ctDNA檢測技術(shù).doc

1、ctDNA檢測技術(shù)循環(huán)腫瘤 DNA(circulatingtumorDNA,ctDNA)來源于腫瘤細(xì)胞的凋亡、壞死或分泌產(chǎn)生的 DNA片段，是循環(huán)游離DNA(circulatingcell-freeDNA,cfDNA)的一部分 1 。ctDNA含有與其來源腫瘤DNA同樣的基因缺陷，如點突變，重排，擴(kuò)增等2 ；其在血液中的半衰期短，可實時反映腫瘤的動態(tài)變化3 ; 作為液體活檢的一種，可克服組織活檢中由于腫瘤異質(zhì)性帶來的缺陷，檢測更全面 4 , 因此 ctDNA的檢測可用于癌癥早期診斷與癌癥分期、腫瘤的療效評估、復(fù)發(fā)監(jiān)測和預(yù)后判斷等5 。由 ctDNA的質(zhì)量和數(shù)量變化大 , 因此需要高特異性和高靈

2、敏度的檢測方法。目前常用的方法有數(shù)字PCR(digitalPCR,dPCR) 、BEAMing(bead,emulsion,amplificationandmagnetic)、高通量測序61. 數(shù)字 PCR1999 年 Vogelstein等提出了數(shù)字PCR(digtalPCR,dPCR)的概念 7 。數(shù)字 PCR包括兩部分，即 PCR擴(kuò)增和熒光信號分析。 先將是樣品稀釋后分配到大量微小的反應(yīng)單元中， 每個單元包含或不包含一個或多個拷貝的目標(biāo)分子 , 然后分別對目標(biāo)分子進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對每個反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行采集。數(shù)字 PCR采用直接計數(shù)的方法進(jìn)行定量分析 , 有熒光信號的反應(yīng)單元中至

3、少包含一個拷貝的目標(biāo)分子，記為 1，無熒光信號的則即為 0，理論上，在樣品中極限稀釋的情況下， 有熒光信號的反應(yīng)單元數(shù)目等于目標(biāo)DNA分子的拷貝數(shù)。 但是有的反應(yīng)單元中可能包含兩個或兩個以上的目標(biāo)分子，這時需要用泊松概率分布公式進(jìn)行計算8 。不同于傳統(tǒng)的 qPCR技術(shù) , 數(shù)字 PCR不受擴(kuò)增曲線的循環(huán)閾值 (CT) 和擴(kuò)增效率的影響，無需參照，準(zhǔn)確性和重復(fù)性好，可實現(xiàn)絕對定量分析 9 。根據(jù)反應(yīng)單元類型不同，數(shù)字 PCR分為三類 : 微反應(yīng)室 / 孔板數(shù)字 PCR、微流控芯片和微滴數(shù)字 PCR系統(tǒng)。微反應(yīng)室 / 孔板數(shù)字 PCR借助高通量自動上樣設(shè)備和增加的反應(yīng)單元數(shù) , 實現(xiàn)快速精確取樣，

4、 提高檢測靈敏度。 微流控芯片技術(shù)是一種基于含有數(shù)千個超高密度親疏水微孔芯片的 dPCR平臺，可實現(xiàn)高通量、低成本分析。微滴數(shù)字 PC(dropletdigitalPC ,ddPCR) 是將含有目標(biāo)分子的樣品分成成千上萬個納升級的油包水微滴， 再對每個微滴進(jìn)行擴(kuò)增， 和熒光信號的采集，更容易實現(xiàn)小體積和高通量10 。數(shù)字 PCR可絕對定量，是目前靈敏度最高的檢測技術(shù)，但其也存在一定缺點，如生成的微滴必須服從泊松分布，所以不適合高濃度 DNA樣本檢測，；只能檢測已知的突變且一次只能檢測一種突變 11,12 。14 。并且， BEAMing技術(shù)是技術(shù)BEAMing技術(shù)在檢測 ctDNA內(nèi)體腫瘤突變

5、具有非常高的靈敏度，它是結(jié)合了數(shù)字 PCR以及流式技術(shù)的一種檢測方法，最早是由 BertVogelstein 提出。其方法是每一類 DNA分子都會專一的與磁性珠相連接， 然后 DNA分子之間的差異可以通過流式細(xì)胞儀檢測熒光標(biāo)記來做出評估。這種方法是基于小珠 (Bead) 、乳濁液 (Emulsion) 、擴(kuò)增 (Amplification)、磁性(Magnetic) ，這四個主要組分來構(gòu)建的，所以被稱作為13。BEAMingBEAMing技術(shù)的過程包括：首先是分離和純化血漿中的DNA；接著是預(yù)擴(kuò)增步驟，通過使用常規(guī) PCR擴(kuò)增目的基因片段，使用引物與已知的標(biāo)記序列混合；然后，這些DNA模板再通

6、過乳液 PCR擴(kuò)增，應(yīng)用引物探測這些序列， 通過鏈酶親和素磁珠相互作用與有磁性的微膠珠結(jié)合。通過這種方式設(shè)計的系統(tǒng)，在反應(yīng)結(jié)束之前，每個乳液液滴中生成的PCR產(chǎn)物將保持對微膠珠的附著性，使其可以很容易地通過磁性進(jìn)行分離和純化利用磁珠來吸附游離 DNA，它可以從 1 萬個健康細(xì)胞 DNA中檢測出那一個 ctDNA分子，具有較高的敏感性，同時在很多研究中其在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)的突變都和 ctDNA部分突變是一致的15,16 。BEAMing技術(shù)相比其他檢測技術(shù)具有很多優(yōu)勢： （一）在常規(guī)實驗室條件下，數(shù)以萬計的DNA分子可以通過該種方法來進(jìn)行評估。 （二）特異的突變可以通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分離篩選以備進(jìn)

7、一步分析和研究。（三）BEAMing技術(shù)可以用來對特定組織或者人群中罕見的突變，以及研究一般基因序列或轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物的變異都可以提供相應(yīng)的鑒別和定量分析。 由于外周血流中 ctDNA拷貝的數(shù)量是很低的，特別是相較于野生型 DNA來說。出于這個原因，使用 PCR進(jìn)行 DNA擴(kuò)增是 BEAMing過程中的一個重要部分，是確?？煽繖z測的保證5 。然而，BEAMing這項檢測技術(shù)只能檢測已知突變， 且成本較高 17 同時，它的操作也較復(fù)雜，通量低，且單分子擴(kuò)增在非均一的微滴中實現(xiàn)，需要 RCR預(yù)擴(kuò)增，會增加試驗誤差 12 。3. 基于 NGS技術(shù)的檢測方法ctDNA 檢測技術(shù)，除了基于PCR檢測方法之外，

8、還有一種以高通量測序技術(shù)，又稱“下一代”測序技術(shù)（ NGS）為基礎(chǔ)的檢測方法。這種方法主要是選定十幾到幾十個腫瘤相關(guān)基因進(jìn)行測序，測序通量和效率高。根據(jù)富集策略的不同，基于NGS的技術(shù)目前又可分為靶向擴(kuò)增子測序(TAS) 及目標(biāo)序列捕獲測序 (TCS)。靶向擴(kuò)增子測序 (TAS)技術(shù)是針對目的基因設(shè)計幾十對甚至上百對 PCR引物，利用多重 PCR 擴(kuò)增富集。代表性方法有標(biāo)記擴(kuò)增深度測序 (TAM-Seq)。 Forshew 等18 通過 TAM-Seq測序技術(shù)，檢測患者癌細(xì)胞中ctDNA 片段，從而找到腫瘤樣品中的遺傳突變。這種方法無需外科手術(shù)或者活檢，就可以找到癌癥突變。目標(biāo)序列捕獲測序 (

9、TCS) 技術(shù)是針對目的基因設(shè)計探針，通過捕獲雜交的方法富集，代表性方法有深度測序腫瘤個體化建檔法（CAPP-Seq）。Newman等 19 從腫瘤基因突變數(shù)據(jù)庫找復(fù)發(fā)突變相關(guān)的外顯子， 再從腫瘤基因圖譜庫的407 位非小細(xì)胞肺癌患者全基因組測序結(jié)果篩選。然后應(yīng)用迭代算法使每個非小細(xì)胞肺癌患者樣本的錯義突變最大化來簡化篩選器(selector) 的大小，最后的 selector 能識別 139 個復(fù)發(fā)突變基因中的 521 個外顯子和 12 個內(nèi)含子，長度約為 125kb，平均能夠識別 4 個單核苷酸突變（ SNV），在 96%的肺腺癌或鱗癌患者身上有效?；?NGS技術(shù)的檢測方法靈敏度高，能同

10、時檢測多個基因的多種變異。但是其技術(shù)復(fù)雜，數(shù)據(jù)處理困難，實驗室水平差異較大，儀器與試劑的成本相對較高。想要臨床應(yīng)用，首先要將其標(biāo)準(zhǔn)化12 。技術(shù)ARMS，全稱為突變擴(kuò)增系統(tǒng)（Amplificationrefractorymutationsystem），是由Newton等人首先建立并用于檢測基因已知突變的方法。利用PCR引物3端堿基必須與其模板DNA互補(bǔ)才能進(jìn)行有效擴(kuò)增的基本原理，根據(jù)已知突變位點設(shè)計引物，使3末端堿基分別與突變和野生型模板堿基進(jìn)行互補(bǔ)， 實現(xiàn)擴(kuò)增，達(dá)到將“突變”模板與“野生”模板區(qū)分的目的。ARMS法的主要特點有高特異性，高靈敏度以及耗時短，成本低，操作簡單等特點。其檢測結(jié)果的

11、高特異性關(guān)鍵在于引物設(shè)計。ARMS法所用的引物是通過篩選能夠識別單個位點等位基因的引物，進(jìn)而保證了結(jié)果的高特異性。而ARMS法檢測點突變的檢出率還取決于PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化和防止引物與靶DNA錯配可能發(fā)生的錯配延伸。 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化可以通過改變引物濃度、靶DNA濃度、 Taq 酶濃度以及反應(yīng)體系溫度進(jìn)行調(diào)整。此外，在反應(yīng)體系中加入甲酰胺可以減少非特異性擴(kuò)增，在引物3末端引入第二個錯配堿基也可以提高引物的特異性。通過在體系中加入多對引物可以實現(xiàn)多重擴(kuò)增，實現(xiàn)基因的多位點突變檢測。ARMS法檢測靈敏度明顯高于直接測序法等其他方法，可檢測出樣品中含量低至% %的突變基因；且該方法結(jié)合PCR技術(shù)

12、，操作簡單，耗時短，成本低，結(jié)果直觀。目前，ARMS法已成為國際上腫瘤個體化分子檢測最重要、最先進(jìn)的技術(shù)之一， 其在臨床應(yīng)用中的優(yōu)勢已被業(yè)內(nèi)專家廣泛認(rèn)可。但該方法只能用于檢測已知突變，在一定程度上限制其應(yīng)用。ARMS法檢測可以分為實時熒光定量PCR和巢式 ARMS法電泳檢測。實時熒光定量PCR是指ARMS技術(shù)結(jié)合探針對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，在實時定量PCR平臺上實現(xiàn)對樣品DNA中稀有突變的檢測。而巢式ARMS法電泳檢測是利用凝膠電泳技術(shù)檢測擴(kuò)增帶，從而實現(xiàn)結(jié)果分析。隨著 ARMS技術(shù)的發(fā)展，商品化的 ARMS試劑盒相繼問世，包括人表皮生長因子受體（ EGFR）基因突變檢測試劑盒，人 KARS基因突

13、變檢測試劑盒，四項耳聾基因檢測試劑盒等。總結(jié)作為重要的腫瘤分子標(biāo)志物， ctDNA在腫瘤的診斷、治療監(jiān)測、預(yù)后等方面發(fā)揮著重要的作用，而 DNA測序技術(shù)的發(fā)展使得通過檢測 ctDNA來指導(dǎo)腫瘤的臨床進(jìn)展變得更加切實可行。數(shù)字 PCR技術(shù)、 BEAMing技術(shù)、 NGS技術(shù)、 ARMS技術(shù)在 ctDNA 的檢測中各具其獨(dú)特的優(yōu)勢和不足之處，實際應(yīng)用時應(yīng)結(jié)合具體條件決定采用何種檢測方法。 相信隨著技術(shù)的進(jìn)步， ctDNA 將會逐漸從科研領(lǐng)域向臨床轉(zhuǎn)化發(fā)展。參考文獻(xiàn)1:,2014,511(7511):524.2CrowleyE,NicolantonioFD,LoupakisF,:,2013,10(8

14、):472.3DiehlF，SchmidtK，ChotiMA，etal CirculatingmutantDNAto，2008，14(9):985-990 4GerlingerM,RowanAJ,HorswellS, 吳龍 , 王穗海 , 梁志坤 . 人類癌癥特異敏感標(biāo)志物 : 循環(huán)腫瘤 DNA.分子診斷與治療雜志 ,2016,8(6):413-417.6DiazLA,:,2014,32(6):579.7VogelsteinB,李春勇 . 數(shù)字 PCR技術(shù)原理及應(yīng)用 . 生物技術(shù)世界 ,2014(11):10-13.10 林彩琴 , 姚波 . 數(shù)字 PCR技術(shù)進(jìn)展 . 化學(xué)進(jìn)展 ,2012,2

15、4(12):2415-2423 11TakegawaN,YonesakaK,SakaiK, 郭巧梅 , 婁加陶 . 循環(huán)腫瘤 DNA的研究進(jìn)展 . 中國腫瘤生物治療雜志 ,2016,23(5):601-608.13 徐婷 , 徐國賓 , 賈淑芹 , 等. 循環(huán)腫瘤 DNA檢測在惡性腫瘤診治中的應(yīng)用進(jìn)展與問題思考 .臨床檢驗雜志 ,2017,35(2):81-88.14 管峰 , 艾君濤 , 楊利國 . 一種 SNP檢測新方法 : 四引物擴(kuò)增受阻突變體系 PCR技術(shù) . 生命的化學(xué) ,2004(06):514.22ChanderV,ChakravartiS,GuptaV,(ARMS-PCR)&Evolutio