石蠟切片冰凍切片超薄切片

1、石蠟切片技術(shù) 雖然21世紀(jì)醫(yī)學(xué)高科技迅猛發(fā)展、日新月異，新的診斷方法層出不窮，但迄今為止，即使是世界上最發(fā)達(dá)國家，疾病的確診主要還是通過病理診斷。病理診斷是所有其他診斷(包括臨床診斷、影像診斷、實(shí)驗(yàn)室檢查診斷乃至分子診斷)的金標(biāo)準(zhǔn)。因此學(xué)習(xí)相關(guān)病理診斷技術(shù)具有重要意義。病理技術(shù)不僅可以作為臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，還可以幫助臨床查明死因，對(duì)研究生來說還可以提供教學(xué)、科研的資料。病理學(xué)科是一門基礎(chǔ)與臨床之間起著橋梁作用的重要學(xué)科，病理研究方法在技術(shù)工作上又是多方面的，有尸體解剖，大體標(biāo)本的制作、制片技術(shù)（石蠟切片、冰凍切片、火棉膠切片、半薄切片、超薄切片）組織化學(xué)方法，免疫酶標(biāo)技術(shù)、熒光技術(shù)、攝影技術(shù)等

2、。碩士研究生學(xué)習(xí)的課題研究階段，往往需要自己設(shè)計(jì)并親自動(dòng)手操作，為滿足研究生的實(shí)際需要，本章簡(jiǎn)要介紹常用的病理學(xué)有關(guān)技術(shù)，并注意盡量做到：突出實(shí)用性：以行之有效的病理學(xué)常用技術(shù)為主線，圍繞碩士研究生的實(shí)際需要，對(duì)病理學(xué)技術(shù)的原理、相關(guān)理論及具體操作方法、步驟等進(jìn)行闡述。反映進(jìn)展性：充分反映病理學(xué)的時(shí)代性與進(jìn)展性。第一節(jié) 組織制片的概述組織制片技術(shù)的應(yīng)用，從1665年由HOOk發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開始，已有300多年的歷史。最早應(yīng)用冰凍切片；隨后又進(jìn)一步利用石蠟的硬度，以石蠟包埋組織，制成石臘切片；后來又利用明膠、火棉膠、碳蠟和塑料等物質(zhì)的韌性，以其包埋組織而制作切片。組織制片技術(shù)隨著生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展而發(fā)

3、展。切片染色方法可以顯示不同細(xì)胞和組織形態(tài)，以及細(xì)胞和組織中某些化學(xué)成分含量的變化。因此，組織制片技術(shù)是教學(xué)、醫(yī)學(xué)和科研中不可缺少的一個(gè)組成部分。第二節(jié) 制片的種類一、 組織切片法：任何組織切片必須依靠切片機(jī)將組織切成薄片（厚度以m計(jì)），再進(jìn)行染色而得到結(jié)果。在切成薄片以前必須設(shè)法使組織內(nèi)部滲入足夠的支持物質(zhì)，使組織保持一定的硬度，然后使用切片機(jī)進(jìn)行切片。滲透到組織中的支持劑（物質(zhì)）有多種，如石臘、明膠、火棉膠、碳蠟和塑料等。病理學(xué)研究中最常用的組織切片技術(shù)是常規(guī)石蠟切片和冷凍切片。其要點(diǎn)是將研究的組織進(jìn)行切片，然后進(jìn)行各種染色。冰凍組織切片法是直接利用快速冷凍法進(jìn)行切片。二、組織非切片法不用

4、切片機(jī)，不經(jīng)過切片手續(xù)而制成組織切片的方法，包括整體封藏法、浮片法、壓碎法和組織直接印片法。這些方法操作簡(jiǎn)單而快，可根據(jù)制片的需要進(jìn)行選擇使用。第三節(jié) 石蠟切片技術(shù)石蠟切片法組織切片的主要程序： 一、取材 取材是根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康募芭R床活檢、尸解組織的病變程度而合理取得組織材料。為了制作優(yōu)質(zhì)的切片，取材時(shí)組織愈新鮮愈好，并應(yīng)及時(shí)固定。（一）病理標(biāo)本的來源及分類： 病理標(biāo)本的來源有臨床活檢、尸體解剖、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、培養(yǎng)細(xì)胞。主要病理標(biāo)本大致可分類如下：1、手術(shù)標(biāo)本 2、內(nèi)鏡取材標(biāo)本3、穿刺取材標(biāo)本4、細(xì)胞學(xué)標(biāo)本 可分為：痰、尿、陰道分泌物、胸水腹水、穿刺細(xì)胞學(xué)標(biāo)本、內(nèi)鏡刷取標(biāo)本、其它等。（二）取材的一般原

5、則1、認(rèn)真觀察，取準(zhǔn)標(biāo)本病變部位，切勿漏取。 2、要能全面反映出器官有無病變，顯示病變?nèi)?最大面積)，包括腫瘤轉(zhuǎn)移部位、切緣等。 3、根據(jù)臨床或肉眼所見及病史提示對(duì)病變組織多取材，主要病變與相關(guān)組織多取材，特殊病變要盡量多取材。 4、若取材大小受限，應(yīng)盡量取包含病變周邊相對(duì)正常組織。 5、應(yīng)避免選取凝血塊、壞死組織及粘液成分。 6、要全面描述病變狀況，由表及里，測(cè)重量、部位、體積等。（三）取材方法 常見標(biāo)本取材方法如下： 1、闌尾炎標(biāo)本2、腫瘤標(biāo)本3、胃標(biāo)本4、腸標(biāo)本5、肺、腎臟標(biāo)本6、乳腺癌根治標(biāo)本7、子宮標(biāo)本8、卵巢與輸卵管囊腫標(biāo)本9、淋巴結(jié)標(biāo)本10、一般小標(biāo)本（四）取材注意事項(xiàng)1、新鮮

6、2、配合3、目的4、部位5、避免擠壓6、大小7、數(shù)量8、方向9、標(biāo)記10、手術(shù)11、小標(biāo)本12、交叉污染 （五）臨床病理取材注意事項(xiàng) 姓名、樣本、件數(shù)二、組織固定（一）固定的作用：1、保持細(xì)胞與生活時(shí)的形態(tài)相似。2、保持細(xì)胞內(nèi)特殊的成分轉(zhuǎn)變成不溶性物質(zhì)。3、使組織中的各種物質(zhì)沉淀和凝固起來，以便染色后易于區(qū)別和觀察。4、固定劑兼有硬化作用，使組織硬化增加組織硬度，便于制片。（二）原理：使組織及細(xì)胞內(nèi)蛋白凝固；使有關(guān)成分沉淀、變性，成為不溶性物質(zhì)。（三）方法：浸泡、灌注（局部灌注、全身灌注）、蒸汽熏蒸 （四）固定時(shí)間: 一般固定液在24小時(shí)內(nèi)不能穿透厚度大于23mm的實(shí)體組織或0.5cm的多孔疏

7、松組織。常規(guī)組織病理學(xué)：可長時(shí)間固定細(xì)胞病理學(xué)：可長時(shí)間固定細(xì)胞化學(xué)：不宜過長，約1小時(shí)為宜（五）固定注意事項(xiàng)1. 固定液有毒性，注意自身防護(hù)2. 及時(shí)，盡可能新鮮。3. 超微結(jié)構(gòu)觀察：低溫固定4. 注意不同研究目的對(duì)固定液的特殊需要5. 固定液用量：足，必要時(shí)及時(shí)更換。一般應(yīng)為組織塊總體積的45倍，也可達(dá)1520倍。（六）常用的固定液：1、單純固定液：甲醛、乙醇、丙酮、戊二醛、醋酸、4%多聚甲醛2、混合固定液：乙醇-甲醛液（AF液）、B5固定液（醋酸鈉-升汞-甲醛）、Bouin氏液、Carnay氏液、Zenker固定液、氯化汞、苦味酸、重鉻酸鉀、AAF液、甲醛-生理鹽水等。三、固定后處理：

8、（一）固定后處理的目的：及時(shí)洗去固定液，有利于脫水、切片和染色，并防止染色中甲醛色素的產(chǎn)生。（二）固定后處理的注意事項(xiàng)：洗滌注意固定劑是否含乙醇或以水配制。四、脫水：（一）脫水的目的：利用脫水劑置換及驅(qū)除組織中的水分，以利于透明和浸蠟。（二）脫水的步驟：一般大小約為1.5cml.8cm0.2cm的組織，其脫水步驟和時(shí)間如下： 70乙醇12h 80乙醇24h 90乙醇24h 95乙醇24h無水乙醇24h（三）脫水的注意事項(xiàng)： 1、濃度梯度 2、徹底干凈 3、時(shí)間適度 4、有蓋瓶子 5、達(dá)到無水 6、其它五、透明（一）透明的目的 組織塊在浸蠟前，必須通過透明以便使石蠟浸入組織內(nèi)，起充分支持硬化組織

9、塊的作用，以便完整切片。 通常根據(jù)透明時(shí)間與肉眼觀察相結(jié)合判斷透明程度。（二）常用透明劑的種類和使用方法 最常用的是二甲苯，另外還有甲苯、苯、氯仿、香柏油、松節(jié)油、汽油等。六、浸蠟（一）浸蠟的目的 組織經(jīng)過脫水、透明后要用石蠟、火棉膠、碳蠟等支持劑透入內(nèi)部，使其變硬并將組織包埋進(jìn)去以利于切片和觀察，這個(gè)過程稱為“透入（浸蠟）”或“包埋”。 （二）浸蠟的方法將組織經(jīng)過透明以后立即投入到液體石蠟中去。在浸蠟時(shí)組織必須經(jīng)過數(shù)次純石蠟（石蠟、），這樣可以使石蠟中剩余的透明劑完全除盡，以免影響切片質(zhì)量。（三）浸蠟劑的種類1、石蠟 石蠟有高熔點(diǎn)和低熔點(diǎn)之分，一般普遍應(yīng)用熔點(diǎn)為56以上的石蠟。低熔點(diǎn)在54以

10、下，用于酶的顯示和保存抗原活性。 2、火棉膠 目前使用火棉膠透入組織較少，用于染色前的覆蓋液較多。 3、碳蠟 4、明膠七、包埋 （一）包埋的目的：用石蠟將經(jīng)過固定、脫水、透明、浸蠟后的組織包繞成長方體塊狀以便于切片。石蠟是動(dòng)物植物、人體組織制片技術(shù)中極重要且應(yīng)用最廣的包埋劑。包埋蠟須在溫箱內(nèi)經(jīng)多次熔化沉淀后的干凈蠟，包埋較為理想，其包埋蠟熔點(diǎn)為5658。將經(jīng)過固定、脫水、透明、浸蠟后的組織用石蠟埋入，待組織冷卻、變硬，這樣組織可以獲得一定的硬度，以便切成薄片。 （二）石蠟包埋的注意點(diǎn)：1、動(dòng)作要迅速。2、注意切面。3、加溫鑷子。4、組織不能重疊。5、包埋用蠟一般為工業(yè)蠟。八、切片（一）切片前的

11、準(zhǔn)備工作1、修塊：石蠟切片前應(yīng)先將包埋的每塊組織周圍過多的石蠟切去，組織四周留2mm的石蠟邊。 2、粘塊（二）切片操作包括切片、展片和烤片。1、切片：將包埋好的組織塊用切片機(jī)切成一定的厚度(一般為4m)的薄片稱為切片。切片機(jī)多為輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)或平推式滑動(dòng)切片機(jī)。2、展片：將已切妥的切片在溫水中鋪展平整后，用載玻片撈起附貼其上稱為展片。3、烤片稍晾干后再用烤片機(jī)烤片，使其牢固附著，稱為烤片。冰凍切片技術(shù)冰凍切片在組織學(xué)技術(shù)中應(yīng)用范圍較廣，對(duì)病理學(xué)中的臨床手術(shù)的快速診斷其意義更大。 冰凍切片多用于新鮮組織，甲醛固定組織和冰箱冷藏組織等。組織塊不經(jīng)任何包埋劑而直接放在制冷臺(tái)上冷卻后再進(jìn)行切片。一、冷凍

12、切片的目的1、在手術(shù)進(jìn)行中的病理確定。2、了解淋巴結(jié)內(nèi)是否有轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞，或轉(zhuǎn)移的程度。3、了解惡性腫瘤手術(shù)范圍。4、診斷剖腹探查時(shí)所發(fā)現(xiàn)的異樣組織。5、顯示組織中的脂肪和脂類物質(zhì)。如脂肪瘤及肉瘤，某些科研組織等。6、某些酶的顯示。7、神經(jīng)病理學(xué)技術(shù)中的某些染色法。8、免疫熒光的研究。 二、實(shí)驗(yàn)方法1、準(zhǔn)備：將儀器打開，樣品臺(tái)溫度調(diào)至-40。2、取材：組織必須新鮮，盡可能不經(jīng)水洗。取材時(shí)應(yīng)避免組織擠壓，防止人為假象 。樣品大小553mm。3、速凍：將樣品放在樣品臺(tái)上，樣品四周加水加固，冷凍510min。4、切片：升高溫度至- 15（視樣品而定），約5min后開始切片，厚度615m。5、 制片

13、：將切片直接放在載玻片上。6、 固定液（丙酮）中固定12min。7、染色觀察 8、記錄：將觀察的結(jié)果記錄實(shí)驗(yàn)報(bào)告上。切片溫度的設(shè)定原則：1、柔軟、含水較多的組織設(shè)定溫度高。2、致密、富含脂肪的設(shè)定溫度低。冰凍切片的特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：1、簡(jiǎn)便。2、快速。3、組織變化不大。4、能很好保存脂肪，類脂等成分。5、較完好地保存各種抗原活性及酶類。不足：1不容易做連續(xù)切片。2切取的組織不能過大。3不容易制作較薄的切片。4組織結(jié)構(gòu)不如石蠟切片清晰。超薄切片的制作技術(shù)簡(jiǎn)介一、透射電鏡樣品制作操作流程取材漂洗（生理鹽水）前固定（2.5%戊二醛，4C冰箱2小時(shí)以上）漂洗（0.1M 磷酸緩沖液，3次，45分鐘）后固定(1%鋨酸1小時(shí)左右)漂洗（0.1M 磷酸緩沖液，3次，45分鐘）塊染（1%醋酸鈾2小時(shí)）梯度脫水（50%、70%、80%、90%、100%丙酮各15分鐘， 100% 2次，各10分鐘）浸透（丙酮：包埋液=1：1，37 C烘箱2小時(shí)；丙酮：包埋液=1：4， 37