植物DNA和RNA提取方法

1、實驗植 物 基 因 組 DNA 的 提 取一、實驗?zāi)康恼莆罩参锟侱NA勺抽提方法和基本原理。學(xué)習根據(jù)不同的植物和實驗要求設(shè)計和改良植 物總DNAtt提方法。二、實驗原理通常采用機械研磨的方法破碎植物的組織和細胞，由于植物細胞勻漿含有多種酶類（ 尤其是氧化酶類）對DNA勺抽提產(chǎn)生不利的影響，在抽提緩沖液中需加入抗氧化劑或強還原劑 （ 如巰基乙醇） 以降低這些酶類的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并減少研磨過程中各種酶類的作用。十二烷基肌酸鈉（sarkosyl） 、十六烷基三甲基溴化銨（hexadyltrimethyl ammomumbromide,簡稱為CTAB）十二烷基硫酸鈉（sodium

2、dodecyl sulfate ,簡稱SDS痔離子型表 面活性劑，能溶解細胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA1以游離出來。再加入苯酚和氯仿等有機溶劑，能使蛋白質(zhì)變性，并使抽提液分相，因核酸 （DNA RNA求溶性很強， 經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。上清液中加入無水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA容于TE溶液中，即得植物總DNA容液。三、 實驗材料水稻幼葉四、主要試劑配方2% CTAEJ由提緩沖溶液:CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml（ PH8.0） 0.5M EDTA 8ml ,先用70ml ddHzO溶解，再定容至200ml

3、滅菌，冷卻后0.2-1% 2-琉基乙醇 （ 400ul ）氯仿 -異戊醇（24： 1） ：先加 96ml 氯仿，再加4ml 異戊醇，搖勻即可。五、實驗步驟1. DNA的提?。?） 2%CTAB由提緩沖液在65c水浴中預(yù)熱。（2） 取少量葉片（約1g）置于研缽中，用液氮磨至粉狀；（3）加入700ul的2%CTA岫提緩沖液，輕輕攪動；（4） 4）將磨碎液分倒入1.5 ml 的滅菌離心管中，磨碎液的高度約占管的三分之二；（ 5）置于65的水浴槽或恒溫箱中，每隔10 min 輕輕搖動，40 min 后取出；（6）冷卻2 min后，加入氯仿-異戊醇（24: 1）至滿管，劇烈振蕩23 min,使兩者 混合

4、均勻；（7）放入離心機中10 000 rpm離心10 min,與此同時，將600屋的異丙醇加入另 一新的滅菌離心管中；（8） 8）10 000 rpm 離心 1 min 后，移液器輕輕地吸取上清夜，轉(zhuǎn)入含有異丙醇的離心管內(nèi)，將離心管慢慢上下?lián)u動 30 sec,使異丙醇與水層充分混合至能見到DN像狀物；（9） 10000 rpm離心1 min后，立即倒掉液體，注意勿將白色 DNAM淀倒出，將離心 管倒立于鋪開的紙巾上；（10） 60 sec后，直立離心管，加入 720屋的75%醇及80膜5 M 的醋酸鈉，輕 輕轉(zhuǎn)動，用手指彈管尖，使沉淀與管底的 DN秋狀物浮游于液體中；（11）放置30 min

5、,使DNAfe狀物的不純物溶解；（12） 10000 rpm離心1 min后，倒掉液體，再加入800履75%勺乙醇,將DNAH洗30 min；（13） 13） 10000 rpm 離心 30 sec 后，立即倒掉液體，將離心管倒立于鋪開的紙巾上；數(shù)分鐘后，直立離心管，干燥 DNA（自然風干或用風筒吹干）；（14）加入50履0.5 X TE（含RNase像沖液，使DNA容解，置于37c恒溫箱約15 h, 使RNN肖解；（ 15）置于-20保存、備用。2. DNA 質(zhì)量檢測瓊脂糖電泳檢測，原理和方法見實驗二。六、 注意事項（ 1）葉片磨得越細越好。（ 2）移液器的使用。（3）由于植物細胞中含有大量

6、的 DNAS,因此，除在抽提液中加入EDTA卬制酶的活性外， 第一步的操作應(yīng)迅速，以免組織解凍，導(dǎo)致細胞裂解，釋放出DNAB,使DNA竄解。思考題：1 . 本實驗中所用到的各試劑的作用是什么? CTAB, 氯仿 , 異丙醇 , 75%乙醇, EDTA2 .提取基因組DNA勺方法有哪些？各有何優(yōu)缺點？實驗二 多聚酶鏈式反應(yīng)（ polymerase chain reaction, PCR） 基因擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測1、 實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗學(xué)習PC阪應(yīng)的基本原理，掌握PCR勺基本操作技術(shù)以及瓊脂糖凝膠電泳技 術(shù)。2、 實驗原理PCFffl于擴增位于兩端已知序列之間的 DNAK段，即通過引物延伸而

7、進行的重復(fù)雙向 DNA 合成?；驹砑斑^程如下：PCR1環(huán)過程中有三種不同的事件發(fā)生：（1）模板變性；（2）引物退火；（3）熱穩(wěn)定DNA 聚合酶進行DNA成。1 .變性：加熱使模板 DNA在高溫下（94-95 C）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條 單鏈，即變性階段。2 .退火：在體系溫度降至37-65 C,模板DNAW引物按堿基配對原則互補結(jié)合，使引 物與模板鏈3端結(jié)合，形成部分雙鏈 DNA即退火階段。3 .延伸：體系反應(yīng)溫度升至中溫 72C,耐熱DN咪合酶以單鏈DNAJ模板，在引物的引導(dǎo)下，利用反應(yīng)混合物中的4 種脫氧核苷三磷酸（dNTP） ，按5到3方向復(fù)制出互補DNA即引物的延伸階段上

8、述3步為一個循環(huán)，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個階段。從理論上講，每經(jīng) 過一個循環(huán)，樣本中的DNA*應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過 2530個循環(huán)后DNA擴增106109倍。典型的PC阪應(yīng)體系由如下組分組成：DNA真板、反應(yīng)緩沖液、dNTP MgC2、兩條合成 的DN用I物、耐熱DNA Taq聚合酶。瓊脂糖凝膠電泳的原理：瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，沸水中溶解，45 c開始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DN的子在堿性環(huán)境中帶負電荷， 在外加電場作用下向正極泳動。DN吩子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。 不同DNA其分子量大小

9、及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂 糖凝膠電泳法分離DNA主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系。 澳化乙錠(EB)為扁平狀分子，在紫外照射下發(fā)射熒光。 EB可與DN的子形成EB-DNAK合 物，其發(fā)射的熒光強度較游離狀態(tài) EB發(fā)射的熒光強度大10倍以上，且熒光強度與DNA勺含 量成正比。用肉眼觀察，可檢測到 5 ng以上的DNA 三、實驗材料及相關(guān)試劑基因組DNA基因特異性引物，PCRT增相關(guān)試劑，等 四、實驗步驟1. .模板DNA勺抽提：實驗一所彳#的水稻基因組 DNA2. PCRB作(在冰上操作)：(1) PCR5應(yīng)混合液的配制：反應(yīng)體系 25

10、pL,在無菌的0.2 mL離心管中按下列操作程 序加樣：反應(yīng)物加樣順序體積/卜L終濃度ddHO117.3 Xn10 x Buffer22.5 x n1 x25 mmol/L MgCl 231.5 x n1.5 mmol/L10 mmol/L dNTP40.5 x n200 pmol/L10上游引物51 x n0.4 mol/L10下游引物61 x n0.4 mol/LDNA Taq聚合酶70.2 x n1 U(2)將反應(yīng)混合液混勻,然后每個PCRt中分裝24li L反應(yīng)混合液,DNA最后加1滴石蠟油，防止水分蒸發(fā),然后稍離心。再加1卜L模板(3)將PCRT放到PCRB循環(huán)儀中，按下列程序開始循

11、環(huán)：94 C 4 min (預(yù)變生) 94 C 30 sec, 60 C 30 sec, 72 J2min72 C 7 min!35個循環(huán)I(4)注意事項由于PC雙敏度非常高，所以應(yīng)當采取措施以防反應(yīng)混合物受痕量DNA勺污染a.所有與PCRt關(guān)的試齊L只作PCRS驗用，而不挪作它用。b.操作中所用的PCR1、離心管、吸管頭等都只能一次性使用。c. 每加一種反應(yīng)物，應(yīng)換新的槍頭。3. PC*物的檢測：瓊脂糖濃度（1.2%）; EB濃度（5膜/ 100 ml TBE ）（ 1）制膠（以150 mL 為例）a. 稱取1.8 g瓊脂糖，加入150 ml的TBE緩沖液（pH 8.0）,搖勻，用電子天平稱

12、三角瓶的總重量。b. 電爐上加熱，至瓊脂糖完全溶解；然后在天平上加蒸餾水至原重量;c. 用凝膠將制膠板兩端封好，插入適當?shù)氖嶙?，將溶解的瓊脂糖（約50），倒入其中，直至厚度為46 mm；如有氣泡要把氣泡趕出），在室溫下冷卻凝固（約3045 min） ；d. 將制膠板置于電泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保證點樣孔完好。（ 2）點樣a.將2.0川 澳酚藍加入到PCRT物中，然后稍微離心；b.每孔點樣10.0川，藍色樣品混合物將沉入點樣孔下部。（ 3）電泳打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至 35 V/cm（約100 V）,可見到澳酚藍條帶由負極向正極移動，約1 小時后即可觀察。（ 4）染色將電泳好的凝膠放入

13、含EB的水溶液中，染色15-20分鐘。（ 5）觀察將電泳好的膠置于紫外透射檢測儀上，戴上防護觀察罩，打開紫外燈，可見到橙紅色核酸條帶，根據(jù)條帶粗細，可粗略估計該樣品 DNA勺濃度。如同時有已知分子量的標準 DNA1 行電泳，則可通過線性DN爍帶的相對位置初步估計樣品的分子量。（ 6）注意事項a. 煮膠時，膠液的量不應(yīng)超過三角瓶容量的1/3 ，否則易溢出。b. 煮好的膠應(yīng)冷卻至50左右時再倒，以免制膠板變形，并減少漏膠的機會。c. 倒膠注意厚度（4-6 mm） ，充分凝固后再拔出梳子，以保持齒孔形狀完好。也可待膠稍凝固后，放入4冰箱10 多分鐘，以加速膠的凝固。d. 加樣前趕走點樣孔中的氣泡，點

14、樣時吸管頭垂直，切勿碰壞凝膠孔壁，以免使帶型不整齊。e. 一般情況下不必每點一個樣品都換槍頭，吸電泳緩沖液洗幾次即可再點下一個樣品。凝膠中含有EB,切勿直接用手接觸膠，廢棄膠應(yīng)集中處理，勿亂丟。思考題 ：1 . PCRK應(yīng)液中主要成分是哪些？在 PCRS應(yīng)過程中各起什么作用？2 .為什么在PCRS應(yīng)過程中，使用三個不同的溫度變化？3,用PCFT增目的基因，要想得到特異性產(chǎn)物需注意哪些事項？實驗三植物總RNA勺提取、實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗學(xué)習從植物組織中提取 RNA勺方法 二、實驗原理RNA是一類極易降解的分子，要得到完整的 RNA必須最大限度地抑制提取過程中內(nèi)源性 及外源性核糖核酸酶對RNA勺降解

15、。高濃度強變性劑異硫鼠酸”瓜，可溶解蛋白質(zhì)，破壞細胞 結(jié)構(gòu)，使核蛋白與核酸分離，失活 RNAB,所以RNAK細胞中釋放出來時不被降解。細胞裂 解后，除了 RNA還有DNA蛋白質(zhì)和細胞碎片，通過酚、氯仿等有機溶劑處理得到純化、 均一的總RNA。三、儀器、藥品與試劑配方（ 一 ） 儀器1低溫離心機2分光光度計3.瓊脂糖膠電泳系統(tǒng)，用前先用1% Na OH容液浸y過夜，之后再用DEPCK浸泡沖洗。4高壓滅菌鍋5研缽、剪刀、一次性手套等（ 二 ） 藥品1. 焦碳酸二乙酯（DEPC）2. 嗎啉代丙烷磺酸（MOPS）3. 異硫氰酸胍4. 醋酸鈉 （NaAc）5. 氯仿6. 苯酚7. 甲醛8. 乙醇9. 乙

16、二胺四乙酸（EDTA）10. 瓊脂糖11. 異丙醇（ 三 ） 試劑配方1. 0.1% DEPCK0.1ml DEPC 加入 100 ml 三蒸水中，振搖過夜，再濕熱滅菌。2. 2 mol/L NaAc 、 0.5 mol/L EDTA 、 4 mol/L 異硫氰酸胍、4 mol/L LiCl 等均用 DEPC水配制。3. 5 XMOPSfe泳緩沖液（pH 7.0）MOPS 0.1 mol/LNaAc 40 mmol/LEDTA 5 mmol/L四、實驗步驟（一）總RNA勺提取（方案一）1. 實驗前 10 天左右播種水稻種子，在3-4 葉期，剪取1.2 g 幼葉。放入研缽，在液氮中研磨成粉末狀，

17、移入10 mL離心管。加入4 mol/L 異硫氰酸胍4 mL苯酚3 mL2 mol/L NaAc （pH 4.8）0.3 mL氯仿0.6 mL混勻，冰浴放置30 min 。2. 4 ，8000 r/min，離心13 min。3. 棄沉淀，取上清至另一干凈無菌離心管中。4. 加入2倍體積無水乙醇，-70，0.5 h 。5. 4 ，8000 r/min，離心13 min 。6. 棄上清，在沉淀中加入1 mL 4 mol/L LiCl ，使其溶解。7. 移入 1.5 mL 離心管中，冰浴2 h 。8. 4 ，13000 r/min ，離心 15 min 。9. 棄上清，在沉淀中加入 400 uL D

18、EPC水，再加入400 uL氯仿，混勻。10. 4 ，13000 r/min ，離心 6 min 。11. 取上清 , 并加入 1/10 體積 3 mol/L NaAc （ pH 5.0 ） ， 2 倍體積無水乙醇，-20放置30 min 。12. 4 ，13000 r/min ，離心 20 min 。13. 將沉淀RNAffl 70*醇洗滌2次。14. 將沉淀RNAS溫下稍干燥。15. 力口 30 uL DEPC水溶解，-70 C保存。（二）總RNA勺提取（方案二）利用TRIzol提取液抽提RNA具體步驟如下：1. 取幼葉約250 mg 在液氮中研磨至細粉，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的1.5 ml 離心管；2

19、. 加入 1 ml TRIZOL 提取液震蕩搖勻；3. 室溫放置5 min 后，加入0.5 ml 的氯仿，劇烈搖動離心管5 min ；4. 在 8條件下，12000 rpm 離心 15 min ；5. 溶液分為兩層，下層為酚氯仿淺紅色液層，將上層液體移入干凈離心管，加入0.5 ml 異丙醇在1530條件下，沉淀10 min ；6. 然后在，28 C條件下，12000 rpm離心10 min , RNAM淀管壁和底部；7. 去掉液體部分，加入1 ml 75%酒精洗2 次；8. 風干后，加入25屋DEPC處理過的水溶解RNA儲藏于-80 C冰箱備用。RNA1 配制1.2%變性瓊脂糖凝膠（40 mL

20、）稱取0.48 g,加入DEPCK 25.2 mL,5X電泳緩沖液4 mL,加熱使溶解，稍冷卻加入甲醛3.4 mL, 混勻，室溫凝固0.5-1 h.2. RNA 電泳檢測樣品制備RNA甲醛2.5屋甲酰胺7.5仙110XMOPS2 仙1RNA Loading Buffer2 仙1滅菌的DEPC水4叱1混合液輕輕混勻并離心，放于65下溫育5 min 后，置于冰上。3. 電泳檢測將1.2%變性瓊脂糖凝膠放入水平電泳槽中，加 1X MOP的泳緩沖液，覆蓋凝膠約1 mm 將RNA羊品加到凝膠點樣孔中，在 5 V/cm條件下電泳30 min,然后在EB中染色15-20 min, 在紫外燈下觀察提取的RNA

21、勺質(zhì)量。五、注意事項1在研磨過程中，利用液氮時刻使組織保持冰凍狀態(tài)。2. RNA酶是一類生物活性非常穩(wěn)定的酶類，除了細胞內(nèi)源RNA酶外，外界環(huán)境中均存在RNAB,所以操作時應(yīng)戴手套，并注意時刻換新手套。思考題：1. 實驗中所用到的各試劑的作用是什么?焦碳酸二乙酯(DEPC), 嗎啉代丙烷磺酸(MOPS), 異硫氰酸胍, 醋酸鈉 (NaAc), 氯仿 ,苯酚 , 甲醛 , 乙醇 , 乙二胺四乙酸(EDTA), 異丙醇動植物組織mRNA 提取實驗方法一、材料水稻葉片或小鼠肝組織。二、設(shè)備研缽，冷凍臺式高速離心機，低溫冰箱，冷凍真空干燥器，紫外檢測儀，電泳儀，電泳槽。三、試劑1、 無 RNA 酶滅菌

22、水：用將高溫烘烤的玻璃瓶( 180 2 小時) 裝蒸餾水，然后加入0.01%的DEPC (體積/體積)，處理過夜后高壓滅菌。2、 75%乙醇：用DEPC 處理水配制75%乙醇，(用高溫滅菌器皿配制)，然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。3、1X層析柱加樣緩沖液；20mmol/L Tris Cl(pH7.6) , 0.5mol/L NaCl , 1mmol/L EDTA(pH8.0)， 0.1% SDS。4、洗脫緩沖液：10mmol/L Tris Cl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0) , 0.05% SDS。四、操作步驟(一)動植物總RNA 提取 -Trizo

23、l 法Trizol 法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細菌，樣品量從幾十毫克至幾克。 用 Trizol 法提取的總RNA 絕無蛋白和DNA 污染。 RNA 可直接用于Northern 斑點分析，斑點雜交，Poly(A)十分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。1、將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1ml Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol 體積的10%。2、研磨液室溫放置5 分鐘，然后以每1mlTrizol 液加入 0.2ml 的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15 秒。3、取上層水相于一新的離心管，按每mlTrizol

24、液加 0.5ml 異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。4、棄去上清液，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4下7500g離心5分鐘。5、小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA 的溶解度。然后將RNA 溶于水中，必要時可55 -60水溶10 分鐘。 RNA 可進行mRNA 分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70。 注意 1、整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。2、 加氯仿前的勻漿液可在-70保存一個月以上，RNA 沉淀在70%乙醇中可在4保存一周，-20保存一年。(二

25、) mRNA 提取由于mRNA末端含有多poly(A)+ ,當總RNA流徑oligo(dT)纖維素時，在高鹽緩沖液作 用下，mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸儲水中， mRNA可被 洗下，經(jīng)過兩次oligo(dT) 纖維素柱，可得到較純的mRNA。1、用 0.1mol/L NaOH 懸浮 0.5-1.0g oligo(dT)纖維素。2、將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經(jīng)DEPC 處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為 0.5-1.0ml,用3倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。3、用1x 柱層析加樣緩沖液沖洗柱床，直到流出液的pH 值小于8.0。4

26、、將(一)中提取的RNA液于65c溫育5分鐘后迅速冷卻至室溫，加入等體積 2x柱層析緩沖液，上樣，立即用滅菌試管收集洗出液，當所有RNA 溶液進入柱床后，加入1 倍柱床體積的1x 層析柱加樣溶液。5、測定每一管的OD260,當洗出液中OD為0時，加入2-3倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以1/3 至 1/2 柱床體積分管收集洗脫液。6、測定OD260,合并含有RNA的洗脫組分。7、 加入 1/10 體積的 3M NaAc(pH5.2)， 2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻，-20 30分鐘。8、 4下12000g 離心 15 分鐘， 小心棄去上清液，用 70%乙醇洗滌沉淀，4下12000g離心 5 分鐘

27、。9、小心棄去上清液，沉淀空氣干燥10 分鐘，或真空干燥10 分鐘。10、 用少量水溶解RNA 液， 即可用于cDNA 合成 (或保存在70%乙醇中并貯存于-70) 。 注意 1、 mRNA 在 70%乙醇中-70可保存一年以上。2、oligo(dT)纖維素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并 加入0.02%疊氮鈉(NaN3)冰箱保存，重復(fù)使用。每次用前需用 NaOH水層析柱加樣緩沖液 依次淋洗柱床。RNAI取流程RNA(total RNA )和信使 RNA(mRNA)抽提RNA勺提取RNAK無RNAS的環(huán)境原核生物能產(chǎn)生功能上截然不同的三種 RNA,信使R

28、NA(mRNA孩糖體RNA (rRNA),轉(zhuǎn)運 RNA(tRNA)而真核生物則能產(chǎn)生四種，還有一種為真核生物所持有的小 RNA.mRNA由基因 轉(zhuǎn)錄而來的，它運送編碼蛋白所需的信息.由于mRNA；表了基因表達的水平，因此mRNAJ分 離 , 定量和檢測極為重要.應(yīng)用RNA寸細胞和分子生物學(xué)的各個方面進行研究非常普遍 .RNA存在于從簡單的逆轉(zhuǎn)錄病 毒到哺乳動物細胞的所有的生命形式之中.由于當前沒有一種方法能夠直接擴增 RNAJ3 此,RNA的分離通常是決定實驗結(jié)果質(zhì)量的第一步，也是關(guān)鍵的一步.提取RNA過程中防止RNA1的污染所采取的步驟RN砌離的實用方法既有簡單直接的方法（如分離rRN用口

29、tRNA）,也有困難和涉及復(fù)雜步驟的 方法（如分離mRNA）在無細胞體系中克隆基因的體外轉(zhuǎn)錄非常有用,它可以產(chǎn)生足量的同源 RN吩子用作探針或模板以識別和測定表達基因的量 ,或用于RNA勺生化研究,處理RNA羊品 時必需仔細小心，其程度取決于樣品的用途和來源.由于RNA酶存在于所有的生物中并且能 夠抵抗諸如煮沸這樣的物理破壞，固此建立一個無RNAS的環(huán)境對于制備優(yōu)質(zhì) RNAf艮重要. 對于制備mRN廉說這些預(yù)防措施尤其重要.方案 :工作區(qū)域應(yīng)與進行普通微生物實驗的區(qū)域分離好, 特別是那些用于細菌接種, 培養(yǎng)基和試劑配制的區(qū)域，那些培養(yǎng)基和試劑用于從細菌和動物細胞中進行DNA勺制備和操作.通常認

30、為這些區(qū)域富含RNAS.如有可能，使用標有無RNAB”的商品試管，吸頭，溶液和水.通常新的無菌處理過的塑料試 管和吸管無RNAB,3）雙蒸水（ddH2O）和溶液應(yīng)該用RNA#的抑制劑DEPC焦碳酸二乙酯）進行處理：每100mL溶 液或水中加入0.1mL DEPO液，放在搖床上充分混勻并在37c下作用數(shù)小時.然后將溶液高 壓滅菌15min使DEPCfc活.4）用分子級的試劑和DEPCt理過的水配制白溶液通常沒有 RNAB.5）分離RNAW前，將一些實驗室玻璃制品置于烤箱在 300 C烘烤4h以滅活核酶.如有可能, 將其他設(shè)備也滅菌處理.從組織中提取RNAU要注意：動物器官的解剖器械存放組織塊的玻

31、璃器皿凍存組織塊所用的器皿組織器官的沖洗液人汗含有RNAB，故在所有步驟中均應(yīng)戴手套并經(jīng)常更換記住我們的周圍環(huán)境含有大量的微生物和氣霧, 它們來自吸液操作或來自我們自己的呼吸這些可能造成RNAS的污染一些組織像脾臟可能比其它組織含有更多的RNA#.細菌比哺乳動物細胞中有更多的 RNA#.因此從這些細胞中制備RNAK采取更嚴格的預(yù)防措施.分離后的RNAffi過瓊脂糖凝膠電泳再經(jīng)澳化乙錠染色后便可檢查其是否完整.rRNA（18s和28s）條帶模糊可能表明由RN服引起的RNA勺降解.一步法分離RNA應(yīng)用從組織或細胞中分離細胞的總RNA從液體樣品中分離RNATRI REAGENT （Tripure）是

32、一種用于RNA分離的商品溶液.該法源于chomc- zynski的RNA 分離一步法. 它更便于使用并且結(jié)果更加可靠. 對于來源有限的樣品, 我們推薦使用這種試劑.這種試劑能從同一樣品中同時分離 RNA, DNA蛋白質(zhì).方案 .用l mLTripure/50-100mg （組織）勻漿組織樣品.對于細胞，每10cm2面積（貼壁的單層細胞） 或每106個細胞（細胞沉淀）使用1mL.將樣品轉(zhuǎn)至1.5mLEPt中.（-70 C可保存1月）室溫下放置樣品5min.每1mLTripure中加入0.2mL氯仿并搖動15s,置于室溫下2 15min.4 c下 12000g 離心 15min.將水相（上部）轉(zhuǎn)至

33、一個新EP管.每1mL Tripure加入0.5mL異丙醇沉淀RNA將樣品置于室溫下5 10min.4 ,12000g 離心 10min. 凝膠樣沉淀物為RNA.吸出上清并用1mL 75%醇在渦旋振蕩器上洗滌 RNAK淀一次，4 C, 7500g離心5min.晾干RNAK淀.然后用無RNA1白水，甲酰胺或0.5X的SDS溶液溶解沉淀.RNA勺檢測：將樣品稀釋液于三處波長處讀取 ODfi.記錄ODfi，通過計算確定RNAftfc度或純度.公式如下對于 ssDNA:ssDNA=33X （OD260 OD310） X稀釋倍數(shù)對于 dsDNA:dsDNA=50X （OD260-OD 310） X稀釋倍

34、數(shù)對于 ssRNA:ssRNA=40X (OD260 0口310)稀釋倍數(shù)以上濃度單位為ug/mL.注意事項1)OD310值是背景,若鹽濃度較高，OD310值也高.2)OD260/OD280又t DNAW言其值大約為1.8,高于1.8有RNA虧染.低于1.8則有蛋白質(zhì)污染.3)OD260/OD280對RNAW言其值大約為2.0.小結(jié)所有可能與RN破觸的器材均得用DEPCt理.操作過程中應(yīng)帶口罩, 手套 .DEPCT致癌之可能，盡量避免接觸皮膚提取的RNA盡早逆轉(zhuǎn)錄成cDNA.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT PCR)RRPCR向接用來擴增從RN砌子今得到的一段特異序列.RNA首先被逆轉(zhuǎn)錄為cDNA用位于 一段特異序列或者一個基因兩側(cè)的引物生成以 cDNM摸板的PCFT物成為一個標準的PCR 反應(yīng).得到陽性產(chǎn)物說明存在著特異的 RNAff列.對于一個成功的PC網(wǎng)應(yīng)來說，寡聚核甘酸引物是最重