實(shí)驗(yàn)五 質(zhì)粒DNA酶切(質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶消化酶切)

1、質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA酶切酶切（質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶消化酶切）質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶消化酶切）實(shí)驗(yàn)五實(shí)驗(yàn)五背景知識背景知識一、質(zhì)粒圖譜的閱讀二、限制性內(nèi)切酶第一步第一步：首先看Ori的位置，了解質(zhì)粒的類型（原核/真核/穿梭質(zhì)粒） 第二步第二步：再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使用什么篩選標(biāo)記。 Ampr 水解內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。 tetr 可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。 camr 生成氯霉素羥乙?；苌铮怪ザ拘?。 neor（kanr）氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活 hygr 使潮霉素失活。一、質(zhì)粒圖譜的閱讀一、質(zhì)粒圖譜的閱讀第三步第三步：看多克隆位點(diǎn)（MCS）。它具有多個限制酶的單

2、一切點(diǎn)。便于外源基因的插入。第四步第四步：再看外源DNA插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA片段。 一般來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。第五步：第五步：是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即：啟動子核糖體結(jié)合位點(diǎn)克隆位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止信號。 這是用來區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體的?？寺≥d體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。pCAMBIA130210549 bpKanHPTGFPT-DNA right borderT-DNA left borderpUC18 MCSNOS35S promoter35S promoterpVS1-REPpBR322 oriUTRUT

3、RlacZ promoterEcoRV (6218)EcoRV (8842)EcoRV (10442)農(nóng)桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)農(nóng)桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)大腸桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)大腸桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)加尾信號，終止位點(diǎn)加尾信號，終止位點(diǎn)潮霉素抗性基因潮霉素抗性基因多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)終止子加尾信號終止子加尾信號綠色熒光蛋白基因綠色熒光蛋白基因二、限制性內(nèi)切酶二、限制性內(nèi)切酶1) 概念概念2) 命名原則命名原則3) 類型類型4) 基本特性及用途基本特性及用途5) 影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素6)限制性核酸內(nèi)切酶操作的注意事項(xiàng)限制性核酸內(nèi)切酶操作的注意事項(xiàng)1) 概念概念限制性核酸內(nèi)切酶限

4、制性核酸內(nèi)切酶(restriction ednonuclease)是一類能識別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在識別序列內(nèi)或附近特異切割雙鏈DNA的內(nèi)切核酸酶（endonuclease)的總稱。 至2006年2月共發(fā)現(xiàn)3773種限制性內(nèi)切酶，I、II、III型各有68、3692、10種，甲基化指導(dǎo)的3種，商品化的609種，II型中共有223種特異性。2) 命名原則命名原則1973年H.O.Smith和D.Nathams首次提出命名原則，1980年Roberts在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了系統(tǒng)分類 限制性核酸內(nèi)切酶第一個字母（大寫，斜體）代表該酶的宿主菌屬名(genus)；第二、三個字母(小寫，斜體)代表

5、宿主菌種名(species)。 第四個字母代表宿主菌的株或型(strain)。 若從一種菌株中發(fā)現(xiàn)了幾種限制性核酸內(nèi)切酶，即根據(jù)發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序用羅馬字母表示。 屬名屬名 種名種名 株系株系Haemophilus influenzae d 流感嗜血桿菌d株 Hind Hind同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶3) 類型類型 據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為性，可分為、型三類。型三類。4) 基本特性及用途基本特性及用途限制性核酸內(nèi)切酶的主要用途限

6、制性核酸內(nèi)切酶的主要用途 在特異位點(diǎn)上切割在特異位點(diǎn)上切割DNA，產(chǎn)生特異的限制性酶片段。，產(chǎn)生特異的限制性酶片段。 建立建立DNA分子的限制酶圖譜。分子的限制酶圖譜。 構(gòu)建基因文庫構(gòu)建基因文庫。 用限制酶切出的相同粘性末端，以便重組。用限制酶切出的相同粘性末端，以便重組。 改建質(zhì)粒。改建質(zhì)粒。5) 影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素 DNA樣品純度樣品純度 DNA樣品甲基化程度樣品甲基化程度 酶的星活性酶的星活性 (star activity) DNA樣品純度樣品純度 A） 雖不影響酶反應(yīng)速度，但雖不影響酶反應(yīng)速度，但RNA很易與酶蛋白發(fā)生很易與酶蛋白發(fā)生非特異性結(jié)

7、合而減少酶有效濃度，使酶解不徹底；另外，干擾非特異性結(jié)合而減少酶有效濃度，使酶解不徹底；另外，干擾DNA片段片段電泳觀察。電泳觀察。 B） 對酶解影響不大，但若有核酸酶等蛋白質(zhì)污染對酶解影響不大，但若有核酸酶等蛋白質(zhì)污染時，會干擾酶切反應(yīng)，并影響酶解產(chǎn)物。時，會干擾酶切反應(yīng)，并影響酶解產(chǎn)物。 C） 如質(zhì)粒如質(zhì)粒DNA中雜有染色體中雜有染色體DNA，雖不影響，雖不影響酶解作用，但干擾酶解產(chǎn)物電泳圖譜并影響以后的重組連接反應(yīng)。酶解作用，但干擾酶解產(chǎn)物電泳圖譜并影響以后的重組連接反應(yīng)。 D） 如苯酚、氯仿、乙醇、如苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，會影響等，會影響酶切速度，甚至改變酶的

8、識別特異性，出現(xiàn)酶的第二活性。酶切速度，甚至改變酶的識別特異性，出現(xiàn)酶的第二活性。 DNA樣品甲基化程度樣品甲基化程度 限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列若被修飾酶產(chǎn)生了修飾反應(yīng)，則該DNA不能被限制酶再切割。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的修飾途徑之一， DNA甲基化現(xiàn)象廣泛的存在于原核和真核生物中。 如：Acc識別序列能切割不能切割注意此處的區(qū)別dam甲基化酶識別序列AccT CCGG AGAT CCGG 6mATC 酶的星活性酶的星活性 (star activity)又稱第二活力，是指改變了酶切反應(yīng)條件后特異序列識別特性降低的一種現(xiàn)象。由于識別特異性的降低，可能對原識別序列相似的序列也產(chǎn)生切割反應(yīng)。高濃

9、度甘油、高pH、低離子強(qiáng)度、巰基乙醇、DMSO、Mn2+ 等的存在可能導(dǎo)致酶產(chǎn)生星活性。6) 限制性核酸內(nèi)切酶操作的注意事項(xiàng)限制性核酸內(nèi)切酶操作的注意事項(xiàng)商品化的限制性核酸內(nèi)切酶均為濃縮液，每次操作時應(yīng)商品化的限制性核酸內(nèi)切酶均為濃縮液，每次操作時應(yīng)使用新的吸頭去取酶；加入酶的體積應(yīng)不超過總體積的使用新的吸頭去取酶；加入酶的體積應(yīng)不超過總體積的10%，否則酶液中的甘油濃度超過否則酶液中的甘油濃度超過5%時酶易產(chǎn)生星活性。時酶易產(chǎn)生星活性。整個操作應(yīng)在整個操作應(yīng)在0進(jìn)行，即在冰浴中進(jìn)行，而且是在加入進(jìn)行，即在冰浴中進(jìn)行，而且是在加入其它試劑之后，最后加入酶。其它試劑之后，最后加入酶。當(dāng)切割大量當(dāng)

10、切割大量DNA時，通常采用延長反應(yīng)時間，減少酶的時，通常采用延長反應(yīng)時間，減少酶的用量。用量。當(dāng)當(dāng)DNA需需2種或以上酶切時，應(yīng)用通用緩沖液；若沒有種或以上酶切時，應(yīng)用通用緩沖液；若沒有通用緩沖液時，只有用通用緩沖液時，只有用1種酶切完后，純化酶切產(chǎn)物，再進(jìn)種酶切完后，純化酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行下一個酶切反應(yīng)。行下一個酶切反應(yīng)。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康模┝私饷盖性?，掌握酶切體系建立原則）用EcoR 切割質(zhì)粒pCAMBIA13023）用EcoR 切割銀杏基因組DNA實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或

11、其附序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并切割雙鏈近的特異位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA。 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶EcoR 特異性識別位點(diǎn)為：特異性識別位點(diǎn)為：GATATC CTATAGGATATC CTATAG產(chǎn)生平末端：產(chǎn)生平末端：pCAMBIA130210549 bpKanHPTGFPT-DNA right borderT-DNA left borderpUC18 MCSNOS35S promoter35S promoterpVS1-REPpBR322 oriUTRUTRlacZ promoterEcoRV (6218)EcoRV (8842)EcoRV (10442)則則pCAMBIA1302經(jīng)

12、經(jīng)EcoR 酶切后產(chǎn)生大小分別為：酶切后產(chǎn)生大小分別為：1600bp、2624bp和和6325bp的三條的三條DNA 片段片段基因組基因組DNA中由于有較多的中由于有較多的EcoR 識別位點(diǎn)，因此，經(jīng)識別位點(diǎn)，因此，經(jīng)EcoR 酶切后產(chǎn)生大小不一的條帶，電泳后整個泳道呈現(xiàn)均一酶切后產(chǎn)生大小不一的條帶，電泳后整個泳道呈現(xiàn)均一的亮帶。的亮帶。酶切前的酶切前的DNA酶切后的酶切后的DNA實(shí)驗(yàn)材料和試劑實(shí)驗(yàn)材料和試劑實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)材料：質(zhì)粒質(zhì)粒pCAMBIA1302 銀杏基因組銀杏基因組DNA實(shí)驗(yàn)試劑：實(shí)驗(yàn)試劑：EcoR 酶及其酶切緩沖液酶及其酶切緩沖液 瓊脂糖瓊脂糖(Agarose)、TAE電泳緩沖液等電泳緩沖液等實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器恒溫水浴鍋恒溫水浴鍋質(zhì)粒質(zhì)粒 （DNA）17.5L反應(yīng)反應(yīng) 10緩沖液緩沖液2L19L0.5L酶液酶液+用移液槍輕輕吹打使溶液混勻，且使溶液集中在管底用移液槍輕輕吹打使溶液混勻，且使溶液集中在管底混勻反應(yīng)體系后，混勻反應(yīng)體系后，37水浴保溫水浴保溫4-5h瓊脂糖凝膠電泳檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測(上樣上樣10L電泳電泳)EP管編號管編號, 加樣加樣實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1g DNA加1單位酶，消化1-2h。但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反應(yīng)時間也要適當(dāng)延長。 酶切時所加的DNA溶液