氨基酸發(fā)酵生產工藝學 (2)ppt課件

1、氨基酸消費工藝 氨基酸是構成蛋白成分 目前世界上可用發(fā)酵法消費氨基酸有20多種。氨基酸 碳原子分別以共價鍵銜接氫原子、羧基和氨基及側鏈。側鏈不同，氨基酸的性質不同。氨基酸的用途 1.食品工業(yè)： 強化食品(賴氨酸，蘇氨酸，色氨酸于小麥中) 增鮮劑：谷氨酸單鈉和天冬氨酸 苯丙氨酸與天冬氨酸可用于制造低熱量二肽甜味劑(-天冬酰苯丙氨酸甲酯),此產品1981年獲FDA同意,如今每年產量已達數萬噸。 2.飼料工業(yè)： 甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造動物飼料 3.醫(yī)藥工業(yè)： 多種復合氨基酸制劑可經過輸液治療營養(yǎng)或代謝失調 苯丙氨酸與氮芥子氣合成的苯丙氨酸氮芥子氣對骨髓腫瘤治療有效,且副作用低。 4.化學工業(yè)

2、：谷氨基鈉作洗滌劑,丙氨酸制造丙氨酸纖維。氨基酸的消費方法 發(fā)酵法： 直接發(fā)酵法：野生菌株發(fā)酵、營養(yǎng)缺陷型突變發(fā)酵、抗氨基酸構造類似物突變株發(fā)酵、抗氨基酸構造類似物突變株的營養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)酵和營養(yǎng)缺陷型回復突變株發(fā)酵。 添加前體法 酶法：利用微生物細胞或微生物產生的酶來制造氨基酸。 提取法：蛋白質水解，從水解液中提取。胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸 合成法：DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。 傳統(tǒng)的提取法、酶法和化學合成法由于前體物的本錢高,工藝復雜,難以到達工業(yè)化消費的目的。 消費氨基酸的大國為日本和德國。 日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵及德國的德固沙是世界氨基酸消費的三巨頭。它們能消費高質量的氨基

3、酸,可直接用于輸液制劑的消費。 日本在美國、法國等建立了合資的氨基酸消費廠家,消費氨基酸和天冬甜精等衍生物。 國內消費氨基酸的廠家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司,但目前無論消費規(guī)模及產質量量還難于與國外抗衡。 在80年代中后期,我國從日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵以技貿協(xié)作的方式引進輸液制劑的制造技術和仿造產品,1991年銷售量為二千萬瓶,1996年達六千萬瓶,主要廠家有無錫華瑞,北京費森尤斯,昆明康普萊特,但消費原料都依賴進口。 據專家估計,到2000年,世界氨基酸產值可達45億美圓,占生物技術市場的7%,國內的氨基酸產值可達40億元,占全國發(fā)酵產業(yè)總產值的12%。 氨基酸發(fā)酵消費開展的歷

4、史回想 所謂氨基酸發(fā)酵,就是以糖類和銨鹽為主要原料的培育基中培育微生物,積累特定的氨基酸。 這些方法成立的一個重要緣由是運用選育成的氨基酸生物合成高才干的菌株。菌株的育種 從自然界中挑選有產酸才干的菌株,并建立其培育條件. 在確立突變技術和闡明氨基酸生物合成系統(tǒng)調理機制的根底上開展為營養(yǎng)缺陷變異株、抗藥性菌株的育種。 隨著重組DNA技術的開展,接合、轉導、轉染、細胞交融等手段首先用于體內基因重組,是早期用基因重組方法構建消費菌株的嘗試。 隨著載體、受體系統(tǒng)的構建及體外基因重組技術的日益完善,氨基酸生物工程菌的構建有了長足的開展。 蘇氨酸等的消費菌株被勝利地構建并運用于工業(yè)化消費。2.1用野生株

5、的方法 這是從自然界獲得的分別菌株進展發(fā)酵消費的一種方法。 典型的例子就是谷氨酸發(fā)酵。 改動培育條件的發(fā)酵轉換法中,有變化銨離子濃度、磷酸濃度，使谷氨酸轉向谷氨酰胺和纈氨酸發(fā)酵 2.2用營養(yǎng)缺陷變異株的方法 這一方法是誘變出菌體內氨基酸生物合成某步反響阻遏的營養(yǎng)缺陷型變異體，使生物合成在中途停頓，不讓最終產物起控制造用。 這種方法中有用高絲氨酸缺陷株的賴氨酸發(fā)酵，有用精氨酸缺陷株的鳥氨酸發(fā)酵，還有用異亮氨酸缺陷株的脯氨酸發(fā)酵。 2.3類似物抗性變異株的方法 用一種與本人想獲得的氨基酸構造相類似的化合物參與培育基內，使其發(fā)生控制造用，從而抑制微生物的生長。這樣，就可以得到在這種培育基中可以生長的

6、變異株，而這種變異株正是解除了調控機制的，可以生成過量的氨基酸。 利用此方法發(fā)酵的有:蘇氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、組氨酸和精氨酸。 2.4 體內及體外基因重組的方法 基因工程包括細胞內基因重組方法和試管內的體外基因重組方法。 體內基因重組在運用上又稱為雜交育種，主要方法包括：轉化、轉染、接合轉移、轉導和細胞交融等，這都是在細胞內暫時地產生染色體的部分二倍體，在兩條DNA鏈之間引起兩次以上的交叉，是遺傳性重組景象。 細胞內基因重組技術的缺陷是，如今只在同種或有近緣關系的微生物之間進展并較難勝利。 代謝工程在闡明代謝途徑及其調控規(guī)律的根底上，運用重組DNA技術可以改動代謝途徑分支點上的流量或引入新的

7、代謝步驟與構建新的代謝網絡。 其主要步驟為: 鑒定目的代謝途徑涉及的酶(特別是限速酶); 獲得酶基因，必要時可用蛋白質工程技術，如定點誘變，基因剪接等，使蛋白具有新的特點(加強活性或穩(wěn)定性、解除反響抑制等); 將一種或多種異源的或改造后的酶基因與調理元件一同克隆進目的生物; 使調理元件的作用及培育條件最優(yōu)化。 3.1載體-受體系統(tǒng)及克隆表達的研討 3.1.1受體的獲得 目前運用的氨基酸工程菌受體主要是大腸桿菌K-12及棒狀桿菌家族，通常是經過誘變選育出的根底產率較高的菌株。 大腸桿菌遺傳背景研討得清楚，載體系統(tǒng)完善，利于工程菌的構建，但它含有內毒素且不能將蛋白產物分泌至胞外，為運用帶來困難。

8、棒狀桿菌能抑制這兩個缺陷，但載體受體系統(tǒng)研討較晚且有限制修飾系統(tǒng)的妨礙，所以獲得利于外源基因導入及表達且能穩(wěn)定遺傳的受體菌是尚待處理的問題。 3.1.2載體的構建 有效的載體需求有在受體菌中可啟動的復制起始位點，這可從棒狀桿菌家族內源小質粒中獲得; 載體所需的挑選標志及外源基因插入的多克隆位點，可從常用的克隆載體中獲得。 3.1.3基因轉移手段 由于棒狀桿菌是革蘭氏陽性菌，CaCl2轉化法對它不適用。 通常采用的方法有:原生質體轉化、轉導，電轉化，接合轉移。 原生質體轉化的方法是較早采用的方法，由于遭到原生質體再生條件的局限，效率不高; 電轉化方法由于高效，快速被廣泛運用，目前它的轉化效率可到

9、達原生質體轉化法的1001000倍。 接合轉移可用于基因在親緣關系遠的物種之間的轉移，并且可將外源基因整合于染色體上，易于穩(wěn)定遺傳。 氨基酸發(fā)酵的代謝控制 控制發(fā)酵的條件 控制細胞浸透性 控制旁路代謝 降低反響作用物的濃度 消除終產物的反響抑制與阻遏作用 促進ATP的積累，以利氨基酸的生物合成控制發(fā)酵的條件 專性需氧菌，控制環(huán)境條件可改動代謝途徑和產物?？刂萍毎感陨锼亍⒂退岷屯獗砘钚詣?，引起細胞膜的脂肪酸成分的改動。青霉素：抑制細胞壁的合成，由于細胞面內外的浸透壓而泄顯露來?？刂婆月反x降低反響作用物的濃度 利用營養(yǎng)缺陷型突變株進展氨基酸發(fā)酵必需限制所要求的氨基酸的量。限制精氨酸的濃度可

10、解除反響抑制，實現鳥氨酸的生物合成。消除終產物的反響抑制與阻遏作用 運用抗氨基酸構造類似物突變株的方法。促進ATP的積累，以利氨基酸的生物合成 ATP的積累可促進氨基酸的生物合成氨基酸發(fā)酵的工藝控制 培育基 pH 溫度 氧培育基 1、碳源：淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、乙醇、烷烴 碳源濃度過高時，對菌體生長不利，氨基酸的轉化率降低。 菌種性質、消費氨基酸種類和所采用的發(fā)酵操作決議碳源種類2、氮源：銨鹽、尿素、氨水；同時調整pH值。營養(yǎng)缺陷型添加適量氨基酸主要以添加有機氮源水解液。需生物素和氨基酸，以玉米漿作氮源。尿素滅菌時構成磷酸銨鎂鹽，須單獨滅菌。可分批流加。氨水用pH自動控制延續(xù)流加 3、適宜C

11、/N 氮源用于調整pH。 合成菌體 生成氨基酸，因此比普通微生物發(fā)酵的C/N高。 4、磷酸鹽：對發(fā)酵有顯著影響。缺乏時糖代謝受抑制。 5、鎂：是已糖磷酸化酶、檸檬酸脫氫酶和羧化酶的激活劑，并促進葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活力。 6、鉀：促進糖代謝。谷氨酸產酸期鉀多利于產酸，鉀少利于菌體生長。 7、鈉：調理浸透壓作用，普通在調理pH值時參與。 8、錳：是許多酶的激活劑。 9、鐵：是細胞色素、細胞色素氧化酶和過氧化氫酶的活性基的組成分，可促進谷氨酸產生菌的生長。 10、銅離子：對氨基酸發(fā)酵有明顯毒害作用。 生長因子：生物素 作用：影響細胞膜透性和代謝途徑。 濃度：過多促進菌體生長，氨基酸產量低。過少菌

12、體生長緩慢，發(fā)酵周期長。 與其它培育條件的關系：氧供應缺乏，生物素過量時，發(fā)酵向其它途徑轉化。 種類：玉米漿、麩皮水解液、甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜為來源。pH對氨基酸發(fā)酵的影響及其控制 作用機理：主要影響酶的活性和菌的代謝。 控制pH方法：流加尿素和氨水 流加方式：根據菌體生長、pH變化、糖耗情況和發(fā)酵階段等要素決議。 控制： 1菌體生長或耗糖慢時，少量多次流加尿素，防止pH過高 2菌體生長或耗糖過快時，流加尿素可多些，以抑制菌體生長。 3發(fā)酵后期，殘?zhí)巧?，接近放罐時，少加或不加尿素，以免呵斥氨基酸提取困難。 4氨水對pH影響大，應采取延續(xù)流加。溫度對氨基酸發(fā)酵的影響及其控制 菌體生長達一定程度后再

13、開場產生氨基酸，因此菌體生長最適溫度和氨基酸合成的最適溫度是不同的。 菌體生長溫度過高，那么菌體易衰老，pH高，糖耗慢，周期長，酸產量低。 采取措施：少量多次流加尿素，維持最適生長溫度，減少風量等，促進菌體生長。氧對氨基酸發(fā)酵的影響及其控制 要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸發(fā)酵：生物合成與TCA循環(huán)有關。 適宜在缺氧條件下進展的亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸發(fā)酵：菌體呼吸受阻時產量最大。 供氧缺乏時產酸受細微影響的天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵谷氨酸消費工藝 工業(yè)化消費開場于由水解小麥面筋或大豆蛋白質而制取。 1957年，日本率先采用微生物發(fā)酵法消費，并投入大規(guī)模工業(yè)化消費，這是被譽為現代發(fā)酵工業(yè)的艱苦創(chuàng)舉，使發(fā)

14、酵工業(yè)進入調理代謝的調控階段。 目前世界產谷氨酸鈉30噸/年，占氨基酸總量的2/3。 我國現已有200余家消費，年產量達15萬噸，居世界首位。 產生菌株特點： 革蘭氏陽性 不構成芽胞 沒有鞭毛，不能運動 需求生物素作為生長因子 在通氣條件下才干產生谷氨酸。 谷氨酸生物合成機理： 由三羧酸循環(huán)中產生的a-酮戊二酸，在谷氨酸脫氫酶和氫供體存在下進展復原性氨化作用而得到。 一、淀粉水解糖的制備：酸水解或酶水解 1、調漿：干淀粉用水調成10-11Bx的淀粉乳，加鹽酸0.5-0.8至pH1.5。 2、糖化：蒸汽加熱，加壓糖化25min。冷卻至80下中和。 3、中和：燒堿中和，至pH4.0-5.0 4、脫

15、色：活性炭脫色和脫色樹脂?；钚蕴坑昧繛?.6-0.8，在70度及酸性條件下攪拌后過濾。 酶法糖化：以大米或碎米為原料時采用 大米進展浸泡磨漿，再調成15Bx，調pH6.0，加細菌a-淀粉酶進展液化，85 30min，加糖化酶60 糖化24h，過濾后可供配制培育基。 糖蜜原料：不宜直接用來作為谷氨酸發(fā)酵的碳源，因含豐富的生物素。 預處置方法：活性碳或樹脂吸附法和亞硝酸法吸附或破壞生物素。也可以在發(fā)酵液中參與外表活性劑吐溫60或添加中青霉素。 二、菌種擴展培育 1、斜面培育：主要產生菌是棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬、節(jié)桿菌屬。 我國各工廠目前運用的菌株主要是鈍齒棒桿菌和北京棒桿菌及各種誘變株。

16、生長特點：適用于糖質原料，需氧，以生物素為生長因子。 斜面培育基：蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉組成的pH7.0-7.2瓊脂培育基，32培育18-24h。 2、一級種子培育：由葡萄糖、玉米漿、尿素、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鐵及硫酸錳組成。pH6.5-6.8。1000ml裝200-250ml振蕩，32 培育12h。 3、二級種子培育：用種子罐培育，料液量為發(fā)酵罐投料體積的1，用水解糖替代葡萄糖，于32 進展通氣攪拌7-10h。種子質量要求：二級種子培育終了時，無雜菌或噬菌體污染，菌體大小均一，呈單個或八字陳列。活菌數為108-109 /ml。三、谷氨酸發(fā)酵 1、順應期：尿素分解出氨使pH上升。糖不利用。

17、2-4h。 措施：接種量和發(fā)酵條件控制使期縮短。 2、對數生長期：糖耗快，尿素大量分解使pH上升，氨被利用pH又迅速下降。溶氧急劇下降后維持在一定程度。菌體濃度迅速增大，菌體形狀為陳列整齊的八字形。不產酸。12h。 措施：及時供應菌體生長必需的氮源及調理pH，在pH7.5-8.0時流加尿素；維持溫度30- 32 3、菌體生長停頓期：谷氨酸合成。 措施：提供必需的氨及pH維持在7.2-7.4。大量通氣，控制溫度34-37 。 4、發(fā)酵后期：菌體衰老，糖耗慢，殘?zhí)堑汀?措施：營養(yǎng)物耗盡酸濃度不添加時，及時放罐。 發(fā)酵周期普通為30h。谷氨酸發(fā)酵控制 1生物素：作為催化脂肪酸生物合成最初反響的關鍵酶

18、乙酰CoA的輔酶，參與脂肪酸的生物合在，進而影響磷酯的合成。 當磷酯含量減少到正常時的一半左右時，細胞發(fā)生變形，谷氨酸可以從胞內滲出，積累于發(fā)酵液中。 生物素過量，那么發(fā)酵過程菌體大量繁衍，不產或少產谷氨酸，他謝產物中乳酸和琥珀酸明顯增多。 2種齡和種量的控制 一級種子控制在11-12h，二級控制在7-8h。 種量為1。過多，菌體柔嫩，不強健，提早衰老自溶，后期產酸量不高。 3pH。 發(fā)酵前期，幼齡細胞對pH較敏感，pH過低，菌體生長旺盛，營養(yǎng)成分耗費大，轉入正常發(fā)酵慢，長菌不長酸。 谷氨酸脫氫酶最適pH為7.0-7.2，轉氨酶最適pH 7.2-7.4。在發(fā)酵中后期，堅持pH不變。過高轉為谷氨酰胺，過低氨離子缺乏。 4通風：不同種齡、種量，培育基成分，發(fā)酵階段及發(fā)酵罐大小要求通風量不同。 在長菌體階段，通風量過大，生物素缺乏，抑制菌體生長。 在發(fā)酵產酸階段，需求大量通風供氧，以防過量生成乳酸和琥珀酸，但過大通風，那么大量積累a-酮戊二酸。 防止噬菌體和雜菌的污染 從空氣過濾、培育基、設備、環(huán)境等環(huán)節(jié)嚴厲把關。四、谷氨酸的提取1、等電點法：操作簡單，收率60。周期長，占地面積大。 2、離子交換法：用陽離子交換樹脂提取吸附谷氨酸構成的