氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)工藝學(xué) (2)ppt課件

1、氨基酸消費(fèi)工藝 氨基酸是構(gòu)成蛋白成分 目前世界上可用發(fā)酵法消費(fèi)氨基酸有20多種。氨基酸 碳原子分別以共價(jià)鍵銜接氫原子、羧基和氨基及側(cè)鏈。側(cè)鏈不同，氨基酸的性質(zhì)不同。氨基酸的用途 1.食品工業(yè)： 強(qiáng)化食品(賴氨酸，蘇氨酸，色氨酸于小麥中) 增鮮劑：谷氨酸單鈉和天冬氨酸 苯丙氨酸與天冬氨酸可用于制造低熱量二肽甜味劑(-天冬酰苯丙氨酸甲酯),此產(chǎn)品1981年獲FDA同意,如今每年產(chǎn)量已達(dá)數(shù)萬(wàn)噸。 2.飼料工業(yè)： 甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造動(dòng)物飼料 3.醫(yī)藥工業(yè)： 多種復(fù)合氨基酸制劑可經(jīng)過(guò)輸液治療營(yíng)養(yǎng)或代謝失調(diào) 苯丙氨酸與氮芥子氣合成的苯丙氨酸氮芥子氣對(duì)骨髓腫瘤治療有效,且副作用低。 4.化學(xué)工業(yè)

2、：谷氨基鈉作洗滌劑,丙氨酸制造丙氨酸纖維。氨基酸的消費(fèi)方法 發(fā)酵法： 直接發(fā)酵法：野生菌株發(fā)酵、營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變發(fā)酵、抗氨基酸構(gòu)造類似物突變株發(fā)酵、抗氨基酸構(gòu)造類似物突變株的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)酵和營(yíng)養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變株發(fā)酵。 添加前體法 酶法：利用微生物細(xì)胞或微生物產(chǎn)生的酶來(lái)制造氨基酸。 提取法：蛋白質(zhì)水解，從水解液中提取。胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸 合成法：DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。 傳統(tǒng)的提取法、酶法和化學(xué)合成法由于前體物的本錢高,工藝復(fù)雜,難以到達(dá)工業(yè)化消費(fèi)的目的。 消費(fèi)氨基酸的大國(guó)為日本和德國(guó)。 日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵及德國(guó)的德固沙是世界氨基酸消費(fèi)的三巨頭。它們能消費(fèi)高質(zhì)量的氨基

3、酸,可直接用于輸液制劑的消費(fèi)。 日本在美國(guó)、法國(guó)等建立了合資的氨基酸消費(fèi)廠家,消費(fèi)氨基酸和天冬甜精等衍生物。 國(guó)內(nèi)消費(fèi)氨基酸的廠家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司,但目前無(wú)論消費(fèi)規(guī)模及產(chǎn)質(zhì)量量還難于與國(guó)外抗衡。 在80年代中后期,我國(guó)從日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵以技貿(mào)協(xié)作的方式引進(jìn)輸液制劑的制造技術(shù)和仿造產(chǎn)品,1991年銷售量為二千萬(wàn)瓶,1996年達(dá)六千萬(wàn)瓶,主要廠家有無(wú)錫華瑞,北京費(fèi)森尤斯,昆明康普萊特,但消費(fèi)原料都依賴進(jìn)口。 據(jù)專家估計(jì),到2000年,世界氨基酸產(chǎn)值可達(dá)45億美圓,占生物技術(shù)市場(chǎng)的7%,國(guó)內(nèi)的氨基酸產(chǎn)值可達(dá)40億元,占全國(guó)發(fā)酵產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值的12%。 氨基酸發(fā)酵消費(fèi)開(kāi)展的歷

4、史回想 所謂氨基酸發(fā)酵,就是以糖類和銨鹽為主要原料的培育基中培育微生物,積累特定的氨基酸。 這些方法成立的一個(gè)重要緣由是運(yùn)用選育成的氨基酸生物合成高才干的菌株。菌株的育種 從自然界中挑選有產(chǎn)酸才干的菌株,并建立其培育條件. 在確立突變技術(shù)和闡明氨基酸生物合成系統(tǒng)調(diào)理機(jī)制的根底上開(kāi)展為營(yíng)養(yǎng)缺陷變異株、抗藥性菌株的育種。 隨著重組DNA技術(shù)的開(kāi)展,接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)染、細(xì)胞交融等手段首先用于體內(nèi)基因重組,是早期用基因重組方法構(gòu)建消費(fèi)菌株的嘗試。 隨著載體、受體系統(tǒng)的構(gòu)建及體外基因重組技術(shù)的日益完善,氨基酸生物工程菌的構(gòu)建有了長(zhǎng)足的開(kāi)展。 蘇氨酸等的消費(fèi)菌株被勝利地構(gòu)建并運(yùn)用于工業(yè)化消費(fèi)。2.1用野生株

5、的方法 這是從自然界獲得的分別菌株進(jìn)展發(fā)酵消費(fèi)的一種方法。 典型的例子就是谷氨酸發(fā)酵。 改動(dòng)培育條件的發(fā)酵轉(zhuǎn)換法中,有變化銨離子濃度、磷酸濃度，使谷氨酸轉(zhuǎn)向谷氨酰胺和纈氨酸發(fā)酵 2.2用營(yíng)養(yǎng)缺陷變異株的方法 這一方法是誘變出菌體內(nèi)氨基酸生物合成某步反響阻遏的營(yíng)養(yǎng)缺陷型變異體，使生物合成在中途停頓，不讓最終產(chǎn)物起控制造用。 這種方法中有用高絲氨酸缺陷株的賴氨酸發(fā)酵，有用精氨酸缺陷株的鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵，還有用異亮氨酸缺陷株的脯氨酸發(fā)酵。 2.3類似物抗性變異株的方法 用一種與本人想獲得的氨基酸構(gòu)造相類似的化合物參與培育基內(nèi)，使其發(fā)生控制造用，從而抑制微生物的生長(zhǎng)。這樣，就可以得到在這種培育基中可以生長(zhǎng)的

6、變異株，而這種變異株正是解除了調(diào)控機(jī)制的，可以生成過(guò)量的氨基酸。 利用此方法發(fā)酵的有:蘇氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、組氨酸和精氨酸。 2.4 體內(nèi)及體外基因重組的方法 基因工程包括細(xì)胞內(nèi)基因重組方法和試管內(nèi)的體外基因重組方法。 體內(nèi)基因重組在運(yùn)用上又稱為雜交育種，主要方法包括：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、接合轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞交融等，這都是在細(xì)胞內(nèi)暫時(shí)地產(chǎn)生染色體的部分二倍體，在兩條DNA鏈之間引起兩次以上的交叉，是遺傳性重組景象。 細(xì)胞內(nèi)基因重組技術(shù)的缺陷是，如今只在同種或有近緣關(guān)系的微生物之間進(jìn)展并較難勝利。 代謝工程在闡明代謝途徑及其調(diào)控規(guī)律的根底上，運(yùn)用重組DNA技術(shù)可以改動(dòng)代謝途徑分支點(diǎn)上的流量或引入新的

7、代謝步驟與構(gòu)建新的代謝網(wǎng)絡(luò)。 其主要步驟為: 鑒定目的代謝途徑涉及的酶(特別是限速酶); 獲得酶基因，必要時(shí)可用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，如定點(diǎn)誘變，基因剪接等，使蛋白具有新的特點(diǎn)(加強(qiáng)活性或穩(wěn)定性、解除反響抑制等); 將一種或多種異源的或改造后的酶基因與調(diào)理元件一同克隆進(jìn)目的生物; 使調(diào)理元件的作用及培育條件最優(yōu)化。 3.1載體-受體系統(tǒng)及克隆表達(dá)的研討 3.1.1受體的獲得 目前運(yùn)用的氨基酸工程菌受體主要是大腸桿菌K-12及棒狀桿菌家族，通常是經(jīng)過(guò)誘變選育出的根底產(chǎn)率較高的菌株。 大腸桿菌遺傳背景研討得清楚，載體系統(tǒng)完善，利于工程菌的構(gòu)建，但它含有內(nèi)毒素且不能將蛋白產(chǎn)物分泌至胞外，為運(yùn)用帶來(lái)困難。

8、棒狀桿菌能抑制這兩個(gè)缺陷，但載體受體系統(tǒng)研討較晚且有限制修飾系統(tǒng)的妨礙，所以獲得利于外源基因?qū)爰氨磉_(dá)且能穩(wěn)定遺傳的受體菌是尚待處理的問(wèn)題。 3.1.2載體的構(gòu)建 有效的載體需求有在受體菌中可啟動(dòng)的復(fù)制起始位點(diǎn)，這可從棒狀桿菌家族內(nèi)源小質(zhì)粒中獲得; 載體所需的挑選標(biāo)志及外源基因插入的多克隆位點(diǎn)，可從常用的克隆載體中獲得。 3.1.3基因轉(zhuǎn)移手段 由于棒狀桿菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，CaCl2轉(zhuǎn)化法對(duì)它不適用。 通常采用的方法有:原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)，電轉(zhuǎn)化，接合轉(zhuǎn)移。 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法是較早采用的方法，由于遭到原生質(zhì)體再生條件的局限，效率不高; 電轉(zhuǎn)化方法由于高效，快速被廣泛運(yùn)用，目前它的轉(zhuǎn)化效率可到

9、達(dá)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法的1001000倍。 接合轉(zhuǎn)移可用于基因在親緣關(guān)系遠(yuǎn)的物種之間的轉(zhuǎn)移，并且可將外源基因整合于染色體上，易于穩(wěn)定遺傳。 氨基酸發(fā)酵的代謝控制 控制發(fā)酵的條件 控制細(xì)胞浸透性 控制旁路代謝 降低反響作用物的濃度 消除終產(chǎn)物的反響抑制與阻遏作用 促進(jìn)ATP的積累，以利氨基酸的生物合成控制發(fā)酵的條件 專性需氧菌，控制環(huán)境條件可改動(dòng)代謝途徑和產(chǎn)物。控制細(xì)胞浸透性生物素、油酸和外表活性劑，引起細(xì)胞膜的脂肪酸成分的改動(dòng)。青霉素：抑制細(xì)胞壁的合成，由于細(xì)胞面內(nèi)外的浸透壓而泄顯露來(lái)?？刂婆月反x降低反響作用物的濃度 利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株進(jìn)展氨基酸發(fā)酵必需限制所要求的氨基酸的量。限制精氨酸的濃度可

10、解除反響抑制，實(shí)現(xiàn)鳥(niǎo)氨酸的生物合成。消除終產(chǎn)物的反響抑制與阻遏作用 運(yùn)用抗氨基酸構(gòu)造類似物突變株的方法。促進(jìn)ATP的積累，以利氨基酸的生物合成 ATP的積累可促進(jìn)氨基酸的生物合成氨基酸發(fā)酵的工藝控制 培育基 pH 溫度 氧培育基 1、碳源：淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、乙醇、烷烴 碳源濃度過(guò)高時(shí)，對(duì)菌體生長(zhǎng)不利，氨基酸的轉(zhuǎn)化率降低。 菌種性質(zhì)、消費(fèi)氨基酸種類和所采用的發(fā)酵操作決議碳源種類2、氮源：銨鹽、尿素、氨水；同時(shí)調(diào)整pH值。營(yíng)養(yǎng)缺陷型添加適量氨基酸主要以添加有機(jī)氮源水解液。需生物素和氨基酸，以玉米漿作氮源。尿素滅菌時(shí)構(gòu)成磷酸銨鎂鹽，須單獨(dú)滅菌?？煞峙骷?。氨水用pH自動(dòng)控制延續(xù)流加 3、適宜C

11、/N 氮源用于調(diào)整pH。 合成菌體 生成氨基酸，因此比普通微生物發(fā)酵的C/N高。 4、磷酸鹽：對(duì)發(fā)酵有顯著影響。缺乏時(shí)糖代謝受抑制。 5、鎂：是已糖磷酸化酶、檸檬酸脫氫酶和羧化酶的激活劑，并促進(jìn)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活力。 6、鉀：促進(jìn)糖代謝。谷氨酸產(chǎn)酸期鉀多利于產(chǎn)酸，鉀少利于菌體生長(zhǎng)。 7、鈉：調(diào)理浸透壓作用，普通在調(diào)理pH值時(shí)參與。 8、錳：是許多酶的激活劑。 9、鐵：是細(xì)胞色素、細(xì)胞色素氧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性基的組成分，可促進(jìn)谷氨酸產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)。 10、銅離子：對(duì)氨基酸發(fā)酵有明顯毒害作用。 生長(zhǎng)因子：生物素 作用：影響細(xì)胞膜透性和代謝途徑。 濃度：過(guò)多促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，氨基酸產(chǎn)量低。過(guò)少菌

12、體生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵周期長(zhǎng)。 與其它培育條件的關(guān)系：氧供應(yīng)缺乏，生物素過(guò)量時(shí)，發(fā)酵向其它途徑轉(zhuǎn)化。 種類：玉米漿、麩皮水解液、甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜為來(lái)源。pH對(duì)氨基酸發(fā)酵的影響及其控制 作用機(jī)理：主要影響酶的活性和菌的代謝。 控制pH方法：流加尿素和氨水 流加方式：根據(jù)菌體生長(zhǎng)、pH變化、糖耗情況和發(fā)酵階段等要素決議。 控制： 1菌體生長(zhǎng)或耗糖慢時(shí)，少量多次流加尿素，防止pH過(guò)高 2菌體生長(zhǎng)或耗糖過(guò)快時(shí)，流加尿素可多些，以抑制菌體生長(zhǎng)。 3發(fā)酵后期，殘?zhí)巧?，接近放罐時(shí)，少加或不加尿素，以免呵斥氨基酸提取困難。 4氨水對(duì)pH影響大，應(yīng)采取延續(xù)流加。溫度對(duì)氨基酸發(fā)酵的影響及其控制 菌體生長(zhǎng)達(dá)一定程度后再

13、開(kāi)場(chǎng)產(chǎn)生氨基酸，因此菌體生長(zhǎng)最適溫度和氨基酸合成的最適溫度是不同的。 菌體生長(zhǎng)溫度過(guò)高，那么菌體易衰老，pH高，糖耗慢，周期長(zhǎng)，酸產(chǎn)量低。 采取措施：少量多次流加尿素，維持最適生長(zhǎng)溫度，減少風(fēng)量等，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)。氧對(duì)氨基酸發(fā)酵的影響及其控制 要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸發(fā)酵：生物合成與TCA循環(huán)有關(guān)。 適宜在缺氧條件下進(jìn)展的亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸發(fā)酵：菌體呼吸受阻時(shí)產(chǎn)量最大。 供氧缺乏時(shí)產(chǎn)酸受細(xì)微影響的天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵谷氨酸消費(fèi)工藝 工業(yè)化消費(fèi)開(kāi)場(chǎng)于由水解小麥面筋或大豆蛋白質(zhì)而制取。 1957年，日本率先采用微生物發(fā)酵法消費(fèi)，并投入大規(guī)模工業(yè)化消費(fèi)，這是被譽(yù)為現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)的艱苦創(chuàng)舉，使發(fā)

14、酵工業(yè)進(jìn)入調(diào)理代謝的調(diào)控階段。 目前世界產(chǎn)谷氨酸鈉30噸/年，占氨基酸總量的2/3。 我國(guó)現(xiàn)已有200余家消費(fèi)，年產(chǎn)量達(dá)15萬(wàn)噸，居世界首位。 產(chǎn)生菌株特點(diǎn)： 革蘭氏陽(yáng)性 不構(gòu)成芽胞 沒(méi)有鞭毛，不能運(yùn)動(dòng) 需求生物素作為生長(zhǎng)因子 在通氣條件下才干產(chǎn)生谷氨酸。 谷氨酸生物合成機(jī)理： 由三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生的a-酮戊二酸，在谷氨酸脫氫酶和氫供體存在下進(jìn)展復(fù)原性氨化作用而得到。 一、淀粉水解糖的制備：酸水解或酶水解 1、調(diào)漿：干淀粉用水調(diào)成10-11Bx的淀粉乳，加鹽酸0.5-0.8至pH1.5。 2、糖化：蒸汽加熱，加壓糖化25min。冷卻至80下中和。 3、中和：燒堿中和，至pH4.0-5.0 4、脫

15、色：活性炭脫色和脫色樹(shù)脂?；钚蕴坑昧繛?.6-0.8，在70度及酸性條件下攪拌后過(guò)濾。 酶法糖化：以大米或碎米為原料時(shí)采用 大米進(jìn)展浸泡磨漿，再調(diào)成15Bx，調(diào)pH6.0，加細(xì)菌a-淀粉酶進(jìn)展液化，85 30min，加糖化酶60 糖化24h，過(guò)濾后可供配制培育基。 糖蜜原料：不宜直接用來(lái)作為谷氨酸發(fā)酵的碳源，因含豐富的生物素。 預(yù)處置方法：活性碳或樹(shù)脂吸附法和亞硝酸法吸附或破壞生物素。也可以在發(fā)酵液中參與外表活性劑吐溫60或添加中青霉素。 二、菌種擴(kuò)展培育 1、斜面培育：主要產(chǎn)生菌是棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬、節(jié)桿菌屬。 我國(guó)各工廠目前運(yùn)用的菌株主要是鈍齒棒桿菌和北京棒桿菌及各種誘變株。

16、生長(zhǎng)特點(diǎn)：適用于糖質(zhì)原料，需氧，以生物素為生長(zhǎng)因子。 斜面培育基：蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉組成的pH7.0-7.2瓊脂培育基，32培育18-24h。 2、一級(jí)種子培育：由葡萄糖、玉米漿、尿素、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鐵及硫酸錳組成。pH6.5-6.8。1000ml裝200-250ml振蕩，32 培育12h。 3、二級(jí)種子培育：用種子罐培育，料液量為發(fā)酵罐投料體積的1，用水解糖替代葡萄糖，于32 進(jìn)展通氣攪拌7-10h。種子質(zhì)量要求：二級(jí)種子培育終了時(shí)，無(wú)雜菌或噬菌體污染，菌體大小均一，呈單個(gè)或八字陳列。活菌數(shù)為108-109 /ml。三、谷氨酸發(fā)酵 1、順應(yīng)期：尿素分解出氨使pH上升。糖不利用。

17、2-4h。 措施：接種量和發(fā)酵條件控制使期縮短。 2、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：糖耗快，尿素大量分解使pH上升，氨被利用pH又迅速下降。溶氧急劇下降后維持在一定程度。菌體濃度迅速增大，菌體形狀為陳列整齊的八字形。不產(chǎn)酸。12h。 措施：及時(shí)供應(yīng)菌體生長(zhǎng)必需的氮源及調(diào)理pH，在pH7.5-8.0時(shí)流加尿素；維持溫度30- 32 3、菌體生長(zhǎng)停頓期：谷氨酸合成。 措施：提供必需的氨及pH維持在7.2-7.4。大量通氣，控制溫度34-37 。 4、發(fā)酵后期：菌體衰老，糖耗慢，殘?zhí)堑汀?措施：營(yíng)養(yǎng)物耗盡酸濃度不添加時(shí)，及時(shí)放罐。 發(fā)酵周期普通為30h。谷氨酸發(fā)酵控制 1生物素：作為催化脂肪酸生物合成最初反響的關(guān)鍵酶

18、乙酰CoA的輔酶，參與脂肪酸的生物合在，進(jìn)而影響磷酯的合成。 當(dāng)磷酯含量減少到正常時(shí)的一半左右時(shí)，細(xì)胞發(fā)生變形，谷氨酸可以從胞內(nèi)滲出，積累于發(fā)酵液中。 生物素過(guò)量，那么發(fā)酵過(guò)程菌體大量繁衍，不產(chǎn)或少產(chǎn)谷氨酸，他謝產(chǎn)物中乳酸和琥珀酸明顯增多。 2種齡和種量的控制 一級(jí)種子控制在11-12h，二級(jí)控制在7-8h。 種量為1。過(guò)多，菌體柔嫩，不強(qiáng)健，提早衰老自溶，后期產(chǎn)酸量不高。 3pH。 發(fā)酵前期，幼齡細(xì)胞對(duì)pH較敏感，pH過(guò)低，菌體生長(zhǎng)旺盛，營(yíng)養(yǎng)成分耗費(fèi)大，轉(zhuǎn)入正常發(fā)酵慢，長(zhǎng)菌不長(zhǎng)酸。 谷氨酸脫氫酶最適pH為7.0-7.2，轉(zhuǎn)氨酶最適pH 7.2-7.4。在發(fā)酵中后期，堅(jiān)持pH不變。過(guò)高轉(zhuǎn)為谷氨酰胺，過(guò)低氨離子缺乏。 4通風(fēng)：不同種齡、種量，培育基成分，發(fā)酵階段及發(fā)酵罐大小要求通風(fēng)量不同。 在長(zhǎng)菌體階段，通風(fēng)量過(guò)大，生物素缺乏，抑制菌體生長(zhǎng)。 在發(fā)酵產(chǎn)酸階段，需求大量通風(fēng)供氧，以防過(guò)量生成乳酸和琥珀酸，但過(guò)大通風(fēng)，那么大量積累a-酮戊二酸。 防止噬菌體和雜菌的污染 從空氣過(guò)濾、培育基、設(shè)備、環(huán)境等環(huán)節(jié)嚴(yán)厲把關(guān)。四、谷氨酸的提取1、等電點(diǎn)法：操作簡(jiǎn)單，收率60。周期長(zhǎng)，占地面積大。 2、離子交換法：用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂提取吸附谷氨酸構(gòu)成的