主流煙氣中氨的測定

1、 卷煙 主流煙氣中氨的測定 離子色譜法實 驗 報 告一 立項背景隨著吸煙與健康研究的不斷深入，煙氣中的化學成分日益引起人們的重視。英屬哥倫比亞和加拿大政府要求公布煙氣中44種霍夫曼有害化學成分的含量，巴西和美國的部分地區(qū)也做出了相似的規(guī)定，預計不久的將來，許多國家將制訂相關(guān)的法律法規(guī)。隨著中國加入WTO的進程加快，卷煙市場的逐步開放，WHO國際控煙框架的形成，國內(nèi)消費者對吸煙與健康、卷煙安全性問題日益關(guān)注。作為卷煙生產(chǎn)和消費的大國，有必要在煙氣有害成分檢測方面建立統(tǒng)一的國內(nèi)行業(yè)標準。卷煙主流煙氣中的氨是44種有害成分中的一種，來源于煙草中的含氮化合物，游離氨能堿化煙氣，增加煙氣中非質(zhì)子化尼古丁

2、的濃度，使尼古丁更易被吸收，從而增加了煙草致癮性和全球使用量。主流煙氣中，尼古丁分布于氣、粒兩相，氣相中的尼古丁完全以游離煙堿的形式存在，粒相中以質(zhì)子化和游離態(tài)兩種形式存在，其比例根據(jù)粒相物的pH值不同，Hoffmann等人的研究表明：pH值在5.8時，尼古丁主要以單質(zhì)子化和雙質(zhì)子化形式存在，而隨著pH值進一步升高，游離尼古丁的相對含量逐漸增加，在pH=7.8時，煙氣中大約總尼古丁的30%為游離態(tài)。Sloan和Morie的實驗證明煙氣中游離氨的總量與pH值（5.27.4）呈明顯正相關(guān)。氨對尼古丁生物利用度的增加作用主要通過：（1）增大氣、粒兩相中游離煙堿的比例；（2）增大氣相中煙堿的分布比例，

3、從而造成一種由濃度驅(qū)動的，尼古丁在口腔、上呼吸道上皮細胞中更快速、更大量的吸收。根據(jù)BAT的一份研究報告，在卷煙里使用氨的添加劑可使尼古丁的最高輸送率達到45%。此外，氨會污染室內(nèi)環(huán)境空氣，環(huán)境中低含量的氨氣（10 g/m3）就會引起上呼吸道敏感的人咽喉刺激感、呼吸急促，高含量的氨氣（750 mg/m3）甚至可能引發(fā)慢性阻塞性肺病1,2,3。目前，行業(yè)里對主流煙氣中氨的檢測已有多種方法。國內(nèi)主要有中國科學技術(shù)大學煙草與健康研究中心王希琴、蔡繼寶等4以及鄭州煙草研究院趙曉東等5建立的離子色譜法測定卷煙主流煙氣中的氨的方法。國外煙草公司和機構(gòu)也進行了大量的研究工作，包括菲莫、雷諾、BAT、UK、A

4、rista、Health Canada等，建立了較成熟的分析方法6,7,8,9,10,11，各種方法均測定了氣、粒兩相中氨的總量。主要差異在于前處理條件不同：捕集液種類、體積；捕集阱的設(shè)計；抽吸支數(shù)；萃取時間；捕集液的轉(zhuǎn)移過程等。氨的分析均采用陽離子交換色譜，外標法定量，但標準曲線的擬合方程存在差異。本項目對卷煙主流煙氣中氨的收集、前處理和儀器分析方法進行了研究，優(yōu)化了捕集、萃取和離子色譜分析條件，驗證并建立了離子色譜法測定卷煙主流煙氣中的氨的標準分析方法。二 項目合同內(nèi)容項目合同設(shè)定的研究路線和實驗內(nèi)容如下：將卷煙按照國標進行前期處理，在捕集器和抽氣口之間放置自制的煙氣捕集阱，用于捕集煙氣氣

5、相中的氨，另用捕集液萃取抽吸后濾片，用于捕集煙氣粒相中的氨，合并定容，使用離子色譜進行氨的定量測定。其中，測定回收率和空白，進行重復性和重現(xiàn)性實驗，測試不同種卷煙進行方法驗證。三 實驗部分3.1 試劑與材料濃鹽酸：36 % 38 %（質(zhì)量分數(shù)），分析純純水：電阻率為18.2 M cm的超純水甲磺酸（Acros），色譜純NH4+ 標準溶液，國家標準物質(zhì)研究中心樣品：上海煙草（集團）公司籌備的商品卷煙和參比卷煙（2R4F、1R5F）3.2 儀器與設(shè)備 Dionex-600離子色譜儀（Dionex 公司），配電導檢測器 回旋式震蕩器吸煙機：RM20H（Borgwaldt）、SM400（Filtron

6、a）、SM450（Cerulean）、RM200（Borgwaldt）。3.3 實驗步驟3.3.1 實驗容器準備及預處理為減少鈉離子含量，容量瓶、移液器具等均盡量使用塑料容器；捕集阱、萃取瓶可用10 mM鹽酸溶液潤洗一遍并用純水沖凈，干燥后備用。3.3.2 樣品制備直線型吸煙機上每孔道抽吸4支卷煙，在捕集阱內(nèi)加入20 mL 10 mM鹽酸，轉(zhuǎn)盤式吸煙機上每輪抽吸20支卷煙，捕集阱內(nèi)加入50 mL 10 mM鹽酸，按照GB/T19609規(guī)定要求進行抽吸。直線型吸煙機抽吸完后，將44 mm濾片放入100 mL萃取瓶中，使用四分之一濾片（44 mm）擦拭捕集器，一起置于萃取瓶中，加入20 mL 10

7、mM鹽酸。轉(zhuǎn)盤式吸煙機抽吸完后，將92 mm濾片放入250 mL萃取瓶中，用四分之一濾片（44 mm）擦拭捕集器，一起置于萃取瓶中，加入50 mL 10mM鹽酸。振蕩萃取40 min，振蕩器頻率設(shè)為160 r/min。萃取完成后，從捕集阱和萃取瓶中各移取5 mL溶液置于容量瓶中，直線型吸煙機的樣品定容至25 mL，轉(zhuǎn)盤式吸煙機的樣品定容至50 mL，取定容液過0.45 m的濾膜，裝入色譜瓶待離子色譜分析。 空白樣品的制備：完全按照前述方法操作，抽吸時卷煙不點燃。3.3.3 離子色譜檢測條件流動相：A：50 mM甲烷磺酸 B：水流速：1.2 mL/min梯度條件： 時間（min）A （%） B（

8、%）0 32 686 32 686.1 50 5014.5 50 5014.6 32 6828 32 68色譜柱：CS12A（4250mm）進樣量：25 uL柱溫：30 自身再生抑制器電流：90 mA；3.3.4 結(jié)果的計算與表述3.3.4.1 標準工作曲線 以標準溶液的峰面積為縱坐標，銨離子濃度為橫坐標建立標準工作曲線。應增加標準曲線的配制方法？3.3.4.2 卷煙中氨含量的計算 卷煙主流煙氣中的氨含量按照下式計算得出： M = （C V a 17）/（n18） 式中：M卷煙中的氨含量，單位為微克每支（g/cig）； C樣品中離子色譜的測定濃度，單位為微克每毫升（g/mL）； V樣品定容體積

9、，單位為毫升（mL）；a換算系數(shù)，用轉(zhuǎn)盤式吸煙機時為10，直線型吸煙機為4；n抽吸卷煙煙支數(shù)量，單位為支；17氨的式量；18銨離子的式量。3.4 方法驗證3.4.1 定量范圍、精密度、檢出限系列標準溶液的濃度為：0.1 g/mL，0.3 g/mL，0.5 g/mL，0.7 g/mL，1.0 g/mL，工作曲線見圖1。 圖1 0.1-1 g/mL標準溶液工作曲線，r=0.9988 本方法采用峰面積對濃度進行線性擬合：y=kx+b，權(quán)重因子為1/x，得到的曲線r2 0.99，標樣點擬和的準確度在3%以內(nèi) %準確度=100（計算值-標準值）/ 標準值。表1列出了隨時間推移的五次實驗中標準曲線各濃度點

10、的準確度、標準曲線參數(shù)（r2，k，b）以及它們的平均值、變異系數(shù)數(shù)據(jù)。表1 五次標準曲線的數(shù)據(jù)實驗次數(shù)12345平均值變異系數(shù)%準確度0.1 g/mL-1.5-2.7-2.8-2-2.10.5 g/mL2.441.62.982.36-0.561 g/mL-1.73-2.06-2.2-2.64-0.59r0.99880.99900.99910.99860.99940.99900.03k0.25820.25560.25250.25490.25100.254441.11b0.00850.00730.00750.00840.00880.00818.14由數(shù)據(jù)可見，斜率的變異系數(shù)很小，截距的變異系數(shù)較大

11、。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，截距的變化對于采用該標準曲線系列定量的低濃度樣品的測定值影響較大。由于銨標準溶液的濃度會隨著放置時間延長而增大，而低濃度標準溶液濃度的變化對工作曲線截距的影響尤為明顯。為控制樣品測定值的穩(wěn)定性，每次實驗須重新配制標準系列，制定標準曲線。方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）：以0.1 g/mL濃度的標準溶液，重復進樣10次，計算測定值的標準偏差，以3倍標準偏差作為方法的氨含量檢出限、以10倍標準偏差作為方法的氨含量定量下限，數(shù)據(jù)見表2。表2 0.1 g/mL標樣進樣10次的分析數(shù)據(jù)進樣次數(shù)濃度（g/mL）1#0.10282#0.09903#0.09634#0.09865#0.1

12、1016#0.09917#0.09688#0.09829#0.107310#0.0993平均值0.10075標準偏差0.004582檢出限和定量限的計算：LOD=30.004582=0.013746 g/mL= 14 ng/mL =0.33 g/cigLOQ=100.006116=0.045819 g/mL= 46 ng/mL=1.09 g/cig本檢測方法銨離子的檢出限為0.33 g/cig，定量限為1.09 g/cig，完全能滿足卷煙主流煙氣中氨釋放量的檢測要求。3.4.2 實驗方法的精密度、回收率實驗方法的日內(nèi)重復性和日間重復性用同一種卷煙按操作流程，每日測試5輪、分3日測得的數(shù)據(jù)求日內(nèi)

13、、日間標準偏差、平均值、變異系數(shù)等來表征，實驗數(shù)據(jù)見表3。表3 實驗方法的精密度樣品編號第一天第二天第三天g/cig111.9211.3611.03211.2110.8511.66311.2611.0811.83411.3811.6511.39511.6511.5811.93平均值11.4811.3011.57標準偏差0.2970.3370.364%相對標準偏差2.592.983.14總平均值11.45 g/ cig日間標準偏差 0.330%日間相對標準偏差2.88本實驗方法的日內(nèi)重復性的%rsd3.5%，日間重復性的%rsd3%，具有良好的精密度。方法的回收率實驗采用基質(zhì)加標法，將標樣加在萃

14、取液中：分別以10 mM HCl（未加標）作為空白萃取液、以0.1g/mL NH4+-10mM HCl、0.5g/mL NH4+-10mM HCl和1g/mL NH4+-10mM HCl溶液作為加標萃取液，按實驗方法操作，測得空白、低、中、高四個水平下的銨含量值。每個水平下平行測定三個樣品，取平均值進行加標回收率的計算。測試結(jié)果見表4?；厥章实挠嬎愎饺缦拢?回收率=100(加標測定平均值-未加標測定平均值)/加標量表4 加標回收率實驗次數(shù)未加標0.1 g/mL0.5 g/mL1 g/mL g/cig 1#7.85 10.21 13.95 32.82 2#7.67 10.39 14.83 32

15、.43 3#7.569.82 15.16 32.95 平均值7.6910.14 14.654.2798.2632.73 %相對標準偏差 1.902.87 0.83 %回收率103.67106.04數(shù)據(jù)顯示，本實驗方法的回收率良好。3.4.3 方法空白測定 按3.3.2所述制得空白樣品，平行測定三次，銨離子測定結(jié)果低于檢出限。3.5 方法優(yōu)化3.5.1 煙氣捕集效率主流煙氣中氨的捕集效率驗證方法為串聯(lián)3個捕集瓶，每瓶中加入20 mL的10 mM鹽酸，抽吸結(jié)束后，分別取三個捕集瓶中溶液用離子色譜測定銨含量，由于分布在氣相中的氨比例很低，用低濃度的MSA作流動相檢測銨離子，提高分離度，色譜分離圖見圖

16、3。平行測定了三個樣品，均只在第一瓶中測出銨，數(shù)據(jù)如表5所示。表5 捕集瓶中氨含量樣品編號#1#2#3 g/cig瓶 10.3770.3760.314瓶 2n.d.n.d.n.d.瓶 3n.d.n.d.n.d.圖2 1號樣品的三個捕集瓶中銨離子色譜圖樣品1：1/1表示第一瓶捕集液，1/2表示第二瓶捕集液，1/3為第三瓶。該實驗結(jié)果表明：在系統(tǒng)中串接1個捕集瓶已能夠完全捕集煙氣氣相中的氨。3.5.2 不同鹽酸濃度對氨萃取效率的影響分別用1 mM，5 mM，10 mM，15 mM，20 mM濃度的鹽酸溶液進行實驗，考察其對氨萃取效率的影響，其它條件不變，實驗結(jié)果如圖4所示。圖3 不同濃度鹽酸對氨萃

17、取效率的影響由圖可見，10 mM、15 mM、20 mM鹽酸濃度對氨的萃取無明顯影響（標準偏差=0.276，%變異系數(shù)=3.73%），但高于1 mM和5 mM鹽酸的萃取結(jié)果，故本方法采用10 mM鹽酸作為萃取液。3.5.3 不同種類的酸對萃取效率的影響本實驗用2R4F卷煙，選擇10mN H+濃度和100mN H+濃度的鹽酸和硫酸做吸收液和萃取液，進行交叉驗證，既檢驗不同濃度酸也檢驗不同種類的酸對測定值的影響，結(jié)果見圖4。 圖4 不同濃度的鹽酸、硫酸對萃取效率的影響由圖示數(shù)據(jù)可以看出，不同種類、不同濃度的酸，其萃取結(jié)果并沒有顯著性差異（RSD=6%），其中，10mM的HCl萃取的測定值最接近于國

18、際共同實驗所給出的2R4F參考值（11.02 g/cig），故本方法確定采用10mM的HCl作為萃取溶液。3.5.4不同萃取時間對氨萃取效率的影響參考文獻7,8中指出，氨的含量會隨著萃取時間增大而升高。項目組分別考察了10 min，20 min，40 min，1 h，2 h振蕩萃取時間下，氨濃度的變化情況，結(jié)果見圖5。圖5 不同萃取時間對氨含量的影響由圖可見，氨含量會隨著震蕩時間延長而增大，在20分鐘以后變化趨于平緩。參考加拿大、雷諾、UK等方法文件5,6,10,11，本方法選擇40 min為萃取時間。四 再現(xiàn)性實驗再現(xiàn)性比對實驗共進行了兩輪，分別進行討論。4.1 第一輪比對試驗選用4種市售卷

19、煙，涵蓋了混合型、烤煙型和不同焦油含量，樣品信息列于表6。另外，為考察方法準確性，采用兩種參考卷煙（2R4F、1R5F）作為與國際共同實驗給出的文獻參考值比對。 表6 比對實驗樣品信息卷煙序號1#2#3#4#卷煙類型混合型烤煙型烤煙型混合型焦油量(mg)121083比對實驗共使用五種機型吸煙機：RM20H，RM200、SM400、SM450、KC-5。市售卷煙的測定結(jié)果分別取自行業(yè)內(nèi)6家實驗室所測得的7套實驗數(shù)據(jù)，結(jié)果見表7，結(jié)果的統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表8。參比卷煙測試結(jié)果見表9。表7 比對實驗數(shù)據(jù)（單位：g/cig）卷煙序號 1 2 3 4 5 6 7 1#13.0912.4911.69 13.78

20、13.08 12.21 12.58 2#7.548.247.02 8.427.106.10 7.45 3#6.656.625.15 6.545.855.23 5.984#3.293.963.05 3.07 3.413.22 3.49表8 比對實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計卷煙序號 平均值（g/cig） 標準偏差R1#12.700.682#7.410.783#6.000.644#3.360.31 表9 參比卷煙測試結(jié)果（單位：g/cig）測定次數(shù)1R5F2R4F1#3.45樣品未到貨2# 3.6710.803#3.2710.20%相對標準偏差5.784.04檢測平均值3.4610.50文獻報道值3.1011.02

21、從表中數(shù)據(jù)可以看出，4種卷煙樣品在不同實驗室中測試結(jié)果相對比較穩(wěn)定（%rsd11%）。參比卷煙2R4F和1R5F的測定值非常穩(wěn)定（%rsd6%），且與文獻報道值吻合。4.2 全國比對實驗第二輪比對實驗數(shù)據(jù)取自由鄭州煙草研究院牽頭組織的七種煙氣化學成分全國共同實驗。由24家行業(yè)內(nèi)比對實驗室在同一時間段內(nèi)各自分別完成，實驗室編號從1至24號。卷煙樣品共四種，涵蓋了不同焦油量的烤煙型和混合型卷煙。每家實驗室還分別進行了5輪重復性試驗。共有20家實驗室呈報了實驗結(jié)果。原始數(shù)據(jù)先經(jīng)柯克倫檢驗和格拉布斯檢驗，區(qū)分和剔除異常數(shù)據(jù)，再進行統(tǒng)計分析，計算均值、重復性標準偏差（同一實驗室內(nèi)檢測值的標準偏差）和再現(xiàn)

22、性標準偏差（不同實驗室檢測值的標準偏差）。本實驗中，方差的柯克倫檢驗用于檢驗實驗室內(nèi)的變異，格拉布斯檢驗則用在檢驗實驗室間的變異，統(tǒng)計時剔除兩種檢驗的異常值，求平均值，重復性標準偏差（r）和再現(xiàn)性標準偏差（R）。樣品信息和分析統(tǒng)計結(jié)果分別見表10、表11，原始數(shù)據(jù)見附件1。表10 樣品信息樣品編號樣品類型焦油量（mg）A烤煙型12B混合型8C烤煙型13D烤煙型8表11 全國實驗室樣品測定結(jié)果經(jīng)柯克倫和格拉布斯檢驗，樣品A測定結(jié)果發(fā)生偏離的實驗室有兩家，樣品B、C、D則各有三家，且問題數(shù)據(jù)相對比較集中地出現(xiàn)在個別實驗室，其余各家的數(shù)據(jù)一致性良好。表11所列的統(tǒng)計數(shù)據(jù)為剔除這些異常值后的結(jié)果，表明

23、方法穩(wěn)定可靠。五 結(jié)論項目組研究并論證了主流煙氣中氨的捕集方法，捕集效率，捕集及萃取液種類、濃度，振蕩萃取時間，考察了樣品前處理方法，優(yōu)化并選擇了離子色譜分析條件及標準曲線制定方法。并對方法的重復性和再現(xiàn)性進行了充分的論證。本方法業(yè)已經(jīng)過行業(yè)內(nèi)多家實驗室，在不同類型、型號的吸煙機及離子色譜上加以應用。因而，采用離子色譜法測定卷煙主流煙氣中的氨，方法快速、準確，可操作性良好，數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠。 卷煙 主流煙氣中氨的測定 離子色譜法 項目組2010年6月 參考文獻：1 E.W.Willems, B.Rambali, 2006. Significance of ammonium compounds on

24、 nicotine exposure to cigarette smokers. Food and Chemical Toxicology 44, 678-688.2 Bradley J.Ingebrethsen, 2001. Particle-gas equilibria of ammonia and nicotine in mainstream cigarette smoke. Aerosol Science and Technology 35, 874-886.3 Charlene H. Callicutt, Richard H. Cox, 2006. The role of ammonia in the transfer of nicotine from tobacco to mainstream smoke. Regulatory Toxicology and Pharmacology 46, 1-17.4 蔡繼