堿性磷酸酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達(dá)本科基因工程實(shí)驗(yàn)論文

1、編號(hào) 內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物系基因工程實(shí)驗(yàn)室本科基因工程實(shí)驗(yàn)論文開(kāi)題報(bào)告論文題目：堿性磷酸酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達(dá)學(xué)生姓名： 年 級(jí)： 專 業(yè)： 指導(dǎo)教師： 年月日學(xué)生姓名民族族性別出生年月論文題目堿性磷酸酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達(dá)開(kāi)題時(shí)間年 月 日結(jié)題時(shí)間年 月 日項(xiàng)目來(lái)源本科生基因工程大實(shí)驗(yàn)課一、立論依據(jù)項(xiàng)目的研究意義，國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)分析，主要參考文獻(xiàn)及出處：堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)是一種非特異性磷酸單酯酶，能催化磷酸單酯的水解反應(yīng)，產(chǎn)生無(wú)機(jī)磷酸和相應(yīng)的醇、酚或糖，也能催化磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)。AP廣泛存在于微生

2、物和動(dòng)物體內(nèi)，在磷生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程中有重要作用，并廣泛應(yīng)用于診斷學(xué)、生物化學(xué)及分子生物學(xué)等領(lǐng)域。 1 大腸桿菌堿性磷酸酶 20世紀(jì)80年代相繼完成了大腸桿菌AP、人胎盤型AP、人肝/骨/腎型AP、人小腸型AP和釀酒酵母AP氨基酸序列的測(cè)定，通過(guò)序列比較發(fā)現(xiàn)相似性為25%30%，活性部位高度保守，都保留了Ser102殘基、Arg166及金屬離子配體，這些保守的與催化活性相關(guān)的基團(tuán)暗示了不同來(lái)源的AP具有相似的作用機(jī)制。另外，功能相似的磷酸二酯酶，如蠟狀芽孢桿菌中的磷脂酶C、桔青霉中核酸酶P1，它們的活性部位和金屬離子結(jié)合位點(diǎn)與大腸桿菌AP相似。所以，大腸桿菌AP還可作為其它磷酸酯酶和以金屬離

3、子作輔助因子的磷酸酯酶的研究模型。 AP確切的生理功能還不十分清楚，但認(rèn)為它對(duì)有機(jī)體內(nèi)磷代謝的調(diào)節(jié)有重要作用。大腸桿菌AP的結(jié)構(gòu)基因是phoA，它是pho調(diào)節(jié)子的一部分，pho調(diào)節(jié)子主要調(diào)節(jié)磷的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝。Phobox是pho調(diào)節(jié)子所有基因啟動(dòng)子區(qū)域的共有序列，受PhoB蛋白的調(diào)控。phoB基因產(chǎn)物直接激活pho調(diào)節(jié)子的轉(zhuǎn)錄，而PhoB蛋白又被PhoR蛋白磷酸化激活。細(xì)胞外磷的水平是調(diào)控PhoR的信號(hào)，信號(hào)傳遞通過(guò)大腸桿菌Pst系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。當(dāng)接收到環(huán)境信號(hào)后，PhoR再去調(diào)節(jié)PhoB，而PhoB就是大腸桿菌AP結(jié)構(gòu)基因phoA的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)者。當(dāng)處于低磷狀態(tài)時(shí)，PhoR使PhoB磷酸化，激活大腸

4、桿菌AP結(jié)構(gòu)基因phoA的轉(zhuǎn)錄；當(dāng)處于高磷狀態(tài)時(shí)，PhoR會(huì)使PhoB去磷酸化以阻止phoA大腸桿菌AP結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。 2 哺乳動(dòng)物堿性磷酸酶 此外，哺乳動(dòng)物堿性磷酸酶哺乳類AP和大腸桿菌AP基本三維結(jié)構(gòu)框架非常相似，與催化活性相關(guān)的部位高度保守，2001年獲得PLAP的X-射線晶體結(jié)構(gòu)也證實(shí)了這一點(diǎn)，所以哺乳類AP與大腸桿菌AP應(yīng)具有相似的催化機(jī)制。但哺乳類AP也有其特點(diǎn)，如哺乳類AP主要為膜結(jié)合蛋白，它們通過(guò)磷脂酰肌醇葡聚糖錨定在細(xì)胞膜外側(cè)；另外，細(xì)菌AP是由單基因編碼，而哺乳類AP則是多基因編碼的，細(xì)菌的AP分子兩個(gè)亞基完全相同，而哺乳類AP分子兩個(gè)亞基可能不同。哺乳類AP確切的生物學(xué)

5、功能和作用機(jī)制還不十分清楚。目前認(rèn)為骨骼的礦化依賴于正常的AP的活動(dòng)，對(duì)此觀點(diǎn)最直接的證據(jù)可能是低磷酸酯酶癥。低磷酸酯酶癥是一種先天性代謝紊亂的骨疾病，為TNAP編碼的結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變，使血液中AP活力低于正常水平，表現(xiàn)為骨化及骨發(fā)育不全，至今已有200多種TNAP突變基因型被報(bào)道，雖然還無(wú)法治愈，但最近間葉干細(xì)胞移植的成功為該病的治療提供了新的途徑。另外，在運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的組織中如小腸上皮刷狀緣表面、胎盤合胞體滋養(yǎng)層表面、膽小管表面細(xì)胞膜上AP的含量很高，提示AP與磷酸的轉(zhuǎn)移和代謝有關(guān)。總之，不同組織和器官的AP有不同的生理功能，但有一些仍然是未知的。 3 堿性磷酸酶的應(yīng)用 AP在醫(yī)學(xué)和分子生

6、物學(xué)等領(lǐng)域有廣泛的用途。在臨床醫(yī)學(xué)上，測(cè)定血清中AP的活力已成為診斷和監(jiān)測(cè)多種疾病重要手段。AP主要用于阻塞性黃疸、原發(fā)性肝癌、繼發(fā)性肝癌、膽汁淤積性肝炎等的檢查，患這些疾病時(shí)，肝細(xì)胞過(guò)度制造AP，經(jīng)淋巴道和肝竇進(jìn)入血液，同時(shí)由于肝內(nèi)膽道膽汁排泄障礙，反流入血而引起血清AP明顯升高。而血中腸型AP明顯升高可見(jiàn)于各種腸道疾病，也有文獻(xiàn)報(bào)道某些消化系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病及惡性腫瘤患者血中還可以出現(xiàn)免疫球蛋白復(fù)合物型AP，此種AP同工酶出現(xiàn)的機(jī)理尚未清楚。AP同工酶作為腫瘤組織的一個(gè)標(biāo)志也逐漸為人們所認(rèn)識(shí)，如肺臟、睪丸、卵巢、胰腺、結(jié)腸和淋巴組織等惡性腫瘤病人血清中含有PLAP。骨型AP作為骨代謝

7、異常的標(biāo)志物越來(lái)越受到臨床重視；血清骨型AP活力的定量測(cè)定可作為監(jiān)測(cè)骨形成變化的有效參數(shù)，在其他的骨代謝異常疾病(如骨軟化癥、佝僂病等)及早期甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)的病人、慢性腎衰病人、接受腎臟移植的病人血清中的骨型AP活性均有不同程度的改變，對(duì)骨型AP活性的檢測(cè)及動(dòng)態(tài)觀察將為疾病的早期診斷、治療效果的監(jiān)測(cè)、病情預(yù)后等提供有效的依據(jù)。 在動(dòng)物飼養(yǎng)和疾病診斷方面，AP是反映成骨細(xì)胞活性、骨生成狀況和鈣、磷代謝的重要生化指標(biāo)。鈣、磷供應(yīng)不足對(duì)動(dòng)物的影響主要表現(xiàn)為骨結(jié)構(gòu)異常、軟骨病、食欲降低、生長(zhǎng)遲緩、生產(chǎn)性能下降等。年幼動(dòng)物血液AP主要來(lái)自骨骼，隨著動(dòng)物長(zhǎng)大成熟和骨骼成年化，來(lái)自骨骼的AP逐漸減少。在動(dòng)物

8、營(yíng)養(yǎng)研究中，血清AP活性常作為重要的生化檢測(cè)指標(biāo)協(xié)助評(píng)定日糧鈣、磷水平的適宜程度。在動(dòng)物疾病診斷上，依據(jù)骨質(zhì)疏松等骨骼疾病發(fā)生時(shí)AP活性的變化規(guī)律，可應(yīng)用血清AP活性來(lái)診斷因鈣、磷及VD失調(diào)所引起的骨質(zhì)疾病。臨床骨型AP的檢測(cè)比血鈣測(cè)定體內(nèi)鈣營(yíng)養(yǎng)水平更具敏感性，因此，國(guó)內(nèi)外研究一致認(rèn)為骨型AP是反映骨改變?nèi)^(guò)程最正確的指標(biāo)，其特異性、靈敏度及準(zhǔn)確性優(yōu)于其它物質(zhì)的檢測(cè)。另外，在動(dòng)物患肝疾患、胃腸疾患、腎臟疾病和缺鋅時(shí)，血清AP均會(huì)有改變，如果繼續(xù)對(duì)臟器特異性、AP變化機(jī)制、AP在不同動(dòng)物體內(nèi)生理功能深入研究，會(huì)使AP在獸醫(yī)臨床上意義更大。 在免疫學(xué)研究方面，已廣泛應(yīng)用AP標(biāo)記抗體進(jìn)行酶聯(lián)免疫熒光

9、反應(yīng)(ELISA)和Western印跡分析，即將AP與顯色劑或去磷酸化后能發(fā)光的底物相互作用來(lái)揭示靶與檢測(cè)酶復(fù)合物的存在，與辣根過(guò)氧化物酶相比，AP用作標(biāo)記酶的優(yōu)點(diǎn)是穩(wěn)定性高、靈敏度高,缺點(diǎn)是成本高、標(biāo)記困難。在生物化學(xué)和分子生物學(xué)方面，用AP催化除去DNA分子的5c末端磷酸基團(tuán)以防止載體自連是基因克隆中的常規(guī)手段之一。用AP脫去5c末端磷酸基團(tuán)，再用(C-32P)ATP標(biāo)記5c末端，可用于化學(xué)測(cè)序，RNA測(cè)序和特異性DNA或RNA片段的圖譜構(gòu)建。應(yīng)用AP代替同位素標(biāo)記核苷酸探針用于分子雜交。研究中最常用的AP有：（1）細(xì)菌堿性磷酸酶(BAP)；（2）SAP(來(lái)源于一種北極蝦)；（3）小牛腸堿

10、性磷酸酶(CIAP)；（4）胎盤堿性磷酸酶(PLAP)和分泌性堿性磷酸酶(SEAP)，后者是前者的C末端短缺版，與PLAP相比，SEAP沒(méi)有PLAP的C末端最后24個(gè)氨基酸(這24個(gè)氨基酸構(gòu)成了與糖基化磷脂酰肌醇靶向錨定的區(qū)域)。另外，將phoA基因與其它基因融合表達(dá)雜合蛋白可用于基因表達(dá)的研究。目前工業(yè)上一個(gè)普遍的應(yīng)用是基于巴氏殺菌可破壞AP，因此將AP作為檢驗(yàn)牛奶的巴氏滅菌的標(biāo)志。4 展望AP的研究已經(jīng)有近百年的歷史，對(duì)于AP的結(jié)構(gòu)、功能、性質(zhì)、作用機(jī)理、活性調(diào)控等方面的研究均已取得了不小的成就。近年來(lái)，科研工作者將研究目光聚焦在AP的生理功能及應(yīng)用上，取得了許多新成果，如Lalls研究結(jié)

11、果認(rèn)為，腸型AP在保持腸道平衡中發(fā)揮重要作用，膳食可以影響它的活性，腸型AP具有參與調(diào)節(jié)碳酸氫鹽分泌和十二指腸pH、通過(guò)脫磷酸作用控制細(xì)菌內(nèi)毒素誘發(fā)的腸道炎癥等功能。但對(duì)該酶在生物體內(nèi)確切的生物學(xué)功能、工作機(jī)理，以及哺乳類AP的晶體結(jié)構(gòu)分析等方面還有待進(jìn)一步研究，相信隨著科學(xué)的發(fā)展、科研手段的進(jìn)步、對(duì)AP認(rèn)識(shí)的不斷深入，將使AP在科研和臨床診斷中發(fā)揮更大的作用。 參考文獻(xiàn)：1 Le Du M H, Stigbrand T, Taussig M J, et al. Crystal structure of alkaline phosphatase from human placenta at 1

12、.8 A resolution implication for a substrate specificityJ. J Biol Chem, 2001,276(12):91589165.2 Orimo H. The mechanism of mineralization and the role of alka-line phosphatase in health and disease J.J Nippon Med Sch,2010,77(1):412.3 Fernandez N J, Kidney B A. Alkaline phosphatase: beyond the liverJ.

13、Vet Clin Pathol, 2007, 34(9):6870.4 周新,涂植光.臨床生物化學(xué)和生物化學(xué)檢驗(yàn)M.第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社, 2006.5 王石瑩,閆素梅1堿性磷酸酶在動(dòng)物骨骼代謝中的研究進(jìn)展J.飼料博覽, 2009(4):1417.6 Lalls J P. Intestinal alkaline phosphatase: multiple biological roles in maintenance of intestinal homeostasis and modulation by diet J. Nutr Rev, 2010, 68(6):323332.二、實(shí)驗(yàn)

14、方案1 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題： 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及目標(biāo)：1) 質(zhì)粒DNA的小量制備：提取表達(dá)載體pET-His2) 質(zhì)粒DNA電泳鑒定3) 質(zhì)粒DNA的酶切4) PCR擴(kuò)增制備目的基因5) 目的基因片段與載體連接6) 從瓊脂糖凝膠中回收DNA片斷7) 感受態(tài)菌的制備8) 細(xì)菌轉(zhuǎn)化 9) 轉(zhuǎn)化克隆的篩選和鑒定10) 外源基因的誘導(dǎo)表達(dá) 11) SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)蛋白 關(guān)鍵問(wèn)題：a. IPTG誘導(dǎo)量及誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化；b. 超聲破碎的方案優(yōu)化。2 實(shí)驗(yàn)思路、方法、技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)方案及可行性分析： 實(shí)驗(yàn)思路：按照技術(shù)路線完成試驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)方法：電泳 PCR擴(kuò)增 原核誘導(dǎo)表達(dá)等。 技術(shù)路線：

15、 可行性分析：實(shí)驗(yàn)室相關(guān)技術(shù)成熟，實(shí)驗(yàn)人員熟悉相關(guān)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容以及方法，實(shí)驗(yàn)的可行性很高。3. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)度（10天之內(nèi)）：準(zhǔn)備：發(fā)放實(shí)驗(yàn)器材，搖pET-His，pMD-18T-NK。第一天：提質(zhì)粒并PCR擴(kuò)增NK，然后與pMD19-T連接過(guò)夜。第二天：作感受態(tài)DH5a。EcoRI和BamHI雙酶切pET-His。pMD19-T-NK連接液轉(zhuǎn)化DH5a涂板。回收pET-His。第三天：挑p-T-NK平板克隆，搖菌。提質(zhì)粒pMD19-T-NK。第四天：EcoRI和BamHI雙酶切驗(yàn)證?；厥誑K。NK與pET-His連接過(guò)夜。第五天：pET-His-NK連接液轉(zhuǎn)化DH5a，涂板。挑pET-His-NK克

16、隆，搖菌。搖BL21(DE3)。第六天：作感受態(tài)BL21(DE3)。提質(zhì)粒pET-His-NK。HindIII酶切驗(yàn)證。轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，涂板過(guò)夜。第七天：搖菌包括空BL21(DE3)。練習(xí)組裝SDS電泳模具。OD600=0.5時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)3h，離心集菌。第八天：灌膠加樣電泳（2-3h），染色45min，脫色。觀察脫色膠，轉(zhuǎn)入清水，照相。4. 預(yù)期實(shí)驗(yàn)成果： 1 獲得目的產(chǎn)物BAP； 2 成功構(gòu)建BAP表達(dá)載體； 3 撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告。5. 曾參與與本實(shí)驗(yàn)有關(guān)的學(xué)習(xí)和研究工作積累以及已取得的工作成績(jī)：（學(xué)過(guò)基因工程課程、讀過(guò)相關(guān)的文獻(xiàn)、寫過(guò)有關(guān)的綜述、參加過(guò)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)或研究課題、獲得學(xué)術(shù)獎(jiǎng)勵(lì)