IRF9下調(diào)SIRT1在急性胰腺炎發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究

1、IRF9下調(diào)SIRT1在急性胰腺炎發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究1. 引言急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是由胰腺的急性炎癥所引發(fā)的一種疾病。該病在臨床上常見，國內(nèi)外均報道具有很高的發(fā)病率和死亡率，發(fā)病過程中涉及多器官功能紊亂及細(xì)胞因子釋放增加1,2。近年來AP的發(fā)病率呈升高趨勢3，約20%30%的AP患者可發(fā)展為SAP。該病死亡率高達(dá)15%30%，導(dǎo)致局部及全身并發(fā)癥，且預(yù)后不良，嚴(yán)重威脅到人類生命健康4,5。AP6的起源被認(rèn)為是胰腺腺泡細(xì)胞，發(fā)病原因是過度激活的胞內(nèi)胰蛋白酶原轉(zhuǎn)化為胰蛋白酶消化胰腺組織，胰腺水腫或壞死而致胰腺炎。1896年，Chiari7發(fā)現(xiàn)十二指腸中的

2、胰蛋白酶可活化為胰蛋白酶而激活其他酶，以此提出酶過早激活消化胰腺的概念。敲除胰蛋白酶原7基因的小鼠被用來研究蛋白酶原的作用，該類小鼠早期腺泡內(nèi)胰蛋白酶原的激活功能病理學(xué)缺失。該類小鼠對于研究胰蛋白酶原的激活可影響胰腺損傷過程。該小鼠與雨蛙素AP小鼠相比8，細(xì)胞死亡數(shù)明顯降低、腺泡壞死率降低50%。腺泡細(xì)胞的死亡與腺泡內(nèi)胰蛋白酶原的活化有不可分割的作用，但該實驗卻缺乏腺病毒介導(dǎo)的活化胰蛋白酶在腺泡內(nèi)表達(dá)引發(fā)小鼠的胰腺炎的機(jī)制說明。還有實驗研究9顯示，腺泡細(xì)胞的死亡，與腺病毒介導(dǎo)的活化胰蛋白酶原的表達(dá)具有重要聯(lián)系，但其中的機(jī)制模糊不清。IRF(interferon regulatory facto

3、r)對病毒誘導(dǎo)的IFN-和IFN-基因表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。后來發(fā)現(xiàn)IRF還能調(diào)控II型和III型干擾素基因的表達(dá)。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了9種IRF：IRF1910。在過去數(shù)十年里，有足夠多的的實驗證明10,11,12,13顯示IRF對轉(zhuǎn)錄調(diào)控、免疫調(diào)控、細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、自穩(wěn)平衡等多方面發(fā)揮著不可替代的作用。IRF參與多種疾病的發(fā)生過程，包括炎癥性腸病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥癥以及腫瘤發(fā)生及心血管疾病等10,11,14,15,16。IRF9是干擾素刺激基因因子3的組成部分，參與啟動多個干擾素刺激基因，產(chǎn)生抗病毒應(yīng)答作用。它在治療疾病、病原體分離中具有十分重要的作用，但目前對于其功能機(jī)

4、制研究，僅局限于STAT1和STAT2。對于其對轉(zhuǎn)錄、翻譯的調(diào)控機(jī)制以及促進(jìn)和減少炎癥功能可作為未來研究方向。此外亦有研究證明17，c-Myc原癌基因上調(diào)了IRF9的表達(dá)，表明在腫瘤發(fā)生中有IRF9的參與作用。IRF9可在胰島素分泌以及損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用，但是其在AP的發(fā)揮的作用和機(jī)制暫未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。SIRT1是sirtuin家族蛋白之一，是依賴于NAD+的HDAC，主要位于細(xì)胞核內(nèi)。近期有文獻(xiàn)報道在急性胰腺炎小鼠模型中，SIRT1的表達(dá)顯著下調(diào)，乙?；富钚韵陆担琾53及NF-B的?；皆黾?。SIRT1的敲低誘導(dǎo)了炎癥反應(yīng)及細(xì)胞死亡，加重胰腺炎病程18。近年來有文獻(xiàn)報道IRF9能夠

5、直接下調(diào)組蛋白去乙酰化酶SIRT1的表達(dá)，抑制SIRT1的去乙酰化酶活性，增加下游靶蛋白，例如p53，NF-B等蛋白的乙?；剑瑥亩鴧⑴c炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、增殖以及遷移等過程19,20,21,22,23,24,25。例如，在AML患者中，IRF9表達(dá)下調(diào)，SIRT1表達(dá)上調(diào)，p53乙?；较陆登蚁掠伟谢虻谋磉_(dá)下調(diào)；敲低IRF9能夠上調(diào)SIRT1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞克隆、增殖形成；過表達(dá)IRF9則有著相反的結(jié)果。IRF9是SIRT1的一個負(fù)調(diào)節(jié)因子，能夠靶向下調(diào)SIRT1的表達(dá)，增加p53的乙?；剑龠M(jìn)p53靶基因的表達(dá)，阻制細(xì)胞生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻止AML的進(jìn)一步發(fā)展25。因此IRF9

6、靶向下調(diào)SIRT1參與了細(xì)胞死亡、繁殖、遷移以及炎癥反應(yīng)等過程，調(diào)節(jié)著多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。在急性胰腺炎中，IRF9是否通過下調(diào)SIRT1的表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增殖和遷移等過程，進(jìn)一步影響細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)，國內(nèi)外未見相關(guān)報道。本實驗內(nèi)容在于探究IRF9基因在AP中所起的效用，研究可能存在的分子機(jī)制。故本實驗將大鼠AR42J胰腺腺泡細(xì)胞系作為研究對象,選用雨蛙素誘導(dǎo)AR42J胰腺腺泡細(xì)胞，結(jié)合qRT-PCR、Western Blot、流式細(xì)胞術(shù)、MTT法、Transwell等手段，敲低IRF9后檢測SIRT1、p53及乙?；疨53水平，檢測細(xì)胞凋亡、增殖及遷移等情況，進(jìn)一步探討IRF9靶向下調(diào)S

7、IRT1在AP的發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制，通過對靶基因功能的理解,對疾病診斷和治療提供理論指導(dǎo)。2. 材料與方法2.1. 材料2.1.1.主要儀器與試劑主要儀器及試劑生產(chǎn)公司AR42J大鼠胰腺腺泡細(xì)胞系上海富衡細(xì)胞庫IRF9抗體proteintechSIRT1抗體 AbcamP53抗體、Ace-P53prproteintechRIPA裂解液谷歌生物山羊抗小鼠及山羊抗兔Ig G谷歌生物一抗、一抗稀釋液谷歌生物胰酶谷歌生物PCR試劑盒寶日醫(yī)生物si-RNA（IRF9沉默）上海生工PVDF膜MilliporeTRIzolAmbion逆轉(zhuǎn)錄試劑盒寶日醫(yī)生物雨蛙肽北京索萊寶BCA蛋白濃度測定試劑盒碧云天SD

8、S-PAGE凝膠配置試劑盒碧云天蛋白上樣緩沖液碧云天培養(yǎng)基HyCloneOpti-MEM(x1）、Lipofectamine 2000Life TechnologyELISA試劑盒武漢基因美生物DMSO、MTT檢測試劑盒塞維爾流式細(xì)胞凋亡試劑盒試劑盒上海七海復(fù)泰生物上海七海復(fù)泰生物離心機(jī)、移液器EppendorfCytoFLEX流式細(xì)胞儀BECKMAN 恒溫培養(yǎng)箱SHELLAB顯微鏡上海精密科學(xué)儀器公司酶標(biāo)儀上海儀器公司恒溫金屬浴天力醫(yī)療器械PCR擴(kuò)增儀ABIWestern Blot電泳儀上海天能2.2. 方法2.2.1. 細(xì)胞培養(yǎng):培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基100：胎牛血清10：青鏈霉素1），培

9、養(yǎng)箱環(huán)境為37、5%CO2，2天更換培養(yǎng)基一次。1） 驗收：在超凈臺中嚴(yán)格無菌操作，靜置2h，而后鏡下觀察，以80%匯合度為界限，未達(dá)到80%需要去除舊培養(yǎng)基添加新鮮培養(yǎng)基再次培養(yǎng)。2） 復(fù)蘇：取出凍存的細(xì)胞，迅速于37水浴鍋中搖晃解凍，超凈臺中移入離心管并加入5ml培養(yǎng)基，以1000r/min離心5min，于超凈臺中倒出上清液，而后添加6ml新培養(yǎng)基，輕輕吹打制造細(xì)胞懸液，而后移入培養(yǎng)瓶，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，視細(xì)胞狀態(tài)，考慮傳代。3）傳代：按如下步驟進(jìn)行傳代：4）凍存：收集狀態(tài)良好的細(xì)胞（細(xì)胞匯合度達(dá)到80%），離心除去舊培養(yǎng)基，用含10%DMSO的血清使細(xì)胞重懸，同時轉(zhuǎn)存凍存管中病加入

10、細(xì)胞凍存液（含異丙醇），在-80穩(wěn)定凍存，或移入液氮罐凍存。2.2.2.細(xì)胞模型的構(gòu)建及效果評價:細(xì)胞模型構(gòu)建：取對數(shù)生長期的AR42J細(xì)胞接種于6孔板中，待其細(xì)胞密度達(dá)到60%-80%時，分為空白對照組和實驗組，每組設(shè)置3個復(fù)孔，空白對照組加入正常培養(yǎng)基，實驗組加入含100nmol/L雨蛙素培養(yǎng)基,分別培養(yǎng)0、2、6、12、24、48小時。模型效果評價：分別提取不同時間段后的蛋白,用Western Blot法檢測各組TNF-蛋白的表達(dá)。另收集不同時間段的細(xì)胞上清用ELISA法檢測炎癥因子水平。蛋白提取步棸及Western Blot法下文會詳細(xì)敘述，在此詳細(xì)介紹ELISA實驗方法。ELISA法

11、檢測AMY、TNF-、IL-1濃度：1） 準(zhǔn)備試劑以及微孔板；2） 使用1x洗液洗板，洗液在微孔板中持續(xù)浸泡30s；而后倒出洗液，而后立即使用微孔板；3） 標(biāo)準(zhǔn)品2倍稀釋，設(shè)置復(fù)孔空白孔并加入100l稀釋標(biāo)準(zhǔn)品；4） 使用移液槍將20l樣本加入樣本孔并加入80l 1x檢測緩沖液；5）抗體稀釋，每孔中加入50l稀釋抗體；6）封板振蕩（300 r/min），室溫孵育2h；7）倒出液體，再次洗板，重復(fù)6次；8）加入100l稀釋鏈霉親和素至每個孔；9）所有操作流程過后，封板震蕩，而后靜置45min；10) 再次洗板6次；11) 加入100l顯色底物，并避光，室溫下靜置30min；12) 加入100l終

12、止液，孔中顏色需由藍(lán)變黃。13）檢測OD值：30分鐘內(nèi)檢測450nm以及570nmOD值；校準(zhǔn)OD值=OD450-OD570。14）計算出數(shù)值。橫坐標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，縱坐標(biāo)：校準(zhǔn)OD值，使用EXCEL軟件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線以及計算回歸方程，而后將校準(zhǔn)OD值代入計算樣本濃度。2.2.3.IRF9-siRNA轉(zhuǎn)染AR42J細(xì)胞：沉默IRF9：使用Lipo2000 TM轉(zhuǎn)染IRF9沉默的si-RNA，空載作陰性對照。按如下步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染：1） 胰酶消化；2） 消化后將細(xì)胞均勻接種到6孔板中（密度一致）；3） 加入2ml不含雙抗的培養(yǎng)液到6孔板中；4） 待細(xì)胞貼壁后，棄培養(yǎng)液，PBS洗2次；5） 避光向6孔板中

13、加入1500ul Opti-MEM(x1）；6） 設(shè)置分組，分為六組，上面3個孔分別為不用雨蛙素誘導(dǎo)的：正常的胰腺AR42J細(xì)胞為空白對照組,N-siRNA轉(zhuǎn)染的胰腺AR42J細(xì)胞為陰性對照組，siIRF9轉(zhuǎn)染的胰腺AR42J細(xì)胞為實驗組，下面3個孔分別為雨蛙素誘導(dǎo)的：急性胰腺AR42J細(xì)胞，N-siRNA轉(zhuǎn)染的胰腺AR42J細(xì)胞為陰性對照組，siIRF9轉(zhuǎn)染的胰腺AR42J細(xì)胞為實驗組。7） 分別將每組孔的藥加好：取6個無酶EP管，先加無雨蛙素誘導(dǎo)組的3個孔：空白對照組：每孔加入250l Opti-MEM，其中一管中加5l Lipofectamine2000，另一管不加。陰性實驗組：一管加5

14、l liop2000，另一管加5l N-siRNA 。陽性實驗組：其中一管加5l Lipofectamine2000，另一管加5l siIRF9充分混勻。有雨蛙素誘導(dǎo)組的3個孔：空白對照組、陰性實驗組和陽性實驗組三個孔加藥方法同無雨蛙素誘導(dǎo)的三個孔加藥方法一致；8） 加藥后避光靜置5min，藥物混勻再避光靜置20min；9） 分別將這6組藥加入分組為無雨蛙素誘導(dǎo)和有雨蛙素誘導(dǎo)的空白組、陰性實驗組以及陽性實驗組的板孔中；10） 加藥結(jié)束后，放入37，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h，11） 培養(yǎng)結(jié)束后使用PBS洗2次，再換上2ml細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清用于AR42J細(xì)胞)，培養(yǎng)24h

15、。此種siIRF9轉(zhuǎn)染AR42J細(xì)胞實驗重復(fù)無三次。注意事項：1）適當(dāng)進(jìn)行細(xì)胞傳代，以提高轉(zhuǎn)染效率、穩(wěn)定性并減少毒性，所有細(xì)胞傳代次數(shù)需要一致；2）為防止局部復(fù)合物濃度過高乃至高細(xì)胞毒性，不可使用其他試劑稀釋核酸或轉(zhuǎn)染試劑，直接將核酸及轉(zhuǎn)染試劑混勻。復(fù)合物以及培養(yǎng)基混勻后，靜置六孔板；3）使用無雙抗的opti培養(yǎng)基混合復(fù)合物，37恒溫培養(yǎng)6h拍照，而后更換普通培養(yǎng)基。若首次轉(zhuǎn)染效率不佳，可在轉(zhuǎn)染24h后再次添加復(fù)合物轉(zhuǎn)染，提升轉(zhuǎn)染率。2.2.4.qRT-PCR檢測IRF9-siRNA對胰腺AR42J細(xì)胞中IRF9mRNA、SIRT1mRNA相對表達(dá)量的影響：細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染24h后，進(jìn)一步提取RN

16、A,檢測IRF9mRNA、SIRT1mRNA的表達(dá)。步棸如下：提取總RNA：1） 超凈臺操作，使用移液器吸出六孔板中培養(yǎng)基，1ml PBS沖洗2次，而后吸凈殘留，加入1ml TRIzol試劑，置于搖床上慢搖10min，需低溫放置，促使其充分裂解。2） 使用移液槍將六孔板中混合試劑轉(zhuǎn)移至1.5ml 無酶EP管中，再加入TRIzol試劑體積的五分之一即200l氯仿，加入完成后，上下?lián)u晃15次，使其充分混勻。而后置于冰上靜置5min，待分層完全后放置于離心機(jī)（4，13200r/min）離心15min。3） 使用移液槍小心轉(zhuǎn)移200l上層水相至另一個1.5ml 無酶EP管中，同時加入等體積異丙醇，15

17、次上下振蕩，充分混勻后于-20冰箱中靜置30min，然后取出，于低溫離心機(jī)（4，13200r/min）離心15min。4） 棄上清，使用提前配好的75%乙醇1ml將所得RNA沉淀物洗滌，于低溫離心機(jī)（4，13200r/min）離心5min，而后棄上清，并將吸水濾紙剪成長條狀，伸入EP管中吸出可見的液體。5） 將EP管靜置30min，需倒置放于吸水濾紙上，干燥至一定程度（切忌不能完全干燥）后將20l DEPC水加入其中，充分振蕩混勻，保存于-80冰箱，處理后的樣本可于-80冰箱中長期保存。逆轉(zhuǎn)錄步驟：1） 從-80冰箱取出已經(jīng)經(jīng)過處理的樣本總RNA，使用定量PCR檢測儀對總RNA實施定量檢測。2

18、） 取200l無酶EP管一只，依靠定量檢測而后計算RNA溶液所需量，同時加DEPC水，總?cè)萘啃柚?l，而后將2ul Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中的Mix試劑加入其中，總體系容量需要達(dá)到10l，而后將100ul DEPC水加入其中，并將混合物充分振蕩混勻。3） 將混合所有試劑的EP管放置于逆轉(zhuǎn)錄使用儀器中，啟動逆轉(zhuǎn)錄程序，逆轉(zhuǎn)錄程序條件如下：37預(yù)熱16min，90解鏈5秒鐘，5退火12min。所有逆轉(zhuǎn)錄程序結(jié)束后，將逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA放置于-80冰箱中保存。qRT-PCR步驟：1） 引物配制：實驗中所需要使用到的引物其序列如下圖所示。將裝有引物粉末的EP管放置于離心機(jī)（3000r/min）離心1

19、min，盡量使其不沾壁，而后取出后輕輕開啟EP管管蓋，根據(jù)引物說明書，將適量DEPC水加入到EP管中進(jìn)行稀釋，而后蓋上瓶蓋，放置于振蕩儀上振蕩，使其充分混勻。再另取一200l無酶EP管，將190ul DEPC水加入其中，并使用移液槍吸取出5l正義引物及5l反義引物加到無酶EP管中，標(biāo)記并且放置在振蕩儀上，充分混勻后將其置于-20冰箱中保存。mRNA引物序列IRF9正義引物：CTGCTCACCTTCATCTACAACG反義引物：ACTAGGATGCCCCTCTCAAGAPDH正義引物：TTGGTATCGTGGAAGGACTCA反義引物：TGTCATATTTGGCAGGTTT2） 取出逆轉(zhuǎn)錄后得到

20、的合格的cDNA樣品，在超凈臺中嚴(yán)格無菌操作，取無酶100l八聯(lián)排管，按表中反應(yīng)體系制作反應(yīng)試劑，而后將準(zhǔn)備好的10l體系全部置于八聯(lián)排管中，使用迷你離心機(jī)使其振蕩充分混勻，而后將把臉排管置于熒光定量PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)設(shè)置的條件為：95 加熱10min，95變性 15s，60 退火30s，此程序循環(huán)次數(shù)為45次。反應(yīng)體系如下：體系體積2 x SYBR Green mixture5.2lcDNA1.6l引物3.2lTotal10l3） 整個PCR反應(yīng)流程約需要2小時，待反應(yīng)結(jié)束后，可依靠儀器獲取目的基因的CT值，使用2-Ct法可計算出目的基因相對表達(dá)值，計算出表達(dá)值后，使用電腦軟件繪

21、制柱狀圖。注意事項：1） 避免反復(fù)凍融所提取的RNA、cDNA以及逆轉(zhuǎn)錄試劑，可避免RNA的降解以及降低酶的活性。2） 使用前將逆轉(zhuǎn)錄試劑及相關(guān)PCR反應(yīng)試劑上下顛倒以充分混勻其中各種試劑成分，可避免反應(yīng)體系的總體積與實際不符，確保定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，使用過程中吹打力度需要輕緩，若試劑產(chǎn)生泡沫，需要再次放于離心機(jī)中離心至無泡才可使用試劑。3）PCR試劑盒中含有熒光染料SYBR Green I，此物質(zhì)遇光易揮發(fā)，故配制混合體系時應(yīng)避光操作。4）空氣中微量DNA氣溶膠可能會導(dǎo)致靈敏度高的實驗試劑受到污染，從而導(dǎo)致實驗結(jié)果出現(xiàn)偏差甚至錯誤，為避免這種實驗試劑受到污染，應(yīng)在超凈臺中配制相應(yīng)反應(yīng)體系

22、，嚴(yán)格按照無菌操作流程操作。另外，使用的相關(guān)器材需要保證無菌無霉。2.2.5.Western Blot法檢測IRF9-siRNA對胰腺AR42J細(xì)胞中IRF9、SIRT1、P53、乙?；疨53蛋白表達(dá)的影響：Western Blot法分別檢測無雨蛙素誘導(dǎo)的和有雨蛙素誘導(dǎo)的空白對照組、N-siRNA組、siIRF9轉(zhuǎn)染24h后的胰腺AR42J細(xì)胞中的IRF9、SIRT1、P53、乙?；疨53蛋白的表達(dá)情況。細(xì)胞蛋白提?。簩⒁认貯R42J細(xì)胞消化后，以相同的數(shù)量接種到6孔板中，待細(xì)胞貼壁，棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，加入培養(yǎng)基至空白對照組(DMEM配的培養(yǎng)基用于AR42J細(xì)胞)，陰性實驗組加入N-si

23、RNA，陽性實驗組加入沉默siIRF9處理4h-6h后用PBS洗2次，再換上細(xì)胞培養(yǎng)基：(DMEM+10%胎牛血清用于AR42J細(xì)胞)，每孔加2ml，培養(yǎng)24h。PBS清洗細(xì)胞，在培養(yǎng)板中加入蛋白裂解液裂解細(xì)胞，上離心機(jī)進(jìn)行離心13200r/min，4,20min，上清液就是所要的蛋白液；提取的蛋白液要用BCA試劑盒檢測蛋白濃度后再分裝保存。根據(jù)測定的不同的蛋白濃度，加入5load-ingbuffer(比例為41)和相應(yīng)體積的總蛋白樣品，混勻，蛋白液要在干浴鍋中煮10010min，變性后才能用，煮好的蛋白樣本放在20冰箱中保存。細(xì)胞蛋白Western Blot方法：1）SDS-PAGE電泳 將

24、已經(jīng)過處理且變性的蛋白樣品使用移液器轉(zhuǎn)移至含有濃縮膠的孔中，而后將5l marker添加至另一個樣品加樣孔中。接通電泳儀電源，第一階段電泳：將電泳儀電壓設(shè)置為80V恒定電壓，電泳時間設(shè)置為30分鐘；第二階段：第一階段結(jié)束后，將電泳儀電壓調(diào)整為120V恒定電壓，持續(xù)電泳90分鐘。第二階段電泳持續(xù)到marker提示目的蛋白已于凝膠上分離，然后停止電泳。2）轉(zhuǎn)膜 電泳結(jié)束后，自電泳儀中小心取出凝膠，使用超純水將凝膠表面電泳液清洗干凈，注意保持凝膠完成性；事先需要準(zhǔn)備好容器，并向容器中添加足量的轉(zhuǎn)膜液，而后將凝膠以及轉(zhuǎn)膜夾放入容器中浸泡；使用直尺及其他切膠器具將目的蛋白以及marker的凝膠切下，使用

25、直尺測量其大小，而后裁剪大小相當(dāng)?shù)腜VDF膜覆蓋在膠條上（注意：PVDF膜在使用之前需要使用甲醇溶液浸泡30s激活），而后依次將凝膠和PVDF膜放在正負(fù)極明顯的轉(zhuǎn)膜夾中，轉(zhuǎn)膜夾需要設(shè)置6層，從陰極側(cè)到陽極側(cè)分別為海綿墊片、濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙、海綿墊片（注意每一步都需要去除氣泡），放置好后將轉(zhuǎn)膜夾扣緊并轉(zhuǎn)入有足量轉(zhuǎn)膜液的電泳槽中，轉(zhuǎn)膜過程應(yīng)保持低溫，故應(yīng)在電泳槽周圍放入足量的冰渣，維持轉(zhuǎn)膜過程中的低溫環(huán)境，而后接通電源并將電流設(shè)置為200mA恒流，轉(zhuǎn)膜時間設(shè)置為120min。3）封閉 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，回收轉(zhuǎn)膜液，小心將轉(zhuǎn)膜夾取出，而后細(xì)心取出PVDF膜，放置于容器中（注意，條帶擺放不宜過于

26、集中，最好一格一個條帶），使用1 x TBST溶液將轉(zhuǎn)膜液洗4次，洗滌過程中將容器放于搖床上，每次震蕩5分鐘。而后使用TBST溶液與脫脂奶粉混合（脫脂奶粉5g，TBST溶液100ml），兩者混合后，使用震蕩儀使其充分混勻，然后將處理干凈的PVDF膜放置于混合物中開始封閉，室溫?fù)u晃封閉1.5h。4）抗體孵育：一抗孵育：封閉結(jié)束后，小心將PVDF膜取出，用1 x TBST溶液將轉(zhuǎn)膜液洗4次，洗滌過程中將容器放于搖床上，每次震蕩5分鐘。洗滌結(jié)束后，將一抗IRF9、SIRT1、P53、乙?；疨53以及內(nèi)參抗體-actin分別足量添加到入目的條帶中，然后將其放置于搖床上，于4環(huán)境下震蕩孵育24h。二抗孵

27、育：一抗孵育結(jié)束后，小心取出PVDF膜，使用1 x TBST溶液將留滯在PVDF膜表面的一抗洗去，洗4次，洗滌過程中將容器放于搖床上，每次震蕩5分鐘。洗滌結(jié)束后，將稀釋的二抗（使用TBST，稀釋比為1:5000）足量放入條帶中，然后在室溫下?lián)u晃震蕩60min。5）顯影 再次將條帶使用1 x TBST溶液洗滌4次，期間放在搖床上快搖，5min每次，將二抗溶液洗去。按照ECL發(fā)光試劑盒使用說明書制備顯影劑。而后取數(shù)個培養(yǎng)皿，將目的條帶逐個放入培養(yǎng)皿中，并向培養(yǎng)皿中的條帶滴加足量顯影劑（操作過程需要避光進(jìn)行），而后將滴加足量顯影劑的條帶放入自動凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行自動曝光，同時保留圖像，使用Imaje

28、-J處理拍攝的圖像，分析目的蛋白的灰度值。注意事項：1) 顯色液必須要新鮮配置使用。2) 配膠時注意操作，有致癌液體，避免濺在身上。2.2.6.流式細(xì)胞儀檢測IRF9-siRNA對胰腺AR42J細(xì)胞凋亡的影響：把胰腺AR42J細(xì)胞消化，按1106接種到6孔板中，待細(xì)胞貼壁，棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，分為雨蛙素誘導(dǎo)和無雨蛙素誘導(dǎo)的：空白對照組加入培養(yǎng)基，陰性實驗組加入N-siRNA，陽性實驗組加入沉默siIRF9,處理4h-6h后用PBS洗2次，再換上細(xì)胞培養(yǎng)基：(DMEM+10%胎牛血清用于AR42J細(xì)胞)，每孔加2ml，培養(yǎng)24h。用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，用15ml離心管收集，上離心機(jī)，

29、離心500g，5min，棄上清液，用1mlPBS輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)（細(xì)胞數(shù)量不少于105）然后500g離心5min，收集細(xì)胞。繼而加入400ulBinding Buffer重懸細(xì)胞，再加入5ulAnnexin V-FITC/PI，所有操作需要輕緩，室溫避光孵育染色15min。最后加入10ulPI染色，輕輕混勻冰浴避光5min。注意事項：1） 操作時注意避光，反應(yīng)完畢后盡快在1小時內(nèi)檢測。2） 檢測細(xì)胞數(shù)量需要達(dá)到1106個，但不宜過多。不足量細(xì)胞的樣本流動量大，檢測時會相應(yīng)增加變異系數(shù)，導(dǎo)致實驗結(jié)果出現(xiàn)偏差甚至錯誤。同時，細(xì)胞數(shù)量過多，會導(dǎo)致按量配制的抗體或其他試劑相對不足，影響實驗結(jié)果。3）

30、 在實驗過程中，在確保實驗科學(xué)性以及準(zhǔn)確性前提下，可適當(dāng)縮減實驗工序。2.2.7.MTT試驗取轉(zhuǎn)染成功后的AR42J細(xì)胞,細(xì)胞分組同上，每組處理設(shè)三個重復(fù)，將細(xì)胞在培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時用0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化，配置細(xì)胞懸液，分別加入96孔板中每孔加入100l 500個細(xì)胞，放入CO2（5%）培養(yǎng)箱中37C下培養(yǎng)以貼壁。按照實驗需要，進(jìn)行培養(yǎng)并給與10l雨蛙素誘導(dǎo)。待24小時后，每孔加入20l MTT工作液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4小時。四小時后待孔板底部出現(xiàn)少量紫色結(jié)晶并且40倍鏡下觀察細(xì)胞周圍也出現(xiàn)時，實驗課停止。而后吸取上清溶液（注意留存紫色結(jié)晶），待吸出干凈，加入

31、100l DMSO。 37孵育15min，待紫色結(jié)晶溶解完畢。在570nm測定吸光度。注意事項：1） 細(xì)胞的接種密度一定不能太大，一般每孔500-1000個左右就夠了，寧少勿多。尤其對于腫瘤細(xì)胞。10000/孔太多了，這樣即使藥物有作用，MTT方法也是表現(xiàn)不出的，最佳點板濃度在4000-5000/孔，太少的話SD值會很大。2） 注意細(xì)胞懸液一定要混勻，已避免細(xì)胞沉淀下來，導(dǎo)致每孔中的細(xì)胞數(shù)量不等，可以每接幾個就要再混勻一下。3） 加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。另外，吹散次數(shù)過多也會影響細(xì)胞活力，所以要熟練、快些上板。2.2.8.Transwell實驗取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，細(xì)胞分組同上（分為6組）

32、，實驗步棸如下：1）消化，而后終止消化并離心棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，無血清培養(yǎng)基（含BSA）重懸，細(xì)胞密度為3105。2）接種：a. 取200l細(xì)胞懸液到Transwell小室；b. 向24孔板下室加入600l的培養(yǎng)基（含15%FBS）；c. 培養(yǎng)24h。3）固定染色取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液。用PBS洗2遍，再用甲醛固定30分鐘。后清洗風(fēng)干，取800l結(jié)晶紫于孔中，將小室放在上面25分鐘。最后清洗顯微鏡下拍照。3） 計數(shù)：取若干個視野計數(shù)細(xì)胞個數(shù)，本實驗選取3個視野，都是隨機(jī)選取。注意事項：1）細(xì)胞重懸時，個人認(rèn)為不要超過5105，具體實驗室采用密度要自己摸索，因為不同細(xì)胞其

33、侵襲能力有別，細(xì)胞量過多過少都會導(dǎo)致難以計數(shù)；2）細(xì)胞數(shù)目差異會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響，故對細(xì)胞應(yīng)該同時計數(shù)；3）細(xì)胞一般常規(guī)培養(yǎng)12-48h，主要依據(jù)侵襲能力而定。本實驗采用的最佳培養(yǎng)時間為24h。4）固定染色擦洗應(yīng)擦凈膜表面上未遷移的細(xì)胞，但避免擦除膜底細(xì)胞，保證計數(shù)準(zhǔn)確。2.2.9.熒光素酶基因?qū)嶒? 于轉(zhuǎn)染前24h將細(xì)胞接種于12孔板中（1105/孔），每孔細(xì)胞匯合度應(yīng)達(dá)到60%，每組樣品3個重復(fù)。2 轉(zhuǎn)染前半小時將完全培養(yǎng)基換無血清培養(yǎng)基0.5ml。 3 A液，按照實驗需求進(jìn)行分組，各三個復(fù)孔，各加入50l 無血清培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫靜置5min。其中過表達(dá)質(zhì)粒1g，啟動子質(zhì)粒 1g，

34、 pRL-SV40質(zhì)粒0.2g4 B液：脂質(zhì)體使用前輕輕混勻，脂質(zhì)體4ul與50l無血清培養(yǎng)基混勻，室溫放置5min； 5 將A液、B液混合，然后放置在震蕩儀上震蕩，使其充分混勻，而后室溫放置15min。放置結(jié)束后，將混合液均勻滴加至12孔板中； 6 將12孔板放置于37恒溫箱中培養(yǎng)6h，然后用完全培養(yǎng)基替換無血清培養(yǎng)，再次放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 7 螢光素酶報告基因檢測：在轉(zhuǎn)染后48h后，裂解細(xì)胞，使用雙螢光素酶檢測試劑盒，在化學(xué)發(fā)光儀上進(jìn)行檢測。8 在以Renilla螢光素酶為內(nèi)參的情況下，用螢火蟲螢光素酶測定得到的LUC值除以Renilla螢光素酶測定得到的RLU值。根據(jù)得到比值來比較轉(zhuǎn)錄因

35、子對啟動子的活性。注意事項：1) 基因在檢測過程中易受到細(xì)胞及載體狀態(tài)、轉(zhuǎn)染及裂解效率、加樣精度等多重因素的影響，同批次樣品檢測值可因這些因素出現(xiàn)浮動。故實驗需要設(shè)置3個或3個以上復(fù)孔，同時使用其他基因作內(nèi)參。2) 培養(yǎng)細(xì)胞的時間宜在12-36小時之間，不宜過長，長時間細(xì)胞培養(yǎng)可能會導(dǎo)致細(xì)胞難以裂解。3) 選擇目標(biāo)基因a) 螢光蟲熒光素酶：選取pGL-3或pGL-4載體或自身構(gòu)建載體；b) 海腎熒光素酶：選取phRL-TK或pGL-4代載體或自身構(gòu)建載體。此外海腎載體不應(yīng)使用諸如V40、CMV等強(qiáng)啟動子，應(yīng)選用TK等中等強(qiáng)度的啟動子；4） 20-22為最佳的反應(yīng)溫度，實驗時細(xì)胞裂解產(chǎn)物、底物工

36、作液等試劑的添加等操作都宜在適宜溫度下操；5） 細(xì)胞裂解產(chǎn)物在常溫下保存不宜超過6h，-20環(huán)境下不宜超過30天，-80環(huán)境下不宜超過180天；6） 手動快速使裂解產(chǎn)物與底物混合，并且混合的時間需要一致，以免熒光素酶衰變影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性以及真實性；7）檢測結(jié)果：樣品檢測OD值實際上應(yīng)該比儀器背景值大得多，若樣品OD值與儀器背景值過于接近，表明熒光素酶在樣本中含量過少，可從轉(zhuǎn)染量、轉(zhuǎn)染效率、裂解效率等相關(guān)因素進(jìn)行考慮。2.3統(tǒng)計處理實驗檢測數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0軟件分析。計量資料以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(xs)顯示結(jié)果，使用獨立樣本t檢驗，檢驗標(biāo)準(zhǔn)為a=0.05。3. 結(jié)果3.1.細(xì)胞模型構(gòu)建成功：

37、ELISA測定結(jié)果表明,AMS的水平,IL-1和TNF-增加(圖1 a、1 b和c)。Western Blot實驗結(jié)果提示：不同時間段雨蛙素誘導(dǎo)胰腺AR42J細(xì)胞與空白對照組相比，誘導(dǎo)24小時后的AR42J細(xì)胞TNF-升高明顯(圖1 d)，各組間差異明顯，具有有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），這些結(jié)果表明，體外成功構(gòu)建了急性胰腺炎細(xì)胞模型。圖1各炎癥因子水平3.2.qRT-PCR檢測結(jié)果：qRT-PCR檢測結(jié)果顯示與空白對照組相比，雨蛙素誘導(dǎo)后IRF9的mRNA水平明顯升高、SIRT1的mRNA水平下降。siIRF9轉(zhuǎn)染后IRF9的mRNA表達(dá)水平與空白對照組相比降低，較雨蛙素誘導(dǎo)組也降低，SIRT

38、1的mRNA表達(dá)水平升高,各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。（P0.05）（圖2）。即siIRF9轉(zhuǎn)染后IRF9的mRNA表達(dá)水平較雨蛙素誘導(dǎo)后IRF9的mRNA表達(dá)能力降低，SIRT1的mRNA表達(dá)水平較誘導(dǎo)前升高。圖2 雨蛙素（100 nmol/L）誘導(dǎo)及IRF9基因沉默的AR42J細(xì)胞IRF9及SIRT1的mRNA表達(dá)的影響3.3.Western Blot結(jié)果：用N-siRNA轉(zhuǎn)染24h后的胰腺AR42J細(xì)胞內(nèi)的IRF9、SIRT1、P53、乙?；疨53蛋白的表達(dá)與空白對照組比較無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，用siIRF9轉(zhuǎn)染胰腺AR42J細(xì)胞后蛋白表達(dá)與空白對照組相比：IRF9蛋白表達(dá)降低，S

39、IRT1蛋白水平升高、乙?；痯53/p53的表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)（圖3）。圖3 Western blot 法檢測雨蛙素（100 nmol/L）誘導(dǎo)及IRF9沉默的AR42J細(xì)胞IRF9、SIRT1、P53及ace-P53蛋白的表達(dá)水平3.4.沉默的IRF9基因?qū)R42J細(xì)胞凋亡的影響:AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測的結(jié)果表明：無雨蛙素誘導(dǎo)的三組結(jié)果：空白組凋亡率是12.4730.353,N-siRNA實驗組凋亡率是8.8260.348,沉默IRF9實驗組凋亡率是7.4400.647。有雨蛙素誘導(dǎo)的三組結(jié)果：空白對照組凋亡率19.2571.668，N-si

40、RNA實驗組凋亡率是16.2282.471,沉默IRF9實驗組凋亡率是14.8173.069。與空白對照組和N-siRNA轉(zhuǎn)染24h后的胰腺AR42J細(xì)胞比較，siIRF9轉(zhuǎn)染24h后的胰腺AR42J細(xì)胞的凋亡率是明顯降低的（圖4）。圖4 雨蛙素（100 nmol/L）誘導(dǎo)及IRF9沉默后各組AR42J細(xì)胞凋亡率3.5.沉默的IRF9基因?qū)R42J細(xì)胞增殖的影響：MTT實驗結(jié)果顯示:N-siRNA組與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，siIRF9組的OD值較空白對照組及陰性對照組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）（圖5）,這說明siIRF9組細(xì)胞數(shù)明顯下降，細(xì)胞生長受到明顯抑制，siIRF

41、9組細(xì)胞自我復(fù)制能力下降。圖5 雨蛙素（100 nmol/L）誘導(dǎo)及IRF9沉默后各組AR42J細(xì)胞的吸光度3.6.IRF9基因沉默對AR42J細(xì)胞侵襲遷移的影響：采用transwell法檢測AR42J細(xì)胞的遷移。結(jié)果顯示，IRF9沉默組AR42J細(xì)胞活力明顯低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)(圖6)。與空白對照組和陰性對照組相比，IRF9沉默組的遷移明顯減少。陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。IRF9基因沉默抑制AR42J細(xì)胞的遷移。圖6雨蛙素（100 nmol/L）誘導(dǎo)及IRF9沉默后各組AR42J細(xì)胞的遷移率3.7.雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示：結(jié)果顯示IRF9抑

42、制了SIRT1的啟動子活性(圖7)。IRF9對SIRT1具有調(diào)控作用。圖7 IRF9-SIRT1表達(dá)4.討論AP的主要特征是胰腺局部炎癥或伴有全身多器官損傷，但其病理機(jī)制不明26。AP可分為MAP(輕度AP）以及SAP(重度AP)。其中SAP的病死率較高27,28，達(dá)到17%30%。目前SAP無特異性治療方法，需要依靠重癥監(jiān)護(hù)。為降低病死率以及增加治療效果，應(yīng)盡早對AP病情程度進(jìn)行預(yù)判。輕度AP為自限性疾病，但若治療不佳，會遷延不愈甚至成為SAP29。SAP伴有胰腺壞死及全身性炎癥反應(yīng)，甚至?xí)鹉摱景Y及器官功能障礙30。AP的發(fā)病機(jī)制研究是影響其防治方案以及致死率的一個重要影響因素31。為解

43、決這些問題，需要大力投入對AP發(fā)病機(jī)制研究。IRF同族首先被鑒定為I型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子干擾素系統(tǒng)。在哺乳動物中，這個家族由9名成員組成，從IRF1到IRF9。在過去幾十年來，越來越多的證據(jù)揭示了IRF家族在免疫反應(yīng)，病理過程等方面的功能，包括癌變和心血管疾病32。IRF家族的功能人類AML也有報道。IRF3在人類AML中有著主要影響通過靶向miR-15533。IRF9是IRF家庭成員的另一名成員。IRF9介導(dǎo)先天免疫通過激活干擾素介導(dǎo)的靶基因轉(zhuǎn)錄反應(yīng)34。此外，IRF9展出通過誘導(dǎo)針對干擾素誘導(dǎo)的p53依賴性細(xì)胞凋亡的抗增殖作用。IRF9還涉及抗腫瘤藥物耐藥性并促進(jìn)細(xì)胞生長19,35。IRF9參與

44、細(xì)胞增殖、腫瘤形成、炎癥以及自身免疫性疾病等病理過程36,37,38。有研究表明39，IRF9與STAT1可形成復(fù)合物，其復(fù)合物的促炎作用作用結(jié)腸炎。IRF9在人類AP中的機(jī)制意義仍然未知。本實驗采用體外培養(yǎng)大鼠急性胰腺炎細(xì)胞AR42J作為研究對象。通過siRNA干擾技術(shù)成功敲減了AR42J細(xì)胞的IRF9基因，通過qRT-PCR和Western Blot發(fā)現(xiàn)雨蛙素誘導(dǎo)后，IRF9基因的mRNA及蛋白水平升高，SIRT1基因的mRNA及蛋白水平均較雨蛙素誘導(dǎo)前降低；乙酰化p53/p53蛋白水平較雨蛙素誘導(dǎo)前明顯上調(diào)，說明發(fā)生急性胰腺炎時IRF9基因、乙?；痯53/p53的表達(dá)水平均上調(diào)，而SIR

45、T1基因的表達(dá)水平下調(diào)。流式細(xì)胞實驗、MTT實驗及Transwell實驗顯示：雨蛙素誘導(dǎo)后IRF9沉默組細(xì)胞的凋亡率、遷移能力及增殖能力降低。雙熒光素酶基因?qū)嶒灲Y(jié)果示：IRF9抑制了SIRT1的啟動子活性。這些結(jié)果表明AP發(fā)生時IRF9抑制SIRT1表達(dá)和增加了p53的乙?；龠M(jìn)AR42J細(xì)胞凋亡、增殖及轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。沉默IRF9基因能夠上調(diào)SIRT1，降低p53的乙酰化水平，抑制了細(xì)胞凋亡、增殖及轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。我們猜測IRF9是SIRT1的負(fù)調(diào)節(jié)因子，通過抑制SIRT1的表達(dá)促進(jìn)了p53的乙?；?，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、增殖及轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。這暗示著IRF9通過SIRT1-p53信號通路在AP病情進(jìn)展中有著主要作

46、用。綜上所述，AP發(fā)生時IRF9基因可能通過IRF9-SIRT1-P53信號通路下調(diào)SIRT1的表達(dá)，增加P53乙?；?，提高細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，進(jìn)一步引起炎癥反應(yīng)的發(fā)生。以IRF9為靶點有望在研究急性胰腺炎發(fā)生發(fā)展上獲得新的認(rèn)識，為尋找更好的臨床治療方法提供新的方向。5.結(jié)論：1） 體外AP模型中IRF9蛋白表達(dá)上升，而SIRT1表達(dá)下降，p53乙?；缴?。細(xì)胞凋亡增加、增殖及轉(zhuǎn)移擴(kuò)散能力升高。2） 沉默IRF9基因能夠抑制SIRT1的表達(dá)，增加P53乙?；?，促進(jìn)AR42J細(xì)胞發(fā)生凋亡，提高細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，3） IRF9蛋白可通過調(diào)控SIRT1/p53信號通路進(jìn)而參與AP的

47、發(fā)生發(fā)展。IRF9可能是治療AP的一個潛在的藥物靶點。參考文獻(xiàn)：1 Zhaorigetu S,Yang Z,Toma I,McCaffrey TA,Hu CA. Apolipoprotein L6, induced in atherosclerotic lesions, promotes apoptosis and blocks Beclin 1-dependent autophagy in atherosclerotic cells. J Biol Chem, 2011, 286 (31): 27389-27398.2 Cao Y,Yang W,Tyler MA,Gao X,Duan C,K

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