疾病控制中心的PCR實驗室管理要素

1、疾病控制中心的PCR實驗室管理要素doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2009.11.222 基因擴增檢驗實驗室區(qū)域的設(shè)置熒光PCR實驗室設(shè)置是一個很規(guī)范的要求，應(yīng)遵守相關(guān)法規(guī) 進行實驗室的設(shè)置。 總的方針是各區(qū)獨立， 注意風(fēng)向， 因地制宜， 方便工作。實驗室裝修應(yīng)方便清潔，不應(yīng)出現(xiàn)死角。熒光PCF實驗室應(yīng)分為：試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴增反應(yīng)混合物 配制和擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)。如使用全自動分析儀，區(qū)域可 適當(dāng)合并。 各工作區(qū)域必須要有明確的標(biāo)記， 進入各工作區(qū)域嚴(yán) 格按照單一方向進行，只能從試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、 擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)、 擴增產(chǎn)物分

2、析區(qū)這樣一個行程進 行。最好做到專區(qū)專人， 區(qū)內(nèi)物品專用。 各區(qū)應(yīng)具備的設(shè)備配置： 屋頂紫外燈、近臺紫外燈、一次性手套、一次性鞋套、工作服、 廢液缸、掃帚、拖把、廢紙簍、微量加樣器覆蓋11000L、經(jīng)高壓處理過的離心管和加樣器吸頭、筆、紙等，注意避免不同工 作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。人員的管理和培訓(xùn)從事PCR實驗室工作人員，應(yīng)具備醫(yī)學(xué)檢驗和微生物檢驗的 基本知識， 且是受過臨床基因擴增實驗室基礎(chǔ)知識和技能的培訓(xùn) 并獲得上崗證書的人員。中心主任要親自負責(zé)實驗室全面管理、 技術(shù)指導(dǎo)、 解決與溝通技術(shù)疑難等問題。 同時為了加強專業(yè)知識 和技能的訓(xùn)練， 中心要不定期外請專業(yè)人員進行培訓(xùn)和派送相關(guān) 人員

3、外出學(xué)習(xí)，做好后備人員的培養(yǎng)。要求PCR實驗室人員定期 寫學(xué)術(shù)綜述或經(jīng)驗總結(jié)，能夠順利地通過國家設(shè)立的定期考核。 對PCR的原理、應(yīng)用范圍、局限性及發(fā)生污染的每一個環(huán)節(jié)要有 充分的了解，熟悉操作規(guī)程，善于分析試驗結(jié)果。要建立技術(shù)人 員檔案，做好對本室人員的管理。污染及處理污染的措施熒光PCR的污染分為實驗前的污染和實驗進行中的污染。實驗前的污染是指實驗材料的污染，主要是病人標(biāo)本來源的核酸； 而實驗進行中的污染， 通常實驗過程中的每一步驟都可能發(fā)生對 樣本的污染。核酸的制備是較常產(chǎn)生污染的過程，熒光PCR反應(yīng) 進行過程中所涉及到的實驗設(shè)備的任何部位，也是可能的污染 源。而PCR產(chǎn)物是個高度危險的

4、污染源，通常的陽性PCR產(chǎn)物含 有大量的目標(biāo)模板分子，極易泄露產(chǎn)生氣溶膠污染整個實驗室。 在日常工作中需要加強對污染的監(jiān)測， 每次PCF實驗務(wù)必做各種 陰陽性對照。陽性對照：陽性對照要選擇擴增度中等、重復(fù)性 好的模板進行，監(jiān)測PCR反應(yīng)是否成功且是否合乎理論要求。 標(biāo)本對照：被檢測的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對照。 試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或 RNA進行PCF擴增， 以監(jiān)測試劑及環(huán)境是否污染。 有時輕微的氣溶膠污染還需要復(fù)管 試驗、重復(fù)性試驗等。 所以實驗室所有人員應(yīng)充分認(rèn)識預(yù)防污染 的重要性，了解產(chǎn)生污染的原因，如：標(biāo)本間交叉污染。在核 酸提取過程中一定要小心操作，防止飛

5、濺，做好標(biāo)記，避免樣本 間的交叉污染。 配好反應(yīng)液并加入待測核酸后， 必須蓋好反應(yīng)管， 要有明確的樣品處理程序。PCR試劑的污染。主要是由于在PCR 試劑的配置過程中加樣槍、容器、雙蒸水及其他溶液被PCR核酸 模板污染。PCR擴增產(chǎn)物污染。主要是氣溶膠污染，一定要選 用質(zhì)量好的離心管和反應(yīng)管，避免試劑飛濺、外泄。同時必須要 有高度的責(zé)任感， 反應(yīng)完畢后應(yīng)及時把反應(yīng)物清理掉， 避免熒光 PCF后的產(chǎn)物反應(yīng)管在工作區(qū)內(nèi)打開。要避免污染， 首先應(yīng)是預(yù)防而不是排除污染。 實驗室工作區(qū) 的嚴(yán)格劃分的目的就是為了預(yù)防污染，工作區(qū)之間傳遞窗的設(shè) 置，一方面方便了試劑、樣品等在不同實驗室區(qū)間的傳遞；另一 方面

6、也增加了交叉污染的危險， 因此要定期對傳遞窗進行處理或 用移動紫外燈照射。 工作結(jié)束后必須立即對工作區(qū)進行清潔， 用 10%次氯酸鈉擦拭，再用 70%乙醇擦拭，然后再用可移動紫外燈 調(diào)至實驗臺上6090cm內(nèi)過夜照射，可有效打斷擴增產(chǎn)物。一 旦污染發(fā)生，應(yīng)立即進行清潔衛(wèi)生、稀鹽酸液擦拭或浸泡、通風(fēng) 疏散、紫外燈照射、酸霧處理等措施，盡快消除污染。也可選用 不同區(qū)域的引物進行 PCRT增，盡快恢復(fù)正常工作狀態(tài)。 造成熒 光PCF污染的原因很多也較復(fù)雜的，因此必須對熒光PCF實驗室 進行嚴(yán)格的科學(xué)管理。質(zhì)量管理體系的建立及質(zhì)量控制 實驗室質(zhì)量管理體系包括三部分： 即質(zhì)量方針與宗旨、 工作 制度、標(biāo)

7、準(zhǔn)操作文件(SOP)。基本內(nèi)容也可概括為四句話“寫你 所應(yīng)做的，做你所寫的，記錄你所做的和分析你所做的”。就是 要寫質(zhì)量管理文件， 并把實驗室的工作文件化， 寫的要具體一些， 讓第一次接觸該SOP的人，也能夠按其完成相關(guān)操作。 文件的編 寫是實驗室驗收工作最重的一個環(huán)節(jié)， 所以在編寫文件時要讓每 一個實驗室的人員都參與，對所寫的內(nèi)容、程序和要求都知道， 并能遵守執(zhí)行。要做到這一點，除了嚴(yán)格的實驗室管理制度外， 關(guān)鍵是實驗室負責(zé)人和實驗技術(shù)人員的觀念， 要認(rèn)識到SOP文件 對質(zhì)量保障的重要性。 質(zhì)量管理精髓是所有與實驗室檢驗質(zhì)量有 關(guān)的環(huán)節(jié)全部要有章可循，按章進行。質(zhì)量控制包括兩個方面，即室內(nèi)質(zhì)

8、量控制和室間質(zhì)量評價。室內(nèi)質(zhì)量控制(IQC)的目的是確保臨床測定過程及結(jié)果在偏差和 精密度方面達到預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)；室間質(zhì)量控制 (EQC)是將實驗室測 定情況與一室間和客觀標(biāo)準(zhǔn)進行回顧性比較的數(shù)據(jù)。 所有開展臨 床基因擴增實驗的實驗室， 都必須參加由衛(wèi)生部組織的全國臨床 基因擴增檢驗項目的室間質(zhì)量評價， 評價結(jié)果將作為其開展臨床 基因擴增實驗的依據(jù)之一。 臨床標(biāo)本制備處理和核酸提取方法的 標(biāo)準(zhǔn)化、 檢測試劑和方法的標(biāo)準(zhǔn)化是室間控制的關(guān)鍵。 應(yīng)在常規(guī) 工作的基礎(chǔ)上，進行IQC以監(jiān)測方法或者檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性， 通 過室內(nèi)質(zhì)控系統(tǒng)，使用質(zhì)控品，確定質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，可以評價檢驗結(jié) 果的精密度，結(jié)合室間質(zhì)量評價(

9、EQA)可以評價檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確 性。通過有效的質(zhì)量控制，充分運用實時熒光PCF技術(shù)的靈敏性、 特異性和高效性， 為臨床檢測和診斷提供科學(xué)和準(zhǔn)確的報告， 真 正實現(xiàn)為患者及社會公共衛(wèi)生監(jiān)測服務(wù)的宗旨。樣本的采集與處理常用于基因擴增檢測的臨床標(biāo)本包括 EDTA或者是枸櫞酸鈉 抗凝全血或骨髓、血清或血漿、痰、CSF尿及分泌物、各種食品樣本等。 標(biāo)本的收集應(yīng)在實驗室工作區(qū)域之外進行， 樣本采集 后應(yīng)及時進行分離、 微生物細菌培養(yǎng)等處理， 暫不進行試驗的樣 本應(yīng)處于合適的溫度條件下保存并明確保存期限， 及時檢測。 對 樣本編號應(yīng)有明確規(guī)定，保證編碼的惟一性，不能有重復(fù)編號， 樣本資料信息登記要完整，方便

10、查找。采血液樣本時，應(yīng)用一次 性密閉容器。 非密閉采集樣本時， 必須防止來自采樣者的皮屑或 分泌物的污染，采樣時必須戴一次性手套、帽子。玻璃器皿在使 用前應(yīng)高壓處理，可使核酸酶永久性失活。進行抗凝處理時，不 能使用肝素抗凝，因肝素是 Taq 酶的強抑制劑。儀器設(shè)備的校準(zhǔn)及保養(yǎng)維護儀器性能穩(wěn)定調(diào)試校準(zhǔn)， 是試驗操作的前提條件， 加樣槍應(yīng) 及時的校準(zhǔn)及保養(yǎng)維護，PCF檢測儀每年應(yīng)由儀器廠家對儀器進 行檢修和校準(zhǔn)； 對冰箱和加熱模板應(yīng)每日記錄其溫度， 有效地控 制實驗的條件； 其他設(shè)備要經(jīng)常清潔衛(wèi)生， 避免塵?；蚝怂岱肿?沉積。 塵埃分子等對熒光反射有一定得影響，最好應(yīng)避免在塵埃數(shù)過高的實驗室內(nèi)操作。 及時升級或更新已老化的儀器設(shè)備， 保 證PCR僉測實驗結(jié)果的準(zhǔn)確。實驗室安全PCR實驗室的安全包括實驗室的生物防護、實驗室的清潔、實驗室污染的處理、 實驗廢棄物的處理等。 生物防護除了必備的 口罩、帽子、手套、工作服外，還應(yīng)具備洗眼瓶、75%酒精、眼罩、生物安全柜等設(shè)施，并制定緊急情況處理方案。如不慎將血 液標(biāo)本、 體液標(biāo)本或其他病原微生物濺到皮膚上， 應(yīng)立即用清水 反復(fù)沖洗，接著用 75%酒精棉簽或含碘消毒棉簽擦拭消毒，最后 再用清水沖洗干凈。 要防止污物處理不規(guī)范、 檢驗人員自我防護 措施不嚴(yán)、日常消毒滅菌不能堅持、人員通行混亂、工作記錄不 全、實