內(nèi)源性調(diào)節(jié)性T細胞在SAH后腦血管痙攣及腦損傷中的作用

1、 內(nèi)源性調(diào)節(jié)性t細胞在sah后腦血管痙攣及腦損傷中的作用匯報人：張金卉匯報人：張金卉 導(dǎo)師：孫保亮導(dǎo)師：孫保亮研究的目的及意義研究的目的及意義sah后腦血管痙攣、炎癥反應(yīng)及后腦血管痙攣、炎癥反應(yīng)及神經(jīng)功能預(yù)后的改善是一個非常復(fù)雜的病理 、生理、臨床過程。雖然進行了大量研究，為止其 發(fā)生機制仍未完全明了。研究小鼠體內(nèi)內(nèi)源性調(diào)節(jié)性小鼠體內(nèi)內(nèi)源性調(diào)節(jié)性t細細對對sah后腦血管痙攣、后腦血管痙攣、炎癥反應(yīng)及癥反應(yīng)及神經(jīng)功能預(yù)后的改善仍將是今后一個時期的熱點。隨著研究的逐漸深入，將會對內(nèi)源性調(diào)節(jié)性t細胞移植sah的臨床治療及神經(jīng)功能預(yù)后帶來深遠的影響。國內(nèi)外相關(guān)文獻國內(nèi)外相關(guān)文獻 the kinetic

2、s of lymphocyte subsets andmacrophages in subarachnoid space after subarachnoid hemorrhage in rats it has been suggested that humoral immunity plays a role in the pathogenesis of cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage, there has been no quantitative assay for cellular immunity. we studied

3、the kinetics of immune cells in the subarachnoid space after subarachnoid hemorrhage in the rat. a serial response of immunoreactive cells, which resembles that of the chronic allergic reaction observed in autoimmune diseases or delayed-type hypersensitivity, exists in the subarachnoid space after s

4、ubarachnoid hemorrhage. the present results suggest that the initial response in cellular immunity, which is followed by humoral immunity and eicosanoid reactions, plays a role in eliciting the development of cerebral vasospasm.蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣分子機制的研究進展分子機制的研究進展與no代謝有關(guān)的cvsk 通道活性的改變文氧合血紅蛋白的

5、作用本磷酸二酯酶一v的作用本no和et一1的平衡失調(diào)與與no代謝無關(guān)的代謝無關(guān)的cvsras蛋白的作用前列環(huán)素與血栓烷a2失衡自由基與脂質(zhì)過氧化物增多血管加壓素的作用ca 代謝紊亂statin-induced t-lymphocyte modulation and neuroprotection following experimental subarachnoid hemorrhage statins in fl uence immune system activities through echanisms independent of their lipidlowering proper

6、ties. t cells can be subdivided based on cytokine secretion patterns into two subsets: t-helper cells type 1 (th1) and type 2 (th2). independent laboratory studies have shown statins to be potent inducers of a th2 switch in immune cell response and be neuroprotective in severalmodels of central nerv

7、ous system (cns) disease. this study was the fi rst to evaluate the immune modulating effects of statins in subarachnoid hemorrhage (sah). the present study elucidated the potential role of a th2 immune switch in statin provided neuroprotection following sah.matrix metalloproteinase-9 concentration

8、in the cerebral extracellular fluid of patients during the acute phase of aneurysmal subarachnoid hemorrhage elevated cerebral interstitial pro-mmp-9 relates toearly brain injury in asah patients. a larger prospectivestudy should be performed to confirm whether patients with prolonged elevation or a

9、 second peak of cerebral pro-mmp-9 would be more likely to develop dci and to confirm whether mmp-9, a mediator of neurovascular injury, would be worth to consider as a predictor of vasospasm.trehalose treatment suppresses inflammation,oxidative stress, and vasospasm induced by experimental subarach

10、noid hemorrhage subarachnoid hemorrhage (sah) frequently results in several complications, including cerebral vasospasm, associated with high mortality. although cerebral vasospasm is a major cause of brain damages after sah, other factors such as inflammatory responses and oxidative stress also con

11、tribute to high mortality after sah.trehalose is a non-reducing disaccharide in which two glucose units are linked by ,-1,1-glycosidic bond, and has been shown to induce tolerance to a variety of stressors in numerous organisms. in the present study, we investigated the effect of trehalose on cerebr

12、al vasospasm, inflammatory responses, and oxidative stress induced by blood in vitro and in vivo. trehalose has suppressive effects on several pathological vents after sah,including vasospasm, inflammatory responses, and lipid peroxidation. trehalose may be a new therapeutic approach for treatment o

13、f complications after sah.properties within the cerebrospinal fluid after subarachnoid hemorrhage in vivo and in vitro to functionally characterize pro-inflammatory and vasoconstrictive properties of cerebrospinal fluid after aneurysmal subarachnoid hemorrhage (sah) in vivo and in vitro. we function

14、ally characterized inflammatory and vasoactive properties of patients csf after sah in vivo and in vitro. this pro-inflammatory milieu in the subarachnoid space might play a pivotal role in the pathophysiology of early and delayed brain injury as well as vasospasm development following sah.研究內(nèi)容研究內(nèi)容小

15、鼠體內(nèi)內(nèi)源性調(diào)節(jié)性t細胞對蛛網(wǎng)膜下腔出血（sah）后腦血管痙攣的影響小鼠體內(nèi)內(nèi)源性調(diào)節(jié)性t細胞移植sah后神經(jīng)功能預(yù)后的改善作用小鼠體內(nèi)內(nèi)源性調(diào)節(jié)性小鼠體內(nèi)內(nèi)源性調(diào)節(jié)性t細胞移植對細胞移植對sah后炎癥反應(yīng)后炎癥反應(yīng)的影響的影響 每項研究內(nèi)容均分4組1、tregs刪除組2、sah模型組3、假手術(shù)組4、pbs腹腔注射組體重、窩別、喂養(yǎng)方法相同的小鼠隨機分組每組1015只小鼠；每只小鼠編號后按計算機隨機表分4組，雙盲（研究者、負(fù)責(zé)資料收集和分析的人員也不了解分組情況）較好地避免了偏倚。 研究方法研究方法實驗實驗動物處理動物處理1、tregs刪除刪除腹腔注射0.25mg cd25特異性抗體小鼠加入肝

16、素抗凝hanks 液洗滌、els裂解注射后第2天取外周血加入標(biāo)記的抗細胞表面特異性抗原的抗體pbs 洗兩遍4 下避光反應(yīng)20-30分鐘，洗滌2 次加入標(biāo)記的抗細胞表面特異性抗原的抗體facs calibur 檢測cd4+cd25+t細胞300l染色緩沖液重懸細胞cd4+cd25+t細胞幾乎減少至0%為調(diào)節(jié)性t細胞刪除成功cell quest 收集細胞并分析流式結(jié)果2、sah模型制作模型制作感覺有阻力時再繼續(xù)前進3mm, 總進入長度約為10mm(已刺破動脈壁）然后迅速將線栓拔出，動脈血灌入，造成蛛網(wǎng)膜下腔出血將制備的線栓通過切口經(jīng)頸動脈插入頸內(nèi)動脈，一直送至大腦前動脈與大腦中動脈的分叉處（類似大

17、腦中動脈阻斷的方法）首先制作線栓（5-0單絲尼龍線，頭端磨成子彈頭狀，總長度15mm，直徑0.2mm）3、假手術(shù)：假手術(shù)：遇到遇到 阻力即停止繼續(xù)插入，并迅速退出線栓阻力即停止繼續(xù)插入，并迅速退出線栓4、pbs腹腔注射腹腔注射：經(jīng)腹腔注射與：經(jīng)腹腔注射與0.25mg cd25特異性抗體等體積的特異性抗體等體積的pbs。 一、一、內(nèi)源性調(diào)節(jié)性內(nèi)源性調(diào)節(jié)性t細胞對蛛網(wǎng)膜下腔出血細胞對蛛網(wǎng)膜下腔出血（sah）后腦血管痙攣的）后腦血管痙攣的檢測內(nèi)容檢測內(nèi)容text基底動脈形態(tài)學(xué)檢測腦動脈勻漿液中一氧化氮合酶mrna和蛋白含量；no含量；cgmp含量局部腦血流量局部腦血流量循環(huán)內(nèi)皮細胞檢測循環(huán)內(nèi)皮細胞檢

18、測基底動脈形態(tài)學(xué)檢測腦動脈勻漿液中一氧化氮合酶mrna和蛋白含量；no含量；cgmp含量局部腦血流量局部腦血流量循環(huán)內(nèi)皮細胞檢測循環(huán)內(nèi)皮細胞檢測檢測內(nèi)容局部腦血流量（局部腦血流量（regional cerebral blood flow, rcbf）檢測：）檢測：顱骨開窗，在立體定向儀控制下，在顱骨開窗，在立體定向儀控制下，在sah前及前及sah后后12小時內(nèi)（或小時內(nèi)（或6小時）用激光多普勒血流計動態(tài)測量動物頂葉皮層小時）用激光多普勒血流計動態(tài)測量動物頂葉皮層rcbf。基底動脈形態(tài)學(xué)檢測：基底動脈形態(tài)學(xué)檢測：1、立體顯微鏡下觀察基立體顯微鏡下觀察基底動脈（底動脈（ba）、大腦中）、大腦中動脈

19、（動脈（mca）和大腦前）和大腦前動脈（動脈（aca）并記錄它）并記錄它們的直徑們的直徑2、冰凍切片上顯微鏡下冰凍切片上顯微鏡下觀察基底動脈形態(tài)學(xué)變化，觀察基底動脈形態(tài)學(xué)變化，用圖像分析儀測定基底動用圖像分析儀測定基底動脈內(nèi)徑、外徑與管腔橫截脈內(nèi)徑、外徑與管腔橫截面積面積改用改用10明膠和墨水混明膠和墨水混合液灌注合液灌注13.5 mlmin)15s于于sah后后2天、天、2周，經(jīng)周，經(jīng)心臟灌注，心臟灌注，10福爾馬福爾馬林灌注（林灌注（5.5 mlmin）min 后后循環(huán)內(nèi)皮細胞檢測：循環(huán)內(nèi)皮細胞檢測：于于sahsah后后3天、天、2周周取靜脈血標(biāo)本，用取靜脈血標(biāo)本，用因子相關(guān)抗原免疫熒光染

20、色因子相關(guān)抗原免疫熒光染色檢測循環(huán)內(nèi)皮細胞（檢測循環(huán)內(nèi)皮細胞（circulating endothelial cell, cec），以反映），以反映血管內(nèi)皮細胞的損傷。血管內(nèi)皮細胞的損傷。于于sahsah后后3天、天、2周，周，取動物腦底取動物腦底willis動脈環(huán)及其相連的動脈制備勻動脈環(huán)及其相連的動脈制備勻漿液漿液 pcr、western blot等等檢測腦檢測腦動脈勻漿液中一氧化氮合酶動脈勻漿液中一氧化氮合酶（nitric oxide synthase, nos, nos）mrna和蛋白含量和蛋白含量 硝酸酶還原法測定硝酸酶還原法測定nono含量含量 放射免疫分析法測定放射免疫分析法測定

21、cgmp含量含量二、二、內(nèi)源性調(diào)節(jié)性內(nèi)源性調(diào)節(jié)性t細胞移植細胞移植sah后神經(jīng)功能后神經(jīng)功能預(yù)后的改善作用預(yù)后的改善作用運動評分共運動評分共12分分感覺評分（感覺評分（515分）分）認(rèn)知功能障礙評估認(rèn)知功能障礙評估振動覺（振動覺（13分）分）觸覺（觸覺（13分）分）視覺（視覺（13分）分） 對刺激的觸激反應(yīng)（對刺激的觸激反應(yīng)（13分）分）嗅覺（嗅覺（13分）分）感覺評分感覺評分運動評分運動評分 平衡和平衡和協(xié)調(diào)協(xié)調(diào)能力（能力（3 3分）分） 隨意活 動（3分） 運動評分攀爬能力（攀爬能力（3分）分） 肢體活動對稱性（3分） 認(rèn)知功能障礙評估認(rèn)知功能障礙評估在2次測試中的后一次測試中，將平臺移去

22、，讓動物游泳30秒，計算動物到達目標(biāo)象限（原來放置平臺的位置）所花費的時間和游泳速度。在術(shù)后3天和2周，對大鼠每天測試4次術(shù)后第2天在無平臺情況下將大鼠放于morris水迷宮進行馴化二次數(shù)據(jù)表示為動物找到沉水的平臺所需要的時間（潛伏期）如樹突狀細胞、小膠質(zhì)細胞及嗜中性粒細胞（gr1抗體染中性粒細胞），染中心粒細胞時用gfap（膠質(zhì)細胞）、cd31（血管內(nèi)皮細胞）mmp-9+血管長度（mmp-9與cd31雙標(biāo)記）檢測toll樣受體tlr2和tlr4在基因和蛋白水平的表達檢測其下游信號分子如trak1、traf6、nf-b、tnf-、il-1、il-6、mcp-1等在蛋白水平的表達中性粒細胞計數(shù)、淋巴細胞等計數(shù)血液標(biāo)本檢測有關(guān)免疫和炎