小木蟲emuch課件

1、小木蟲emuch課件 工業(yè)微生物菌種選育技術(shù) 鏈霉菌基因工程 小木蟲emuch課件 為什么鏈霉菌？ 小木蟲emuch課件 鏈霉菌的重要性 產(chǎn)生絕大多數(shù)已知的抗生素 生物合成機(jī)制的闡明 生產(chǎn)工業(yè)用酶的潛力 葡萄糖異構(gòu)酶 蛋白酶 纖維素酶 木聚糖酶 。 小木蟲emuch課件 What Are Streptomyces? They are Gram Positive filamentous Bacteria. They are obligate aerobic bacteria that are abundant in most soils. Streptomyces have two metabo

2、lic stages, Primary and Secondary Metabolism. They utilize insoluble organic debris by producing a variety of extracellular hydrolytic enzymes. 小木蟲emuch課件 放線菌生活史 小木蟲emuch課件 Streptomyces coelicolor colonies with aerial mycelium and spores The area of the picture represents about 2x3 cm. The blue halo

3、es around the colonies are secreted a c t i n o r h o d i n . Actinorhodin is an antibiotic (not used clinically) which is blue under alkaline conditions and red under acidic conditions. Actinorhodin is a polyketide made by multiple condensations of acetate by a Type II polyketide synthase (John Inn

4、es Centre, Photography Department). 小木蟲emuch課件 Young vegetative mycelium Young vegetative mycelium (c. 1 m wide) of Streptomyces grown in liquid broth (light microscope ; Gabriella Kelemen John Innes Centre). 小木蟲emuch課件 Mutant colonies of Streptomyces coelicolor c. 1 cm x 1 cm. The wild-type colonie

5、s are covered with grey aerial mycelium and spores; the reddish mutant colonies are not forming aerial mycelium. The red mycelium colour and the dark background is from the antibiotics produced b y S t r e p t o m y c e s coelicolor (John Innes Centre, Photography Department). 小木蟲emuch課件 Single colo

6、ny of Streptomyces coelicolor S i n g l e c o l o n y o f Streptomyces coelicolor topped by a liquid droplet containing antbiotic. Liquid droplets are often found in Streptomyces colonies, it is not clear how they are generated. (John Innes Centre, Photography Department). 小木蟲emuch課件 Close up of a c

7、olony of Streptomyces coelicolor mutant D132 Close up of a colony of Streptomyces coelicolor mutant D132 which is produces undecylprodigiosin but not actinorhodin (image provided by Karen Jolly, University of Leeds). 小木蟲emuch課件 Mass of curled aerial mycelium of Streptomyces coelicolor Mass of curled

8、 aerial mycelium (c. 1 m wide) of Streptomyces coelicolor . (Scanning electron micrograph, Mark Buttner, Kim Findlay, John Innes Centre). 小木蟲emuch課件 Aerial mycelium and spore of Streptomyces coelicolor The mycelium and the oval spores are about 1m wide, typical for bacteria and much smaller than fun

9、gal hyphae and spores. (Scanning electron micrograph, Mark Buttner, Kim Findlay, John Innes Centre). 小木蟲emuch課件 Close up of Streptomyces coelicolor spores Close up of Streptomyces coelicolor spores (c. 1m wide) showing surface structures. (Scanning electron micrograph, Mark Buttner, Kim Findlay, Joh

10、n Innes Centre). 小木蟲emuch課件 What Are Antibiotics? Antibiotics are compounds that are products of secondary metabolism. Antibiotics can range from 100 to about 1200 in molecular weight. These compound inhibit the growth of other competitive microbes by interfering in their normal biochemistry. Of the

11、 thousands of antibiotics that have been discovered, two-thirds are produced by Streptomyces. 小木蟲emuch課件 Chronological table of novel antibiotic discovery 小木蟲emuch課件 鏈霉菌宿主菌的條件 遺傳背景清楚，不帶內(nèi)生質(zhì)粒； 由于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化主要借助原生質(zhì)體， 因此宿主菌的原生質(zhì)體制備和再生必 須易于進(jìn)行； 宿主菌相對于載體上的標(biāo)記必須是 “缺陷”的(即對標(biāo)記的抗生素敏感， 對產(chǎn)色素標(biāo)記缺陷)； 宿主菌必須沒有限制作用。 小木蟲emuch課件

12、 鏈霉菌宿主菌 Streptomyces lividans TK1326、 TK24、TK64等 Streptomyces coelicolor A3(2) Other Streptomyces 小木蟲emuch課件 Vectors for Streptomyces 高拷貝載體:pIJ101, pIJ702 低拷貝載體:pIJ61, pIJ922, pIJ941 穿梭載體: pIJ699 Cosmid:pKC505 接合轉(zhuǎn)移載體:pPM801 噬菌體載體:fC31系列 表達(dá)載體:pIJ6021, pIJ4123 分泌載體 小木蟲emuch課件 Other vectors 大容量載體：采用酵母人

13、工染色體 （YAC）克隆技術(shù)構(gòu)建了細(xì)菌BAC 載體，插入片段100300kb。 整合型載體：pSAM2， pHZ808 高表達(dá)載體：pCJR24, pCJR29 小木蟲emuch課件 常用的鏈霉菌質(zhì)粒載體 載 體分子(kb)復(fù)制子拷貝數(shù)遺傳標(biāo)記可 克 隆 位 點(diǎn) pIJ7025.8pIJ101100tsr, melBglII, SphI, SacI，MluI pIJ6805.3pIJ101100tsr, aphBamHI pIJ486 pIJ487 6.2pIJ101100neo多接頭位點(diǎn) pIJ6999.6pIJ101100tsr, ampBglII, HindIII, XbaI pIJ61

14、14.8SLP1.25aph, tsrBamHI, PstI, XbaI pIJ94125.0SCP2*12tsr, hyg BamHI, BglII, PstI, XbaI, EcoRI pIJ94320.6SCP2*12tsr, melBglII, XhoI, EcoRI, XbaI pKC50518.7SCP2*12aprBamHI pIJ60217.8pIJ101100kan, tsr多接頭位點(diǎn) pIJ41239.2pIJ101100kan, tsr多接頭位點(diǎn) 小木蟲emuch課件 質(zhì)粒pIJ702 pIJ702 5750 bp tsr ORF438 mel Essential pro

15、moter BamHI (2) BglII (4439) ClaI (2505) EcoRV (2779) KpnI (5353) NdeI (2274) NotI (1127) PstI (5000) PvuII (3022) SacI (4207) SphI (4608) XhoI (43) MluI (3676) MluI (3897) MluI (4014) 小木蟲emuch課件 鏈霉菌基因轉(zhuǎn)移方法 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 接合轉(zhuǎn)移 電穿孔轉(zhuǎn)移（Electroporation） 噬菌體轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)導(dǎo) 小木蟲emuch課件 克服宿主限制性修飾系統(tǒng) 甲基化缺陷的大腸桿菌宿主 用lividans作為過渡

16、PCR獲得DNA 單鏈DNA 原生質(zhì)體熱處理 體外去除甲基化修飾 突變株宿主 小木蟲emuch課件 鏈霉菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 小木蟲emuch課件 轉(zhuǎn)化的注意點(diǎn) PEG的影響：批號、分子量、濃度 R2YE平板的干燥度：15%左右 加抗生素篩選的時間 小木蟲emuch課件 Protocol for transformation of Streptomyces by electroporation 小木蟲emuch課件 接合轉(zhuǎn)移的優(yōu)點(diǎn) 免除原生質(zhì)體制 備、再生 降低限制修飾作 用 完善的質(zhì)粒載體 穿梭質(zhì)粒 pSET152, oriT 小木蟲emuch課件 接合轉(zhuǎn)移 oriT質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化ET12567 抗性轉(zhuǎn)化

17、子 培養(yǎng)過夜 稀釋后培養(yǎng) 至A6000.5 LB洗滌， 以0.1倍懸浮 108孢子50 熱激10分鐘 等體積混合 大腸桿菌和 鏈霉菌孢子 混合涂布， 萘啶酮酸、 抗生素篩選 菌絲體也適用菌絲體也適用 小木蟲emuch課件 克隆次級代謝途徑生物合成基因 的方法 方法 實(shí)例 遺傳互補(bǔ)（Genetic complementation） 放線紫紅素 123， 鏈霉素129 異源表達(dá)（Heterologous expression） R1128131 克隆抗性基因（Cloning of resistance genes） 雙丙氨膦（Bialaphos）204， 土霉素205 反向遺傳學(xué)（Reverse

18、genetics） 利福霉素206， 轉(zhuǎn)座子誘變（Transposon mutagenesis） 達(dá)托霉素（Daptomycin）37 蛋白組學(xué)（Proteomics） 尼柯霉素（Nikkomycin）114 異源探針（Heterologous probes） II型PKS130， I型PKS154， 脫氧糖 141 PCR和同源探針 II型PKS139， 脫氧糖 137，138，207，208， NRPS 140， 3-氨基-5-羥苯甲酸合酶137， 鹵化酶 （halogenase） 209， III型PKS 134 小木蟲emuch課件 抗生素生物合成基因克隆策略 將目的基因克隆到標(biāo)準(zhǔn)宿主

19、菌，然后 檢測個別基因產(chǎn)物。 克隆與阻斷突變株互補(bǔ)的基因。 利用突變克隆，分析生物合成基因簇 （gene cluster）。 克隆抗性基因并分析連鎖的生物合成 基因 小木蟲emuch課件 用人工合成的寡核苷酸探針探測基 因文庫 直接克隆抗生素產(chǎn)生菌的DNA大片 段到非抗生素產(chǎn)生菌中，檢測產(chǎn)物 的表達(dá)。 利用已克隆的生物合成基因?yàn)樘结?克隆同源基因。 PCR擴(kuò)增已知基因。 小木蟲emuch課件 將目的基因克隆到標(biāo)準(zhǔn)宿主菌，然后檢測個別基因產(chǎn)物 Target gene:灰色鏈霉菌中與殺念菌素生物合 成有關(guān)的對氨基苯甲酸(PABA)合成酶基因pab。 宿主和載體：變青鏈霉菌，BamHI片段插入 到p

20、IJ41的BamHI位點(diǎn) 篩選方法與結(jié)果： 以過量產(chǎn)生PABA的灰色鏈霉菌的磺胺抗性株為 供體，在硫鏈絲菌素抗性轉(zhuǎn)化子中選擇磺胺抗性 克隆子； 以野生型為供體，pab營養(yǎng)缺陷型為受體選擇原 養(yǎng)型克隆子。結(jié)果從兩種選擇方法中各獲得一個 克隆子，每個克隆都帶有45kb的BamHI片段 小木蟲emuch課件 Target gene:抗生鏈霉菌中與放線菌素生物合成有關(guān)的吩噁 嗪酮(phenoxazinone)合成酶(PHS)基因。 宿主和載體：變青鏈霉菌66，SphI片段克隆到pIJ702的SphI 位點(diǎn)上。 篩選方法與結(jié)果：從5000個硫鏈絲菌素的抗性轉(zhuǎn)化子中檢測 從3-羥基蒽林酸產(chǎn)生黃色朱紅菌酸的

21、轉(zhuǎn)化子，獲得了三個克 隆子，其中一個攜帶了編碼PHS結(jié)構(gòu)基因的2.45kb的SphI DNA片段，另外兩個各含有1.77kb和4.28kb的SphI片段。當(dāng) 轉(zhuǎn)入變青鏈霉菌后，起激活變青鏈霉菌染色體上沉默基因的 作用。 v本方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要了解抗生素生物合成途徑的本方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要了解抗生素生物合成途徑的 遺傳信息，但要知道何種酶參與了生物合成以及具遺傳信息，但要知道何種酶參與了生物合成以及具 有檢測這種酶的靈敏的分析方法。有檢測這種酶的靈敏的分析方法。 小木蟲emuch課件 克隆與阻斷突變株互補(bǔ)的基因 抗生素的生物合成途徑通常涉及到1030酶反應(yīng)步驟，如果 通過誘變的方法使其中的一個酶失

22、活，而使其不能合成最終 產(chǎn)物，這種突變株稱為阻斷突變株（Blocked mutants）。如 果克隆了一段外源基因而使抗生素的合成恢復(fù)，表明這段基 因互補(bǔ)了原先失活的酶基因 Target gene: 天藍(lán)色鏈霉菌中十一烷基靈菌紅素(Red)生物合 成基因。Blocked Mutants：首先用紫外光誘變天藍(lán)色鏈霉菌， 經(jīng)篩選獲得37個不產(chǎn)Red的突變株，通過共合成試驗(yàn)將突變 株分成5類(red AE)，每組的代表已在天藍(lán)色鏈霉菌染色體 上作出了一簇緊密連鎖的位點(diǎn)圖。 宿主和載體：阻斷突變株red E60，將天藍(lán)色鏈霉菌的 DNA 用BclI和PstI完全酶解或MboI部分酶解，將這些DNA片段

23、分別 插入pIJ702的BglII、pIJ350的PstI或pIJ922的BamHI位點(diǎn)。 小木蟲emuch課件 篩選方法和結(jié)果：從硫鏈絲菌素抗性轉(zhuǎn)化子中檢測紅色菌落的克隆子。 獲得的21kb的片段能互補(bǔ)4類阻斷突變株(A、B、E和F)，這表明Red生 物合成基因位于這段DNA上。 除了十一烷基靈菌紅素的有關(guān)基因外，采用互補(bǔ)克隆的方法還克隆了許 多其他抗生素的生物合成基因，其中包括放線紫紅素(pIJ2303，35kb MboI片段插入到質(zhì)粒pIJ922的BamHI位點(diǎn))；棒酸(pWO1和pWO2， MboI片段插入到質(zhì)粒pIJ702的BglII位點(diǎn)，這兩質(zhì)粒均含有2kb的同源部 分)；鏈霉素(

24、pSSB1，10.1kb，PstI片段插入pIJ385)；碳青霉烯 (carbapenem)；Tetracenomycin C(BamHI DNA片段克隆到pIJ702 BglII 位點(diǎn)，12.9kb的DNA與9個突變株中的7個互補(bǔ))；除蟲菌素； 福提霉素 (fortimicin)；Nikkomycin；柔紅霉素等九種抗生素的生物合成基因?？?見，突變互補(bǔ)是克隆抗生素生物合成基因最成功的方法之一。 這個方法成功的先決條件是獲得抗生素生物合成途徑被阻斷的一系列突這個方法成功的先決條件是獲得抗生素生物合成途徑被阻斷的一系列突 變株，這并非是容易做到的事；此外，還需建立以阻斷突變株為宿主的變株，這并

25、非是容易做到的事；此外，還需建立以阻斷突變株為宿主的 載體宿主系統(tǒng)，由于抗生素產(chǎn)生菌限制作用的普遍性，有時建立這樣的載體宿主系統(tǒng)，由于抗生素產(chǎn)生菌限制作用的普遍性，有時建立這樣的 載體宿主系統(tǒng)也是很困難的。載體宿主系統(tǒng)也是很困難的。 小木蟲emuch課件 利用突變克隆分析生物合成基因簇 v突變克隆技術(shù)是指外源基因借助載體進(jìn)入抗生素 的產(chǎn)生菌中，如果外源基因與抗生素產(chǎn)生菌的生 物合成基因有同源性，就有可能與產(chǎn)生菌的轉(zhuǎn)錄 單位雜交，造成該基因的轉(zhuǎn)錄中斷而影響其表達(dá)， 以此來確定克隆基因的性質(zhì)。 Target gene：位于質(zhì)粒SCP1（未分離到）上的 次甲霉素A生物合成基因。 宿主和載體：變青鏈霉

26、菌66，PstI片段插入到 fC31衍生的KC400噬菌體的PstI位點(diǎn)。 小木蟲emuch課件 篩選方法和結(jié)果：經(jīng)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生噬菌斑，隨后影印到變青鏈霉菌(SCP1-) 上，待長孢子后，影印到加紫霉素的平板得到溶源菌，從中篩選被克隆 的次甲基霉素突變株。結(jié)果從突變株中釋放出的噬菌體DNA均含有PstI 片段，大小在26 kb。進(jìn)一步的突變克隆研究，證明SCPI質(zhì)粒上至少 17 kb的DNA片段參與了生物合成，其中有兩個轉(zhuǎn)錄單位，分別為至少 6.6 kb和9.5 kb，位于左大轉(zhuǎn)錄單位的最左邊有一負(fù)調(diào)控基因，抗性基因 位于其右邊盡端約1.6 kb處，轉(zhuǎn)錄方向從左到右。兩個長操縱子轉(zhuǎn)錄從 右到左，每

27、個轉(zhuǎn)錄單位中至少含有30個生物合成基因。 v 雖然突變克隆能快速地克隆部分生物合成基因而又不必要知雖然突變克隆能快速地克隆部分生物合成基因而又不必要知 道抗生素合成途徑的一些背景知識以及篩選阻斷突變株，但道抗生素合成途徑的一些背景知識以及篩選阻斷突變株，但 至今還未被普遍采用于直接克隆，而僅被用作分析克隆到的至今還未被普遍采用于直接克隆，而僅被用作分析克隆到的 基因片段。其確實(shí)原因還不很清楚，但原因之一是由于基因片段。其確實(shí)原因還不很清楚，但原因之一是由于 f fC31噬菌體尚不能轉(zhuǎn)染所有的鏈霉菌。預(yù)期隨著整合型質(zhì)噬菌體尚不能轉(zhuǎn)染所有的鏈霉菌。預(yù)期隨著整合型質(zhì) 粒載體的不斷發(fā)展，粒載體的不斷發(fā)

28、展， 突變克隆將得到廣泛的應(yīng)用。突變克隆將得到廣泛的應(yīng)用。 小木蟲emuch課件 克隆抗性基因并分析連鎖的生物合成基因 v對已經(jīng)克隆到的放線紫紅素的生物合成基因研究表明：生 物合成基因成簇并與抗性基因連鎖。這就為人們提供了這 樣一種設(shè)想： 即用敏感菌株(模式菌或產(chǎn)生菌的突變株)為 宿主，克隆抗性基因。如果克隆到的片段足夠大，就可直 接分析與之連鎖的生物合成基因；如果獲得的抗性基因片 段較小，可利用它為探針來克隆同源的DNA片段。 Target gene：土霉素的抗性基因 (otcR) 宿主和載體：otcS突變株，染色體DNA的PstI片段和BglII 片段分別克隆到載體質(zhì)粒pRF212和pRF

29、234的PstI和BglII 位點(diǎn)，篩選后獲得2個otcR基因(otrA、otrB)，以這兩個 otcR基因?yàn)樘结樔z測基因庫，分別獲得了一個陽性菌落， 從中分離的DNA片段能與幾個土霉素阻斷突變株互補(bǔ)。限 制酶圖譜表明，克隆到的生物合成基因?yàn)?4 kb，otrA和 otrB基因位于DNA片段的兩端。 小木蟲emuch課件 利用這一方法克隆到的生物合成基因還包 括紅霉素、二丙胺磷(Bialaphos)、嘌呤 霉素(puromycin)、碳霉素(carbomycin)、 西 梭 霉 素 ( s i s o m y c i n ) 、 諾 西 肽 (nosiheptide)。 v利用抗性基因克隆連

30、鎖的生物合成基因利用抗性基因克隆連鎖的生物合成基因 是一個很有效的方法，如果標(biāo)準(zhǔn)宿主菌是一個很有效的方法，如果標(biāo)準(zhǔn)宿主菌 對某一個抗菌素敏感，而抗性基因又與對某一個抗菌素敏感，而抗性基因又與 生物合成基因連鎖，那么用這一方法克生物合成基因連鎖，那么用這一方法克 隆生物合成基因的成功性將會很大。但隆生物合成基因的成功性將會很大。但 是，由于獲得的片段一般都較大，因此是，由于獲得的片段一般都較大，因此 必須做大量的亞克隆實(shí)驗(yàn)才能確認(rèn)編碼必須做大量的亞克隆實(shí)驗(yàn)才能確認(rèn)編碼 各個生物合成酶的特異性基因。各個生物合成酶的特異性基因。 小木蟲emuch課件 用人工合成的寡核苷酸探測基因文庫 v由于鏈霉菌D

31、NA中G+C的比例很高(73%左右)，因 此鏈霉菌基因?qū)γ艽a子利用有明顯的不隨機(jī)性，即 密碼子第三位有90%以上常為G和C，因此，在分析 了某一個抗生素生物合成酶的部分氨基酸順序后， 就能設(shè)計出較低程度簡并性的寡核酸順序，經(jīng)人工 合成這段順序后就可用作探針從基因庫中釣出所需 的克隆子。 Targetgene：異青霉素N合成酶(IPS)基因。 篩選方法和結(jié)果：在確定IPS蛋白的N末端前23個氨 基酸順序后，合成了一系列寡核苷酸的探針，最后 克隆了11.6 kb具有IPS蛋白的全部基因。其他一些 科學(xué)家利用環(huán)化酶寡核苷酸探針也克隆異青霉素N 合成酶基因。 小木蟲emuch課件 Target gen

32、e：泰樂菌素生物合成基因中O-甲基轉(zhuǎn)移 酶(MOMT)。 篩選方法和結(jié)果：首先提純了這個酶并測定了該酶氨 基端的氨基酸序列，并以此為根據(jù)人工合成了一段44 個堿基的寡聚核苷酸探針，用它分別與用噬菌體 charon4建立的弗氏鏈霉菌基因文庫和用粘粒 pKC462a構(gòu)建的基因文庫雜交。最后證明前者中10個 重疊的重組子含有58kb的DNA。與探針有陽性雜交的 一個 1.2 kb EcoRI-SacI 的片段克隆到pUC1169上， DNA測序分析表明，人工合成的44bp的探針與天然狀 態(tài)的DNA順序相比只有一個核苷酸差異。 v 從上面的這些例子證明，只要能提純抗生素生物合成途徑的任何一個酶，從上面

33、的這些例子證明，只要能提純抗生素生物合成途徑的任何一個酶， 通過測定一段氨基酸的順序并依此人工合成一段寡核苷酸探針，就能克通過測定一段氨基酸的順序并依此人工合成一段寡核苷酸探針，就能克 隆相應(yīng)的酶基因、甚至與此基因連鎖的其他生物合成酶基因。但遺憾的隆相應(yīng)的酶基因、甚至與此基因連鎖的其他生物合成酶基因。但遺憾的 是許多抗生素生物合成酶僅在發(fā)酵的特定階段產(chǎn)生且由于酶的不穩(wěn)定或是許多抗生素生物合成酶僅在發(fā)酵的特定階段產(chǎn)生且由于酶的不穩(wěn)定或 分離技術(shù)的限制而無法提純。分離技術(shù)的限制而無法提純。 小木蟲emuch課件 直接克隆抗生素產(chǎn)生菌DNA大片段到非產(chǎn)生菌中 v用鳥槍法直接克隆抗生素產(chǎn)生菌的DNA

34、大片段 到一個非產(chǎn)生菌的策略是基于這樣的一個事實(shí)： 即完整的放線紫紅素生物合成基因克隆到一個非 產(chǎn)生菌小小鏈霉菌，結(jié)果小小鏈霉菌產(chǎn)生了放線 紫紅素。 Target gene：S. cattley頭霉素生物合成基因 宿主和載體：變青鏈霉菌1326，總DNA部分酶 切成2040 kb的片段，然后連接到pIJ943的 BglII位點(diǎn)上。 小木蟲emuch課件 篩選方法和結(jié)果：選擇不產(chǎn)黑色素的硫鏈絲 菌素抗性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行抗菌活性測試，結(jié)果從 30,000個菌落中獲得一個有抗菌活性的轉(zhuǎn)化 子PF15-1，從中分離到一個帶29.3 kb插入片 段的質(zhì)粒pIF900。通過BglII切掉兩個相鄰的 BglII片

35、段或用外切酶BAL-31于ClaI位點(diǎn)降解， 均減少頭霉素C的產(chǎn)生，說明其生物合成基因 簇可能13.5 kb。 v此外，紅霉素和土霉素的生物合成基因雖然此外，紅霉素和土霉素的生物合成基因雖然 不是用此策略克隆成功的。但當(dāng)將它們各自不是用此策略克隆成功的。但當(dāng)將它們各自 的整套基因轉(zhuǎn)入變青鏈霉菌，結(jié)果產(chǎn)生了紅的整套基因轉(zhuǎn)入變青鏈霉菌，結(jié)果產(chǎn)生了紅 霉素和土霉素。這些結(jié)果證明這一策略同樣霉素和土霉素。這些結(jié)果證明這一策略同樣 是可行的。是可行的。 小木蟲emuch課件 利用已克隆的生物合成基因?yàn)樘结樋寺⊥椿?v分別以actI和actIII基因?yàn)樘结?，去探測具有聚酮 (polyketide)生物

36、合成途徑的其他抗生素產(chǎn)生菌的DNA， 發(fā)現(xiàn)被檢測的絕大多數(shù)產(chǎn)生菌(18種具有聚酮生物合成途 徑的抗生素產(chǎn)生菌中的14種有陽性雜交，7種無聚酮生物 合成途徑菌種中有3個呈陽性雜交)的DNA能與actI或actIII 基因雜交。他們推測，具有聚酮生物合成途徑的抗生素產(chǎn) 生菌可能都來源于同一個祖先，只是在進(jìn)化過程中各自發(fā) 生了一些變異而產(chǎn)生了不同的抗生素。所以，如果不同的 聚酮生物合成酶的氨基酸序列具有保守性的話，那么編碼 某個聚酮生物合成酶的基因就可以作探針克隆其它的基因 及生物合成基因簇。 Target gene：Milbemycin的生物合成基因 篩選方法和結(jié)果：actIII基因?yàn)樘结樑cMil

37、bemycin和榴菌 素產(chǎn)生菌的基因文庫雜交，獲得了actIII的同源基因，將 這些來自Milbemycin和榴菌素產(chǎn)生菌的同源DNA片段轉(zhuǎn)入 天藍(lán)色鏈霉菌的actIII突變株，產(chǎn)生了類似或同樣的放線 紫紅素色素。 小木蟲emuch課件 我國王以光教授等以actI和actIII基因?yàn)樘结槪?探測由粘粒pNJ1組建的麥迪加霉素產(chǎn)生菌生米 卡鏈霉菌4748的基因文庫，陽性菌落經(jīng)雜交進(jìn) 一步定位與actIII和actI同源的DNA片段，結(jié)果 發(fā)現(xiàn)4.02kb的EcoRI-BamHI DNA片段與actIII 基因同源，而2.42 kb和10 kb BglII片段與actI 同源。當(dāng)將4.02 kb和

38、2.42 kb的同源DNA片段 分別導(dǎo)入PKS的生米卡鏈霉菌68及變青鏈霉 菌TK24后，均能檢測到與麥迪霉素相似的化 合物。以類似的方法，他們還克隆到了螺旋霉 素的生物合成基因 利用異源DNA片段為探針還克隆到了麥迪加霉 素4“-丙酰轉(zhuǎn)移酶、etamycin抗性基因、苦霉素 (pikromycin)生物合成基因以及酒霉素 (Methymycin)、富倫菌素、莫能量、無活菌素、 氯絲菌素、居拉霉素(curamycin)等同源基因。 小木蟲emuch課件 鏈霉菌基因克隆策略小結(jié) 由上可見，克隆抗生素生物合成的策略是多種由上可見，克隆抗生素生物合成的策略是多種 多樣的，似乎每一個策略都能成功地克隆到生多樣的，似乎每一個策略都能成功地克隆到生 物合成基因。但是相對而言，突變互補(bǔ)、抗性物合成基因。但是相對而言，突變互補(bǔ)、抗性 基因探針以及同源基因探針是其中使用最普遍基因探針以及同源基因探針是其中使用最普遍 最成功的方法，有理由相信，隨著鏈霉菌基因最成功的方法，有理由相信，隨著鏈霉菌基因 克隆技術(shù)的日臻完善和成熟，熟練使用上述的克隆技術(shù)的日臻完善和成熟，熟練使用上述的 策略或互相配合使用，克隆抗生素生物合成基策略或互相配合使用，克隆抗生素生物合成基 因?qū)⒉皇且患芾щy的事，并必將大大地推動因?qū)⒉皇且患芾щy的事，并必將大大地推動 對抗生素生物合成酶的調(diào)控與抗性基因的關(guān)系對抗生素生物合成酶