表沒食子兒茶素沒食子酸酯減輕大鼠血管滑膩肌細胞鈣化的實驗研究

1、表沒食子兒茶素沒食子酸酯減輕大鼠血管滑膩肌細胞鈣化的實驗研究徐華，納春祥，李桂忠，曹軍【摘要】 目的觀看表沒食子兒茶素沒食子酸酯 (epigallocatechingallate, egcg)對大鼠血管滑膩肌細胞鈣化的阻 礙。方式 制備8-甘油磷酸鹽誘導(dǎo)血管滑膩肌細胞(vascular smooth muscle cells, vsmcs)鈣化模型。實驗分為4組：對照組、鈣化組、 單純egcg組及egcg干與組(又分為10-7、10-六、10-5和10-4 mol -1 的egcg 4個亞組)。von kossa染色觀看細胞鈣化情形，生化試劑盒 比色法測定鈣含量及堿性磷酸酶(alkaline

2、phosphatase, alp)活性。 結(jié)果vsmcs鈣化組von kossa染色見滑膩肌細胞內(nèi)和細胞間基質(zhì)有大 量黑色顆粒聚集;與對照組比較，鈣化組vsmcs鈣含量、alp活性均有 明顯增加；10-710-4moll-1 egcg干與組vsmcs鈣含量、alp活性 呈劑量依托性有顯著降低。結(jié)論egcg具有抑制vsmcs鈣化的作用?！娟P(guān)鍵詞】表沒食子兒茶素沒食子酸酯;血管鈣化綠茶及其要緊提取物表沒食子兒茶素沒食子酸酯 (epigallocatechingallate, egcg)可延緩動脈粥樣硬化的形成和進 展，降低動脈粥樣硬化的危險1-2,且能夠抑制由血管緊張素h (angiotensin

3、 ii, ang h )誘導(dǎo)的 c-jun mrxa 的表達，使 c-jun 氨基 端激酶(jnk)的激活受阻，從而抑制由angl【刺激產(chǎn)生的血管滑膩肌細 im (vascular smooth muscle cells, vsmcs)肥大，防治心血管疾病(高 血壓、動脈粥樣硬化和血管成形術(shù)后再狹小等)3。本研究組已證明 4,綠茶可明顯減輕大鼠血管鈣化模型的鈣化程度，且綠茶抑制鈣化 的效應(yīng)可能部份與干與血漿和血管組織的angh系統(tǒng)有關(guān)。但綠茶要 緊提取物egcg與血管鈣化之間的關(guān)系迄今未見報導(dǎo)。本研究擬在制備 大鼠血管滑膩肌細胞鈣化的模型上，觀看egcg對血管鈣化的阻礙，以 探討egcg對血管

4、鈣化的作用。1材料與方式材料雄性sprague-dawley大鼠150180g,由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物 中心提供。甘油磷酸鈉、dmem胰蛋白酶及egcg購自sigma公司； 胎牛血清購自武漢三利生物制品廠;堿性磷酸酶、鈣測試盒購自南京建 成生物技術(shù);其余試劑均為市售分析純。原代大鼠血管滑膩肌細胞培育取材及培育材料的制備取大鼠，胸腹部備皮，環(huán)枕關(guān)節(jié)脫臼 后，消毒、開胸，暴露并分離主動脈至腹主動脈腎動脈分支處。將 分離出的動脈，置入預(yù)先加有培育液的無菌培育皿中，清洗，剝除外 膜的纖維脂肪層?？v向剖開血管，內(nèi)膜面向上，用刀片刮內(nèi)膜12 次。警惕撕下近內(nèi)膜面的中膜層，浸泡在含10%胎牛血清的dmem培

5、 育液內(nèi)，將血管條剪成1 mmxl mm的小塊。原代血管滑膩肌細胞接種與培育用吸管將小塊組織吸出注入培 育瓶中，在瓶底壁上擺置均勻，以小塊間距離cm為宜，輕輕翻轉(zhuǎn)培 育瓶，瓶底朝上(注意勿使組織塊流開)，加入培育液，37, 5% c02 培育。培育24h后慢慢翻轉(zhuǎn)培育瓶，令液體緩緩覆蓋組織小塊，注意 勿使組織小塊從瓶壁上沖掉，再繼續(xù)培育約5d,可見滑膩肌細胞從組 織塊的斷面中長出，待接近長滿瓶底85%時即可傳代。大鼠血管滑膩肌細胞鈣化模型的制備及實驗分組參照文獻5 組織塊貼壁法培育大鼠vsmcs,培育液為含15%(v/v)胎牛血清的dmem, 細胞呈梭形及典型的“峰谷”狀生長，成“峰”部位細胞

6、密集多層生 長，而成“谷”部位細胞密度相對較少，a-actin免疫組化染色陽性 證明培育的細胞為vsmcs。實驗用58代細胞，將細胞按ix 105個孔 -1接種于24孔培育板，每組6孔，分為：對照組(c0n)：單純dmem 培育基(含15%fbs,下同)培育;鈣化組(vdn)：培育基中加入10-3 mol -l-1的b-甘油磷酸鹽;egcg組：培育基含10-4 mol - l-1的egcg;鈣化+egcg組(vd+egcg)：在鈣化培育液中別離加入10-7.10- 六、10-5和10-4 mol - l-1的egcg,共分四個亞組。每2天換液1 次，10d后搜集細胞做下述測定。血管滑膩肌細胞v

7、on kossa染色參照文獻5的方式制作細胞爬片，孵育終止后將培育的細胞放入 4, 4%的多聚甲醛溶液中固定45 min,蒸鐳水清洗后將玻片放入5% 的硝酸銀溶液中，在紫外燈下照射30 min,經(jīng)%的硫代硫酸鈉溶液定 影處置5min后，堿性品紅返染，脫水、透明、封片，于光鏡下觀看。血管滑膩肌細胞總鈣含量6和堿性磷酸酶(alp)活性測定細胞培育終止后用冷的pbs洗3次，用刮刀把細胞刮入200 hl 的溶解緩沖液%np-40溶于10-3 mol - l_1 mgc12)中，利用超聲波破碎 (功率40 w),樣品試管置入冰水中，破碎10s,暫停10s,共6次， 破碎成效用顯微鏡證明，然后離心(4,

8、3500 r min-1, 10 min), 取上清液。用生化試劑盒比色法進行細胞鈣含量及alp活性測定。統(tǒng)計學(xué)方式數(shù)據(jù)以均數(shù)土標準差表示(土 s),兩樣本均數(shù)間比較采納t查驗, 多樣本均數(shù)間比較采納one-way anova查驗，組間的兩兩比較采納student-newman- keuls （snk）方式查驗，以p<為不同有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果血管滑膩肌細胞von kossa染色正常大鼠vsmcs呈梭形，貼壁正常，無鈣沉積現(xiàn)象（圖1a,見封 3）o 8-甘油磷酸鹽誘導(dǎo)的鈣化vsmcs生長9lid后，細胞聚集呈菊 花狀的結(jié)節(jié)，胞內(nèi)及細胞間質(zhì)可見大量鈣沉積（黑色顆粒沉積），部份 聚集成團并形

9、成鈣結(jié)節(jié)（圖1b,見封3）;而經(jīng)不同濃度的egcg處置后 的鈣化vsmcs鈣沉積明顯減少（圖1cf,見封3）o血管滑膩肌細胞鈣含量的轉(zhuǎn)變與對照組比較，甘油磷酸鹽誘導(dǎo)的vsmcs鈣化組，其細胞總鈣 含量高倍（p<。與b -甘油磷酸鹽鈣化組相較，egcg 10-六、10-5和10-4 mollt 與13 -甘油磷酸鹽一起孵育減少其誘導(dǎo)的細胞鈣含量，別離低、% 和（均p<,其相關(guān)分析見圖2。血管滑膩肌細胞堿性磷酸酶的轉(zhuǎn)變vsmcs鈣化組alp活性較對照組高倍（p<,見表1。egcg （10-7、 10-六、10-5和10-4moll-1）呈濃度依托性降低b -甘油磷酸鹽誘導(dǎo) 的鈣化

10、vsmcs的alp活性，與鈣化組比較，別離低（p<、和（均 p<,其相關(guān)分析見圖3。表1 vsmcs鈣含量、alp活性轉(zhuǎn)變（土s, n=6）3討論本實驗用b -甘油磷酸鈉誘導(dǎo)大鼠vsmcs鈣化5,引發(fā)大鼠vsmcs 總鈣含量增加，alp活性增強，vonkossa染色可見vsmcs內(nèi)有大量鈣 沉積及鈣結(jié)節(jié)形成等典型血管鈣化表現(xiàn)，與文獻報導(dǎo)一致6,說明 vsmcs鈣化模型成立成功。在離體培育的p -甘油磷酸鹽誘導(dǎo)的vsmcs鈣化模型上，用綠茶的 要緊提取物egcg進行干與，呈濃度依托性降低vsmcs的alp活性，減 輕細胞鈣超負荷;本實驗條件下，隨培育用egcg濃度的增加，vsmcs

11、鈣化程度慢慢減輕。以上結(jié)果提示egcg具有抑制vsmcs鈣化的作用。 研究已證明，綠茶干與血管鈣化的效應(yīng)與下調(diào)血漿和血管組織的ang ii有關(guān)4,而egcg抑制血管鈣化效應(yīng)是不是與angii下調(diào)有關(guān)，及 與其他鈣化調(diào)劑因子如腫瘤壞死因子、尾加壓素等的關(guān)系值得進一步研究。【參考文獻】1 janie em, portocarrero c, zhu y, et al. effect of long-term oral administration of green tea extract on weight gain and glucose tolerance in zucker diabetic

12、(zdf) ratsj. j herb pharmacother, 2005, 5 (3): 5565.2j bursill ca, roach pd. modulation of cholesterol metabolism by the green tea polyphenol (-)-epigallocatechin gallate in cultured human liver (hepg2) cells j. j agric food chem, 2006, 54 (5) : 1621.3 zheng y, song hj, kim ch, et al. inhibitory eff

13、ect of epigallocatechin 3-0-gallate on vascular smooth muscle cell hypertrophy induced by angiotensin ii j. j cardiovasc pharmacol, 2004, 43 (2) : 200.4徐華，萬定，楊曉明，等.綠茶對實驗大鼠血管鈣化的阻礙 j.寧夏醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2020, 30(4): 424-426.5 tintut y, parhami f, bostrom k, et al. camp stimulates osteoblast-like differentiation of calcifying vascular cells.potential signaling pathway for va