神經(jīng)通路追蹤技術(shù)

1、神經(jīng)通路追蹤技術(shù)PPT制作人：舒洪玲材料查找與修改：楊君嬋、李夢嫻、舒洪玲、黃艷雙班級：11級生物科學(xué)1班什么是神經(jīng)通路？ 神經(jīng)通路神經(jīng)通路是從感受器到大腦皮質(zhì)或從大腦皮是從感受器到大腦皮質(zhì)或從大腦皮質(zhì)至效應(yīng)器的神經(jīng)元鏈，作為神經(jīng)沖動傳導(dǎo)的通質(zhì)至效應(yīng)器的神經(jīng)元鏈，作為神經(jīng)沖動傳導(dǎo)的通路，稱神經(jīng)通路。路，稱神經(jīng)通路。神經(jīng)傳神經(jīng)傳 感覺傳導(dǎo)通路（上行傳導(dǎo)通路）：從感受感覺傳導(dǎo)通路（上行傳導(dǎo)通路）：從感受導(dǎo)通路導(dǎo)通路 器到大腦皮質(zhì)的神經(jīng)元鏈。器到大腦皮質(zhì)的神經(jīng)元鏈。 運(yùn)動傳導(dǎo)道（下行傳導(dǎo)通路）：從大腦皮運(yùn)動傳導(dǎo)道（下行傳導(dǎo)通路）：從大腦皮 皮質(zhì)到效應(yīng)器的神經(jīng)元鏈。皮質(zhì)到效應(yīng)器的神經(jīng)元鏈。 那么，傳導(dǎo)

2、速度這樣快，科學(xué)家們是那么，傳導(dǎo)速度這樣快，科學(xué)家們是通過什么技術(shù)來研究的呢？通過什么技術(shù)來研究的呢？研究一般思路研究一般思路 給與神經(jīng)元以某種物質(zhì)，追蹤它的輸送及其輸送后在神經(jīng)元其它部分的定位。 應(yīng)用一些組織化學(xué)方法來顯示中樞神經(jīng)通路-如熒光法。神經(jīng)通路追蹤技術(shù)神經(jīng)通路追蹤技術(shù) 凡是用于研究神經(jīng)系統(tǒng)各結(jié)構(gòu)間的纖維聯(lián)系凡是用于研究神經(jīng)系統(tǒng)各結(jié)構(gòu)間的纖維聯(lián)系方法統(tǒng)稱為神經(jīng)通路追蹤技術(shù)。例如：方法統(tǒng)稱為神經(jīng)通路追蹤技術(shù)。例如：GolgiGolgi染色法染色法辣根過氧化物酶軸突逆行追蹤法辣根過氧化物酶軸突逆行追蹤法熒光色素逆行標(biāo)志法熒光色素逆行標(biāo)志法放射性核素示蹤法放射性核素示蹤法 細(xì)胞毒植物凝集素

3、追蹤法細(xì)胞毒植物凝集素追蹤法.GolgiGolgi染色法染色法 方法方法: :將動物灌注固定后取將動物灌注固定后取腦并將全腦浸于腦并將全腦浸于GolgiGolgi染液中染液中2 2周周, ,然后浸于然后浸于30%30%蔗糖中蔗糖中; ;經(jīng)經(jīng)過蒸餾水洗滌、氨化、酸性過蒸餾水洗滌、氨化、酸性堅膜定影液反應(yīng)、蒸餾水再堅膜定影液反應(yīng)、蒸餾水再洗滌洗滌, ,然后切片，采用然后切片，采用100100微微米厚的震動切片。經(jīng)上升梯米厚的震動切片。經(jīng)上升梯度酒精脫水、透明度酒精脫水、透明, ,裱片后觀裱片后觀察。察。 目的目的：研究神經(jīng)元之間的：研究神經(jīng)元之間的鄰近關(guān)系以及樹突、軸突的鄰近關(guān)系以及樹突、軸突的配

4、布。配布。辣根過氧化物酶軸突逆行追蹤法辣根過氧化物酶軸突逆行追蹤法(Horseradish (Horseradish peroxidease-HRP)peroxidease-HRP) 辣根過氧化物酶軸突逆行追蹤法是利用辣根過氧化物酶軸突逆行追蹤法是利用軸漿運(yùn)輸軸漿運(yùn)輸現(xiàn)象追蹤現(xiàn)象追蹤神經(jīng)元間聯(lián)系的一種方法。神經(jīng)元間聯(lián)系的一種方法。 軸漿運(yùn)輸是神經(jīng)元的一項基本活動，即沿其軸突從胞體向軸漿運(yùn)輸是神經(jīng)元的一項基本活動，即沿其軸突從胞體向末梢（順向）及從末梢向胞體（逆向）的物質(zhì)運(yùn)輸。末梢（順向）及從末梢向胞體（逆向）的物質(zhì)運(yùn)輸。 到達(dá)胞體或末梢的到達(dá)胞體或末梢的HRPHRP，最后通過呈色反應(yīng)，形成有色

5、反應(yīng)，最后通過呈色反應(yīng)，形成有色反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)物 HRP HRP方法的主要方法的主要步驟：步驟：HRPHRP的引入的引入 存活期存活期 神經(jīng)材神經(jīng)材料的固定、取材料的固定、取材 切片及組織化學(xué)反應(yīng)切片及組織化學(xué)反應(yīng) 切片的觀察切片的觀察HRPHRP法的基本用法：法的基本用法：識別突觸傳入沖動的來源識別突觸傳入沖動的來源 將HRP注入軸突終末某區(qū)，它即被攝取，并經(jīng)軸突逆行送到神經(jīng)胞體，從而追蹤突觸傳入沖動的來源和去處。確定傳出投射確定傳出投射 注射HRP到灰質(zhì)區(qū)，可使注射區(qū)的神經(jīng)元胞體攝取示蹤劑并經(jīng)軸索順行輸送到突觸終末。神經(jīng)元的神經(jīng)元的GolgiGolgi樣染色樣染色。Methods rely o

6、n a substances incorporation into the neuron, its transport, and its subsequent localization in other part of the neuron;Histochemical methods.注意事項注意事項 給藥給藥 加壓注射、離子投入和軸索損傷后標(biāo)記。 動物存活時間動物存活時間 逆行輸送速度：50-120mm/天，胞體內(nèi)活性：2-4天。 順行輸送速度：100-300mm/天。 固定和切片固定和切片 1%多聚甲醛于1.5戊二醛，一般為冰凍切片。 HRPHRP的選擇的選擇 游離HRP; 結(jié)合HRP(氨

7、基酸、凝集素、某些細(xì)菌毒素等可提高其靈敏度數(shù)十倍）。常用的成色方法及成色劑常用的成色方法及成色劑 成色劑顯示成色劑顯示HRP-HRP-組織化學(xué)反應(yīng)步驟組織化學(xué)反應(yīng)步驟 成色方法成色方法： 是將組織培育于是將組織培育于H H2 2O O2 2和成色劑（聯(lián)苯胺或其衍生物）和成色劑（聯(lián)苯胺或其衍生物）溶液內(nèi)，由過氧化物溶液內(nèi)，由過氧化物-過氧化物酶系統(tǒng)氧化成有色產(chǎn)物。過氧化物酶系統(tǒng)氧化成有色產(chǎn)物。 成色劑成色劑： 二鹽酸聯(lián)苯胺四鹽酸（二鹽酸聯(lián)苯胺四鹽酸（DABDAB）；）； 聯(lián)苯胺二鹽酸（聯(lián)苯胺二鹽酸（BDHABDHA）；）； 四甲基聯(lián)苯胺（四甲基聯(lián)苯胺（TMBTMB）；）； 鄰聯(lián)茴香胺（鄰聯(lián)茴香胺

8、（o-Do-D）；）；常見神經(jīng)元被常見神經(jīng)元被HRPHRP標(biāo)記程度標(biāo)記程度 1977 1977年年KuypersKuypers等利用軸漿流逆向輸送，將熒光素作等利用軸漿流逆向輸送，將熒光素作為示蹤劑，用不同的熒光素分別注入兩個不同部位為示蹤劑，用不同的熒光素分別注入兩個不同部位雙標(biāo)記神經(jīng)元，可在不同波長的激發(fā)光照射下，使雙標(biāo)記神經(jīng)元，可在不同波長的激發(fā)光照射下，使神經(jīng)元胞體顯示出兩種不同顏色的熒光神經(jīng)元胞體顯示出兩種不同顏色的熒光。常用的熒光素有常用的熒光素有：FITC(FITC(綠色綠色) ), TRITC(TRITC(紅色紅色) )熒光素逆行標(biāo)記法熒光素逆行標(biāo)記法熒光素逆行標(biāo)記神經(jīng)元的實驗

9、步驟：熒光素逆行標(biāo)記神經(jīng)元的實驗步驟： 熒光化合物溶液的配制熒光化合物溶液的配制 熒光化合物的注射（肌熒光化合物的注射（肌肉等）肉等） 動物存活期動物存活期 灌注固定液灌注固定液 取材（腦或脊髓）取材（腦或脊髓） 切片（冰凍切片）、貼片、切片（冰凍切片）、貼片、蓋片蓋片 熒光顯微鏡觀察熒光顯微鏡觀察 熒光逆行標(biāo)記法簡單、靈敏，可研究神經(jīng)熒光逆行標(biāo)記法簡單、靈敏，可研究神經(jīng)元的側(cè)枝投射。但切片易褪色，不易控制元的側(cè)枝投射。但切片易褪色，不易控制注射范圍和避免過路纖維的攝取。注射范圍和避免過路纖維的攝取。放射性核素示蹤法放射性核素示蹤法 放射性核素示蹤法是一種利用神經(jīng)元軸漿運(yùn)輸現(xiàn)放射性核素示蹤法是

10、一種利用神經(jīng)元軸漿運(yùn)輸現(xiàn)象進(jìn)行放射性示蹤劑標(biāo)記，用自顯影方法顯示神經(jīng)元象進(jìn)行放射性示蹤劑標(biāo)記，用自顯影方法顯示神經(jīng)元與終末或神經(jīng)元間聯(lián)系的方法。與終末或神經(jīng)元間聯(lián)系的方法。 它的一個突出優(yōu)點(diǎn)是它的一個突出優(yōu)點(diǎn)是過路神經(jīng)纖維幾乎無標(biāo)記過路神經(jīng)纖維幾乎無標(biāo)記，而過路纖維問題正是辣根過氧化物酶軸突逆行追蹤法而過路纖維問題正是辣根過氧化物酶軸突逆行追蹤法所難以避免的。所難以避免的。放射性核素示蹤法的主要步驟放射性核素示蹤法的主要步驟 放射性示蹤溶液的配置（放射性示蹤溶液的配置（3 3H-H-氨基酸）氨基酸） 放射性示蹤劑引入（注射法、電泳法）放射性示蹤劑引入（注射法、電泳法） 存活期、固定（存活期、固定（10%10%甲醛溶液）、切片、貼片甲醛溶液）、切片、貼片 涂布原子核乳膠或感光材料涂布原子核乳膠或感光材料 曝光（密閉的暗盒中進(jìn)行）曝光（密閉的暗盒中進(jìn)行） 顯影、定影、染色（顯影、定影、