(shí)，可用1ml槍吸取膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時(shí)即可。然后膠上加一

4、層水。3、 當(dāng)水和膠之間有一條折射線時(shí)，說明膠已凝了，時(shí)間約20min左右。用吸水紙將膠上面水吸干。 4.濃縮膠按前面比例加入，加入TEMED前混勻，加入TEMED后再次搖勻，快速灌膠，可用1ml槍吸取膠沿玻璃放出，約5min后濃縮膠凝固，插梳子時(shí)要使梳子保持水平。放入4冰箱備用。2、電泳：1. 配制電泳緩沖液（5）：Tris 15g+甘氨酸72g+SDS 5g+H2O至1L，稀釋為1.2. .取出膠板，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過內(nèi)側(cè)的電泳槽,外側(cè)量可只到2/3。）用槍頭吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將槍頭稍插入孔中緩慢加入

5、樣品。3、加樣完畢，于冰上電泳，蓋好電泳槽的蓋子，（注意電極方向紅對紅，黑對黑），先以80V電壓進(jìn)行電泳15-20min左右，后調(diào)電壓至 100V，電泳直至溴酚染料前沿下至凝膠末端處，即停止電泳，時(shí)間約1h30min左右（注意觀察電泳液是否泄漏）。四、轉(zhuǎn)膜 （1） 配制轉(zhuǎn)膜緩沖液（5）：Tris 15g+甘氨酸72g加水定容到1L，稀釋為1，放入4預(yù)冷。（2） 將PVDF膜在甲醇中活化。在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、濾紙和浸過的膜。 （3） 將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，在墊子上墊一層加厚濾紙，注意不要有氣泡。 （4） 要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)

6、候動作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會兒玻璃板便開始松動，直到撬去玻板。除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去，要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個(gè)膠（膜蓋下后不可再移動）并除氣泡。在膜上蓋1張加厚濾紙并除去氣泡。最后蓋上海綿，合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路。（5） 先開啟4循環(huán)冷凝水預(yù)冷， 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時(shí)會產(chǎn)熱，加冰降溫。以250mA轉(zhuǎn)膜3h。五、麗春紅染色 轉(zhuǎn)完膜后用TBST浸潤一下，將膜用1麗春紅染液染5min（于脫色搖床上搖）。然后用TBST沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。再以TBST徹底洗去麗春紅染液。六、封閉：以5%的脫脂牛奶粉溶于TBS-T中，將膜放入封閉液中封閉1h。七、抗體孵育1、標(biāo)記Marker分子量，選擇目的蛋白所在范圍剪膜，將條帶在一抗（參照說明書比例VP16 1：1000， ICP4 1：500）及內(nèi)參（參照說明書）中孵育，封閉于PE手套中，注意不要有氣泡，加入約2ml封閉液，后搖床上4過夜。2.取出一抗及內(nèi)參中的條帶，用TBST在水平搖床中洗脫4次，每次5min。加TBST 10ml于50ml離心管中，加入相應(yīng)二抗（注意羊抗