感染性疾病血清標(biāo)志物質(zhì)量保證

1、感染性疾病血清學(xué)標(biāo)志物檢驗(yàn)質(zhì)量保證一、定 義 質(zhì)量保證( Quality Assurance,QA):為一產(chǎn)品或服務(wù)滿足特定質(zhì)量要求提供充分可信性所必要的有計(jì)劃的和系統(tǒng)的措施。 室內(nèi)質(zhì)量控制（ Internal Quality Control,IQC):由實(shí)驗(yàn)室工作人員,采取一定的方法和步驟，連續(xù)評價本實(shí)驗(yàn)室工作的可靠性程度，旨在監(jiān)測和控制本實(shí)驗(yàn)室工作的精密度，提高本室常規(guī)工作中批內(nèi)、批間樣本檢驗(yàn)的一致性，以確定測定結(jié)果是否可靠、可否發(fā)出報告的一項(xiàng)工作。 室間質(zhì)量評價（ External Quality Assessment, EQA ):為客觀比較一實(shí)驗(yàn)室的測定結(jié)果與靶值的差異，由外單位機(jī)構(gòu)

2、，采取一定的辦法，連續(xù)、客觀地評價實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)誤差并校正結(jié)果，使各實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果具有可比性。這是對實(shí)驗(yàn)室操作和實(shí)驗(yàn)方法的回顧性評價，而不是用來決定在實(shí)時的測定結(jié)果的可接受性。當(dāng) EQA 用來為執(zhí)業(yè)許可或?qū)嶒?yàn)室認(rèn)證的目的而評價實(shí)驗(yàn)室操作時，常描述為實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證（ Proficiency testing, PT )。在以前的文獻(xiàn)中， EQA 常描述室間質(zhì)量控制。 批( Run)：在相同條件下所獲得的一組測定。 均值（Mean） 標(biāo)準(zhǔn)差（Standard deviation,SD或s) 變異系數(shù)（Coefficient of variation,CV） 正態(tài)分布(Gaussian dist

3、ribution):當(dāng)一質(zhì)控物用同一方法在不同的時間重復(fù)多次測定，當(dāng)測定數(shù)據(jù)足夠多時，如以橫軸表示測定值，縱軸表示在大量測定中相應(yīng)測定值的個數(shù)，則可得到一個兩頭低，中間高，中為所有測定值的均值，左右對稱的“ 鐘形 ”曲線，亦即正態(tài)分布，又稱高斯分布。 正態(tài)分布的基本統(tǒng)計(jì)學(xué)含義可用均數(shù)（）、標(biāo)準(zhǔn)差（s）和概率來說明。 二、臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢驗(yàn)步驟 （一）標(biāo)本收集： 選擇測定項(xiàng)目、標(biāo)本收集和保存。 （二）實(shí)驗(yàn)室測定： 標(biāo)本接收、貼標(biāo)簽、樣本處理、檢測、測定的有效性和臨床診療價值。 （三）報告和解釋： 結(jié)果發(fā)出、結(jié)果解釋和臨床管理。 （四）質(zhì)量保證、室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評之間的關(guān)系 三、臨床免疫檢驗(yàn)方法

4、（一）三大“標(biāo)記”免疫檢驗(yàn)技術(shù):熒光標(biāo)記、放射性核素標(biāo)記和酶標(biāo) （二）其它標(biāo)記免疫測定技術(shù)：發(fā)光物標(biāo)記、金標(biāo)、元素標(biāo)記等 （三）免疫沉淀和免疫凝集試驗(yàn) 四、感染性疾病血清學(xué)標(biāo)志物 肝炎病毒標(biāo)志物： HBsAg 、 抗 HCV 等、抗 HIV、梅毒抗體、其它抗原、抗體。 五、檢驗(yàn)方法 、ELISA 、應(yīng)用酶標(biāo)原理的自動化分析儀 、應(yīng)用其它標(biāo)記物的自動化分析儀 、RIA 六、自動化免疫分析儀的基本原理 、基本上均為固相免疫測定，固相以磁性微粒最為普遍，其次是聚丙烯微孔板條和試管。 、均為標(biāo)記免疫測定，標(biāo)記物最常用的是酶（堿性磷酸酶，辣根過氧化物酶），其次是元素，發(fā)光標(biāo)記物等； 、通常采用發(fā)光或熒光

5、測定方式（常使用的酶發(fā)光或熒光底物如 AMPPD （ Dioxetanes), 魯米諾，4-甲基傘型酮磷酸鹽等； 七、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ ELISA ） （一）影響 ELISA 測定的因素 、試劑盒的因素 （）實(shí)驗(yàn)操作 （）影響 ELISA 試劑盒質(zhì)量的因素 、固相材料:聚苯乙烯塑料 、抗原:純化、合成和基因工程抗原 、抗體：多抗、單抗和基因工程抗體 、酶結(jié)合物：酶免疫測定的核心成份 、色原底物： OPD 和 TMB 、運(yùn)輸貯存 （二）酶免疫測定操作中的注意事項(xiàng) 、標(biāo)本的收集、運(yùn)送和保存 、標(biāo)本類型及采集容器 、最常用的標(biāo)本：血液，包括血清、血漿和全血。唾液或尿液 。 、建議采用真空采血管及蝶

6、形針具，以免直接接觸血液。采集容器最好為一次性無菌密閉容器。 、標(biāo)本采集時間及患者準(zhǔn)備 、激素和治療藥物：可的松峰值在早晨46點(diǎn)之間；生長激素、促黃體激素（ LH ） 和促卵泡激素（ FSH ） 均以陣發(fā)性方式釋放，須在密切相連的時間間隔內(nèi)采取數(shù)份血樣本，以其中間值為測定值。又如當(dāng)從臥位變?yōu)檎玖⑽粫r，血清中腎素活性將出現(xiàn)明顯增高。再如治療藥物的檢測，應(yīng)根據(jù)藥代動力學(xué)選擇服藥后的最適時間抽血檢測。 、感染性病原體抗原、抗體 、腫瘤標(biāo)志物 、特定蛋白 、可能影響測定結(jié)果的標(biāo)本因素 、內(nèi)源性干擾因素：類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、異嗜性抗體、治療性抗體、自身抗體、溶菌酶、磷脂、藥物小分子、總蛋白濃度等 、外源性

7、干擾因素：溶血、細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存時間過長、凝固不全、反復(fù)凍融 、標(biāo)本的保存 用于抗體檢測的血清或血漿樣品應(yīng)存放于 -20 以下， 短期（1周）內(nèi)進(jìn)行檢測的樣品可存放于2 -8 。 、試劑準(zhǔn)備 （）從冰箱中取出的試劑，待溫度與室溫平衡后使用； （）所用蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。 、加樣 （）加樣不可太快，避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。 （）從滴瓶中滴加試劑，除了要注意滴加角度外，滴加速度也很重要，滴加太快，很容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)象，這樣就會在孔內(nèi)的非包被區(qū)出現(xiàn)非特異吸附，從而引起非特異顯色。 （）全自動加樣系統(tǒng)的標(biāo)本“交叉污染”問題 加樣器 加樣器的類型 （）單道連續(xù)可

8、調(diào)式移液器 （）多通道連續(xù)可調(diào)式移液器 （）單道連續(xù)移液器 （）單道移液管配合使用的移液器 P 型移液器的型號和取液范圍 （）型號 所用量程范圍（ L ） （）GILSON eppendorf （）P2 0.1 ? 2 （）P10 0.5 ? 10 0.5 ? 10 （）P20 2 ? 20 2 ? 20 （）P100 20 ? 100 10 ? 100 （）P200 30 ? 200 20 ? 200 （）P1000 200 ? 1000 100 ? 1000 加樣器的使用 吸液的位置 （）把按鈕壓至第一停點(diǎn)垂直握持移液器，使吸嘴浸入液樣中，浸入液體深度視型號而定： （）P2 和 P10 1

9、mm （）P20 和 P100 2 -3mm （）P200 和 P1000 2 -4mm （）P5000 3 -6mm （）P10ML 5 -7mm P 型移液器的應(yīng)用范圍 （）P2 ， P10 : 超微量計(jì)量及移液，應(yīng)用于 DNA 定序及酶分析等。 （）P20 ， P100 ， P200 和 P1000 應(yīng)用于一般水溶液、酸、堿的計(jì)量和移液。 （）P5000 和 P10ML 大體積移液和計(jì)量。 P 型移液器技術(shù)指標(biāo) 加樣器的校準(zhǔn) 、溫育 （）常采用的溫育溫度有 43 、 37 、室溫和 4 等。 （）溫育所需時間與溫度成反比，即溫育溫度高，則所需時間相對較短。 （）溫育時，微孔板應(yīng)置于水?。?/p>

10、浮于水面）或濕盒中，以使反應(yīng)溶液的溫度迅速與室溫平衡。 （）“邊緣效應(yīng)”的排除: 使用水浴或在將反應(yīng)溶液加入至板孔中時，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如 37 ），就可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)”，并且可提高測定的重復(fù)性。 、洗板 （）每次溫育后洗板是否徹底，與非特異背景顯色有很大關(guān)系。 （）洗板液一般為含0.05% Tween20 的中性 PBS 。 （）Tween20 為一種非離子去垢劑，既含親水基團(tuán)，也含疏水基團(tuán)。 （）洗滌作用機(jī)理，借助其疏水基團(tuán)與固相上蛋白的疏水基團(tuán)形成疏水鍵，從而削弱蛋白與固相的吸附，同時在其親水基團(tuán)與液相中水分子的結(jié)合作用下，促使蛋白質(zhì)脫離固相而進(jìn)入液相 （）洗板液中

11、 Tween20 濃度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗體解吸附而影響試驗(yàn)測定下限。 、顯色 （） 加入底物 A 和 B 后，應(yīng)振蕩混勻 （）當(dāng)?shù)孜餅?OPD 時，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進(jìn) （） 一般商品試劑盒顯色反應(yīng)條件為 37 或室溫反應(yīng)1530 min 。 從理論上說， 37 30分鐘才可以使 HRP 的底物催化反應(yīng)完全，盡管在最初的10分鐘內(nèi)，絕大部份催化反應(yīng)即可完成。因此，為使弱陽性樣本孔能有充分的顯色，建議在 37 下反應(yīng)2530分鐘后，終止反應(yīng)比色測定。 、比色 （） 加酸終止顯色反應(yīng)后，比色測定前應(yīng)振蕩混勻 （） 測定時，要注意酶標(biāo)儀的波長是否已調(diào)至合適 （） 比較好的酶標(biāo)儀可選

12、擇單波長或雙波長比色測定，所謂雙波長比色，即在敏感波長（此時對所顯色具最大光吸收）如450 nm 和非敏感波長（所測得的光吸收為微孔板上的劃痕、污跡以及指紋等所致），最后從儀器得到的讀數(shù)為在敏感波長測得的吸光度與非敏感波長測得的吸光度之差。 、結(jié)果判斷 （） 按照試劑盒確定的 Cut-off 值判斷結(jié)果 （）ELISA 測定的“灰區(qū)”（可疑結(jié)果的含義） 、結(jié)果報告及解釋 （三）ELISA 測定的主要問題 、酶免一步法的“ HOOK EFFECT” 問題 （）一步法的“ HOOK EFFECT” 產(chǎn)生的原因： 定性酶免疫測定的 CUT-OFF 值 （）酶免疫測定出現(xiàn)假陽性的原因 、操作及儀器因素

13、：加樣、洗板、自動化加樣系統(tǒng)的標(biāo)本間“交叉污染” 、標(biāo)本因素： RF 、 補(bǔ)體、異嗜性抗體、動物抗體、動物抗體、高濃度 Ig 、 溶血、細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存時間過長、標(biāo)本凝固不全 （）酶免疫測定出現(xiàn)假陰性的原因 、操作、試劑及儀器因素：標(biāo)本未加、試劑過期或變質(zhì)、儀器針孔堵塞、標(biāo)本“交叉污染” 、標(biāo)本因素：補(bǔ)體、自身抗體、反復(fù)凍融 、結(jié)果的判斷 八、臨床免疫檢驗(yàn)的室內(nèi)質(zhì)控問題 、臨床免疫檢驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控不太受重視的原因有三: 一方面可能是質(zhì)控品來源有限或價格因素；其次是尚沒有意識到；再有就是不知從何做起。 、使用統(tǒng)一合格的校準(zhǔn)品開展室內(nèi)質(zhì)控才是解決各實(shí)驗(yàn)室結(jié)果可比性差同時也是保證檢驗(yàn)質(zhì)量的唯一有效的途

14、徑 。 、室內(nèi)質(zhì)控的內(nèi)涵并不僅僅是使用質(zhì)控物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)控，它包括分析前、分析中和分析后的質(zhì)量控制三個方面。 、免疫檢驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控既有與臨床生化室內(nèi)質(zhì)控共性的一面，也有其特性的地方 九、室內(nèi)質(zhì)量控制（ IQC ） IQC 主要包括三個方面： （1）測定前的質(zhì)量控制； （2）統(tǒng)計(jì)學(xué)質(zhì)量控制； （3）質(zhì)量控制的評價 。 十、統(tǒng)計(jì)質(zhì)控方法 （一）基線測定 （二）質(zhì)控規(guī)則的表達(dá)方式及定義 、 Levey-Jennings 質(zhì)控圖方法 基本的統(tǒng)計(jì)學(xué)含義：穩(wěn)定條件下，在20個 IQC 結(jié)果中不應(yīng)有多于1個結(jié)果超過2 SD （ 95.5% 可信限）限度；在1000個測定結(jié)果中超過3 SD （ 99.7% 可信

15、限）的結(jié)果不多于3個。 如以3 s 為失控限，假失控的概率為0.3%。 、Levey-Jennings 質(zhì)控圖結(jié)合 Westgard 多規(guī)則質(zhì)控方法 、累積和 ( CUSUM) 質(zhì)控方法 、“即刻法”質(zhì)控方法 “即刻法”質(zhì)控方法的實(shí)質(zhì)是一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,即 Grubs 異常值取舍法；只要有3個以上的數(shù)據(jù)即可決定是否有異常值的存在。 十一、IQC 的局限性 、在免疫測定中 IQC 可能測不出的誤差 、測定前 測定中 測定后 樣本鑒定不對 樣本吸取不對 結(jié)果記錄錯誤 樣本貯存中變質(zhì) 試劑加入不對 、此類誤差的發(fā)生率在不同的實(shí)驗(yàn)室有所不同，一般要求小于 0.1%，且應(yīng)均衡地分布于測定前、測定中和測定后

16、的不同階段。 十二、室間質(zhì)量評價（ EQA ） 、EQA 、Proficiency testing (PT) 十三、乙肝標(biāo)志物檢測的問題 乙肝“兩對半”、抗 HBc IgM、HBV DNA 乙型肝炎病毒 ( Hepatitis B Virus ) 乙肝“兩對半”：乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝表面抗體（抗 HBs）、乙肝e抗原（HBeAg）、乙肝e抗體（抗 HBe）、乙肝核心抗體（抗 HBc） （一）HBsAg 測定中可能存在的問題 、在 HBsAg 的測定中，最大的問題是假陰性問題: （）HBsAg 含量低于所用方法的測定下限之下。如感染的“窗口期”、急性期后或恢復(fù)期、自限性感染末期的攜帶

17、者等。 （）編碼 HBsAg 的 HBV S 基因的突變 （）HCV/HDV 重疊感染對 HBV 復(fù)制和/或 HBsAg 的表達(dá)的抑制作用。 （）測定方法所用抗體對 HBV 不同基因型檢測敏感性的不同。 （）HOOK EFFECT 、編碼 HBsAg 的 HBV S 基因的突變對檢測的影響 （）HBV 容易發(fā)生突變，較其他 DNA 病毒的突變率要高10倍 （）突變主要集中在核心啟動子、前核心區(qū)和編碼病毒包膜蛋白的 a 決定簇的基因區(qū)域。 （二）目前的商品試劑盒對 HBsAg 突變株的測定能力 可歸為三類： 、突變 HBsAg 和野生型均可檢出。 、不能檢出突變 HBsAg 。 、與野生型抗原相

18、比，突變 HBsAg 的檢出能力明顯降低。 使用酶標(biāo)多克隆抗體的商品試劑，大多數(shù)可歸為第一和第三類。 （三）HBV S 基因變異所致 HBsAg 假陰性的最大的問題 、輸血安全性。 尤其是逃逸突變株流行較廣的地區(qū)，在 HBV 高流行區(qū)域，突變株的流行率也高 、導(dǎo)致疫苗免疫的失敗 。 要在進(jìn)行人群 HBV 分子流行病學(xué)的基礎(chǔ)上，考慮研制針對主要流行 HBsAg 變異株的乙肝疫苗，保證免疫的有效性。 （四）HBsAg 的變異所致的不常見的 HBV 標(biāo)志物模式或不一致的結(jié)果。 、單獨(dú)抗 HBc 陽性。 、HBsAg 陰性但 HBeAg 陽性。 、血清 HBsAg 陰性但抗 HBc 和抗 HBs 陽性。 、HBsAg （ HBeAg ） 和抗 HBs （ 大多為40%），在妊娠婦女中單獨(dú)抗 HBc 反應(yīng)性的檢出率為1.2% （十一） 單項(xiàng)抗 HBc 陽性反應(yīng)性的確認(rèn)步驟 、首先要確認(rèn)測定結(jié)果的特異性，排除假陽性，可按下圖中的步驟進(jìn)行。 、第二步是，如果單項(xiàng)抗 HBc 反應(yīng)為真陽性，則應(yīng)確定 HBV 感染階段。單項(xiàng)抗 HBc 陽性一般見于 HBV 感染恢復(fù)期后（抗 HBs 消失或抗 HBs 濃度低