生化校準(zhǔn)方法分析

1、 龍崗區(qū)中醫(yī)院 姜敬學(xué) 理論k值：根據(jù)摩爾系數(shù)（）來(lái)計(jì)算。通常試劑生產(chǎn)降價(jià)給出的k值都屬于此。 實(shí)測(cè)k值：是根據(jù)儀器當(dāng)前的實(shí)際狀態(tài)，試劑的穩(wěn)定性等因子數(shù)測(cè)得的值。 校準(zhǔn)k值：通過(guò)高質(zhì)量校準(zhǔn)直接校準(zhǔn)得到的k值 K因數(shù)法適用的分析方法有一點(diǎn)終點(diǎn)法，兩點(diǎn)終點(diǎn)法，兩點(diǎn)速率法，多點(diǎn)速率法。 K=SV/TV & .1*106線(xiàn)性?xún)牲c(diǎn)法非線(xiàn)性法：又稱(chēng)非直線(xiàn)性校準(zhǔn)法 非線(xiàn)性法包括logit-log法、指數(shù)函數(shù)法、樣條函數(shù)法等方法Logit-log3p對(duì)數(shù)函數(shù)法中的一種，適用于濃度升高而吸光度表現(xiàn)為收束的工作曲線(xiàn)。P表示參數(shù)之意，由3個(gè)參數(shù)（S1Abs、k、a）參與計(jì)算。S1Abs表示試劑空白，K表示校準(zhǔn)所得斜

2、率，a表示近似常數(shù)。、logit-log4p對(duì)數(shù)函數(shù)法中的一種，適用于濃度升高而吸光度表現(xiàn)為收束的工作曲線(xiàn)。P表示參數(shù)之意，由4個(gè)參數(shù)（S1Abs、k、a、b）參與計(jì)算。S1Abs表示試劑空白，K表示校準(zhǔn)所得斜率，a表示近似常數(shù)。logit-log5p對(duì)數(shù)函數(shù)法中的一種，適用于濃度升高而吸光度表現(xiàn)為收束較明顯的工作曲線(xiàn)。P表示參數(shù)之意，由5個(gè)參數(shù)（S1Abs、k、a、b、c）參與計(jì)算。S1Abs表示試劑空白，K表示校準(zhǔn)所得斜率，a表示近似常數(shù)。而使結(jié)果更加精確。指數(shù)函數(shù)法（exponential）是適用于隨標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度增加，而測(cè)定的吸光度值呈現(xiàn)分散狀態(tài)的趨勢(shì)。 5個(gè)參數(shù)（S1Abs、k、a、b

3、、c） 樣條函數(shù)法（spline）：是將每一標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定的吸光度連接起來(lái)（點(diǎn)對(duì)點(diǎn)），形成一個(gè)完整曲線(xiàn)，即為曲線(xiàn)擬合。該曲線(xiàn)擬合優(yōu)于折線(xiàn)法校準(zhǔn)。由4個(gè)近似常數(shù)a（l），b（l）c（l），d（l）參與計(jì)算。折線(xiàn)法（line Graph）：是將標(biāo)準(zhǔn)液1-6的吸光度值多用條直線(xiàn)連接起來(lái)的工作曲線(xiàn)。 s1Abs、k1; s2Abs、k2; s2Abs、k2; s3Abs、k3; s4Abs、k4; s5Abs、k5;參與計(jì)算。 Logit-log3p適用于一點(diǎn)終點(diǎn)法、兩點(diǎn)速率法和兩點(diǎn)終點(diǎn)法等分析方法。 logit-log4p適用于一點(diǎn)終點(diǎn)法、兩點(diǎn)速率法、兩點(diǎn)終點(diǎn)法、三點(diǎn)雙項(xiàng)目分析法、速率法A、

4、速率法B等分析方法。 Logit-log5p適用于一點(diǎn)終點(diǎn)法、兩點(diǎn)速率法、兩點(diǎn)終點(diǎn)法、速率A等分析方法。 樣條函數(shù)法是為N個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，（N）有多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液（N1）之間的范圍適應(yīng)于前后的測(cè)定值并使之接近，總體成為一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，需用樣條函數(shù)擬合的校準(zhǔn)方法。 樣條函數(shù)法適用于多點(diǎn)定標(biāo)。 通常，生化分析儀器都設(shè)置有樣品最小用量和最小體積，如日立7170反應(yīng)體積為180-380ul，最大體積為570ul，最小吸樣量2ul，在不影響結(jié)果的準(zhǔn)確度，精密度的前提下，可適當(dāng)調(diào)整樣品和試劑的用量。 樣品與試劑的比例（SV/RV），也可表示為樣品分?jǐn)?shù)樣品體積與反應(yīng)液總體積。 SV/TV是方法學(xué)基本參數(shù)，在其他參數(shù)不變時(shí)

5、，直接影響結(jié)果的計(jì)算。一般情況下以試劑說(shuō)明為準(zhǔn)，不宜輕易改動(dòng)。 如總膽固醇與甘油三脂的測(cè)定，血清樣品與試劑的最佳比列為1:100，樣本的最低用量不能小于3ul。 測(cè)定方法的選擇： 自動(dòng)生化儀一般都可選擇一點(diǎn)終點(diǎn)法，兩點(diǎn)速率法，速率A法等。對(duì)于，一種新的實(shí)驗(yàn)方法，通常選擇高中低嘗試樣本與標(biāo)準(zhǔn)品觀察其它反應(yīng)進(jìn)程曲線(xiàn)。若均在5min之內(nèi)呈直線(xiàn)，可采用速率A測(cè)定。如反應(yīng)進(jìn)程曲線(xiàn)不呈直線(xiàn)而且需5-10min，甚至更長(zhǎng)的時(shí)間才能達(dá)到終點(diǎn)，可采用兩點(diǎn)速率法測(cè)定，如反應(yīng)曲線(xiàn)在2-3min，甚至更短的時(shí)間即達(dá)到終點(diǎn)，則采用終點(diǎn)法為宜。 同一項(xiàng)目可用不同的方法測(cè)定 如血清肌酐測(cè)定通常的就有氧化酶和苦味酸，兩點(diǎn)速率

6、法和酶法的。 當(dāng)前情況下大多以使用，JAFFF法苦味酸法的，由于價(jià)格便宜，但苦味酸污染管道及比色杯。 酶法測(cè)定肌酐價(jià)格雖然貴但其測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，試劑抗干擾力強(qiáng)。標(biāo)本用量少，污染少，有逐漸被酶法試劑盒取代的趨勢(shì)。 同一個(gè)項(xiàng)目相同的試劑也可用不同的方法進(jìn)行測(cè)定，在血清葡萄糖測(cè)定方法中，己糖激酶HK法的特異性高，分析方法中有一點(diǎn)終點(diǎn)法，兩點(diǎn)終點(diǎn)法，速率A法，有研究表明，三種分析方法中只有兩點(diǎn)終點(diǎn)法能扣除其光譜干擾（溶血、脂濁、黃疸）的影響，到反應(yīng)終點(diǎn)的第二點(diǎn)間仍能保持相對(duì)的與校準(zhǔn)曲線(xiàn)基本一致的曲線(xiàn)，其吸光度差值乃能保持原比例，因而檢測(cè)結(jié)果較正確。誤差較小，能較好地克服（溶血、脂濁、黃疸）取得較準(zhǔn)確的結(jié)

7、果。 波長(zhǎng)的選擇應(yīng)根據(jù)吸收光譜曲線(xiàn)，選擇特定反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)吸光度吸收的最高峰值時(shí)的。波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng)及雙單波長(zhǎng)測(cè)定的主波長(zhǎng)。 副波長(zhǎng)的選擇原則是干擾因數(shù)在主波長(zhǎng)與副波長(zhǎng)有相同的吸光度或是越接近越好，但不影響測(cè)定的靈敏度及副波長(zhǎng)的正確選擇有利于提高測(cè)定的靈敏度和減少測(cè)定誤差，單波長(zhǎng)測(cè)定易受到樣品溶血，黃疸，脂血等因素的干擾，雙波長(zhǎng)測(cè)定可以通過(guò)副波長(zhǎng)加以修正，減少甚至消除干擾因素，提高測(cè)定的準(zhǔn)確度。 雙波長(zhǎng)的選擇常見(jiàn)： 血紅蛋白在340nm和380nm波長(zhǎng)吸光度相同， 以NADH和NADPH作為測(cè)定底物或產(chǎn)物的試驗(yàn)常用340nm、380nm 340、405ALP和GGT常用405nm、476nmTRIN

8、DER反應(yīng)多選取520nm、600nm或550nm、660nm免疫比濁常用340nm、700nm等。 分析時(shí)間的選擇 分析時(shí)間主要包括反應(yīng)時(shí)間，監(jiān)測(cè)時(shí)間（讀點(diǎn)）和讀數(shù)間隔時(shí)間，延遲時(shí)間，根據(jù)反應(yīng)類(lèi)型，儀器和試劑的狀況，就遵循有利于抗干擾，有足夠靈敏度以及準(zhǔn)確度的原則適當(dāng)調(diào)配延遲時(shí)間和讀數(shù)時(shí)間的長(zhǎng)短。 定血清葡萄糖、膽固醇的試劑盒由于增加了可加快反應(yīng)速率的工具酶的量3-4min反應(yīng)完全，設(shè)置5min已足夠。目前多數(shù)自動(dòng)生化分析儀設(shè)置有多個(gè)反應(yīng)時(shí)間可選（如日立7170,5min，10min，15min），須預(yù)先選定，多數(shù)儀器設(shè)定在10min左右 監(jiān)測(cè)時(shí)間是指該時(shí)間內(nèi)的測(cè)定讀數(shù)要用于結(jié)果計(jì)算。它的設(shè)置與加樣點(diǎn)、加試劑