糞便病原菌的分離與鑒定

1、1糞便標(biāo)本2病原菌的分離與鑒定2實驗?zāi)康募S便標(biāo)本中常含有很多雜菌，應(yīng)根據(jù)檢驗?zāi)康木牟煌x擇培養(yǎng)基，以利于病原菌的檢出。而且，因其各種正常菌群含量甚多，僅以染色性和形態(tài)無法分辨是否為病原菌。常見的病原菌有常見的病原菌有志賀氏菌屬、致病性大腸桿菌屬、弧菌屬、沙門志賀氏菌屬、致病性大腸桿菌屬、弧菌屬、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、艱難梭菌等。氏菌、金黃色葡萄球菌、艱難梭菌等。這次實驗中我們從糞便標(biāo)本中檢出的是大腸大腸埃希菌、痢疾志賀菌埃希菌、痢疾志賀菌。而且，我們從這次的綜合性實驗中了解到了醫(yī)學(xué)微生物學(xué)主要的研究方法和手段，掌握了微生物試驗的基本技能和基本原理，樹立了牢固的無菌觀念。同時培養(yǎng)了我們的

2、動手能力和表達(dá)能力。3糞便標(biāo)本糞便標(biāo)本直接糞便檢查直接糞便檢查 革蘭染色革蘭染色單染色單染色動力觀察及制動動力觀察及制動試驗試驗初步結(jié)果報告初步結(jié)果報告需氧培養(yǎng)需氧培養(yǎng)增菌培養(yǎng)增菌培養(yǎng)直接分離直接分離堿性胨水堿性胨水堿性平板分堿性平板分離離菌落形態(tài)菌落形態(tài)抗血清凝集抗血清凝集生化生化反應(yīng)反應(yīng)增菌液增菌液菌落形態(tài)菌落形態(tài)抗血清凝集抗血清凝集生化反應(yīng)生化反應(yīng)SS平板平板副溶血性弧菌選副溶血性弧菌選擇性平板擇性平板菌落形態(tài)生化菌落形態(tài)生化反應(yīng)反應(yīng)厭氧培養(yǎng)厭氧培養(yǎng)微需氧培微需氧培養(yǎng)及特殊養(yǎng)及特殊培養(yǎng)培養(yǎng)實驗結(jié)果實驗結(jié)果4 1.實驗材料實驗材料 接種針、接種環(huán)、油性筆、打火機、試管架、普通冰箱、冷藏室、

3、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、奧林巴斯CX21型生物顯微鏡、1500W電爐、蒸餾水、玻片缸、消毒液、1新潔而滅、天平、砝碼、細(xì)菌干粉培養(yǎng)基（營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、半固體瓊脂）、錐形瓶、量筒、試管筐、糖發(fā)酵微量管（葡萄糖、乳糖）、滅菌平皿、試管（棉塞）、刻度吸管、洗耳球、稱量紙、硫酸紙、牛皮紙、橡皮筋、尺子、藥勺、革蘭氏染色液（結(jié)晶紫染液、盧戈碘液、95乙醇、稀釋石炭酸復(fù)紅）、小砂輪、痢疾血清、青霉素、鏈霉素、慶大霉素和生理鹽水濾紙片、線繩、香柏油、擦油紙5 2.實驗方法實驗方法 2.1培養(yǎng)基的制備、消毒和滅菌培養(yǎng)基的制備、消毒和滅菌 培養(yǎng)基制備的一般程序： 調(diào)配溶化矯正pH分裝滅菌檢定保存。 干粉培養(yǎng)基

4、蒸餾水加熱溶化分裝滅菌檢定保存。 干粉培養(yǎng)基蒸餾水加熱溶化分裝集中放在試管筐里，然后罩上硫酸紙，牛皮紙，用橡皮筋扎好放入講臺邊的高壓滅菌桶或高壓滅菌筐內(nèi)送到高壓滅菌室（洗刷室）。6表表1.培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基的制備組號組號 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 稱量稱量(g) 水量水量(ml) 煮沸煮沸(次次) 分裝分裝(ml) 備注備注(24人分人分) 1 營養(yǎng)瓊脂營養(yǎng)瓊脂 11.4 300 3瓶，瓶，500ml瓶，平板瓶，平板2,3 營養(yǎng)瓊脂營養(yǎng)瓊脂 2.9 75 3 5 15支，中試管，斜面支，中試管，斜面 6 營養(yǎng)肉湯營養(yǎng)肉湯 2.0 90 1 3 30支，小試管，液體支，小試管，液體 7,8 半固體半固體 1

5、.5 50 3 3 15支，小試管，高層支，小試管，高層 72.2細(xì)菌的分離與培養(yǎng)細(xì)菌的分離與培養(yǎng)2.2.1采用平板劃線分離法，將取糞便標(biāo)本中混雜的多種細(xì)菌，在伊紅美藍(lán)固體培養(yǎng)基表面劃線，使之分散成單個細(xì)菌，在37培養(yǎng)24h，從而分離出肉眼可見的單個菌落。2.2.2細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上生長特征的觀察。觀察形成菌落的大小、形狀、邊緣、表面、溶血性、色素、透明度、濕潤度。2.2.3細(xì)菌的純培養(yǎng)。糞便標(biāo)本在伊紅美藍(lán)平板上，有紫黑色、粉紅色兩種菌落。挑選這兩種不同菌落分別在斜面培養(yǎng)基上接種，標(biāo)記，在37培養(yǎng)18h。2.2.4細(xì)菌在斜面培養(yǎng)基上生長特征的觀察。觀察細(xì)菌的生長量、菌苔形狀、表面形狀、光澤、透

6、明度、顏色等。2.2.5液體培養(yǎng)基接種法。用接種環(huán)在固體或斜面培養(yǎng)基上挑選紫黑色和粉紅色菌苔少許移入液體培養(yǎng)基管中，在接近液面的管壁上輕輕研磨，并沾取少量肉湯調(diào)和，使菌液混合于培養(yǎng)基中，混勻。在35培養(yǎng)46h，觀察細(xì)菌的生長情況82.3細(xì)菌個體形態(tài)特征的觀察細(xì)菌個體形態(tài)特征的觀察 2.3.1取兩塊玻片，在每塊玻片上加生理鹽水34ul，2滴，在斜面培養(yǎng)基上取紫黑色菌苔少許（1mm小菌落的半量）與第一塊玻片上的一滴鹽水混勻，再取粉紅色菌苔少許（1mm小菌落的半量）與第二塊玻片上的一滴鹽水混勻，涂成1cm2；做好標(biāo)志。經(jīng)在空氣中干燥后，再用酒精燈對其進(jìn)行固定。 2.3.2革蘭染色。用結(jié)晶紫對以上兩塊

7、已固定的玻片進(jìn)行初染1分鐘，水洗；再用盧戈碘液媒染1分鐘，水洗；然后用95乙醇對其進(jìn)行脫色約20秒鐘，水洗；最后用稀釋復(fù)紅復(fù)染1分鐘，水洗；吸干，在顯微鏡下鏡檢。92.4細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定細(xì)菌生化反應(yīng)鑒定2.4.1糖發(fā)酵試驗。用接種針分別挑少許紫黑色和粉紅色的細(xì)菌接種到葡萄糖發(fā)酵微量管和乳糖發(fā)酵微量管中，將微量管放在平皿蓋內(nèi)，在37下，培養(yǎng)24小時，觀察其產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況。2.4.2細(xì)菌藥物敏感性試驗。接種環(huán)分別取紫黑、粉紅色兩種菌液36ul2環(huán)，各自在兩個平板上，作平板密集劃線接種細(xì)菌（紗窗樣）。設(shè)計三點，三點之間等邊三角距離，點距離平皿邊緣約15mm。作標(biāo)記：青、鏈、慶。鑷子火焰消毒，夾取相應(yīng)的

8、藥物紙片，平貼在已設(shè)定的位置上，按壓，最后鑷子火焰滅菌。371824小時培養(yǎng)，觀察結(jié)果。2.4.3半固體接種法。接種針斜面取紫黑和粉紅色的細(xì)菌，各自接種進(jìn)兩個半固體培養(yǎng)基，從半固體培養(yǎng)基中心，垂直刺入，到達(dá)培養(yǎng)基底部4/5處，再循原來的路線，退出接種針。 在37下,培養(yǎng)24小時，觀察結(jié)果。2.4.4 痢疾血清玻片凝集反應(yīng)。取載玻片1張，滴加痢疾血清和生理鹽水各15ul，2滴。用接種環(huán)挑取少許紫黑色菌落和粉紅色菌落，各自與上述混合液液滴混勻，觀察結(jié)果 10 3.實驗結(jié)果實驗結(jié)果 3.1細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上生長特征的觀察。細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上生長特征的觀察。 將糞便標(biāo)本用平半分區(qū)劃分法接種于伊紅美蘭培

9、養(yǎng)皿上，培養(yǎng)出紫黑色和粉紅色兩種菌落。(見圖一)11 3.2革蘭染色鏡檢。革蘭染色鏡檢。 取紫黑色和粉紅色菌涂片，革蘭染色，進(jìn)行鏡檢。紫黑色菌革蘭染色陰性，長桿狀。粉色菌革蘭染色陰性，短桿狀。（見圖二，圖三）12 3.3糖發(fā)酵實驗和半固體培養(yǎng)基實驗。糖發(fā)酵實驗和半固體培養(yǎng)基實驗。 紫黑色菌兩支單糖發(fā)酵微量管均變色和產(chǎn)氣，粉紅色菌葡萄糖發(fā)酵管變色不產(chǎn)氣泡，乳糖發(fā)酵管既不變色也不產(chǎn)氣泡。半固體實驗中，紫黑色菌成模糊狀，粉色菌成清晰的線狀。（結(jié)果見圖四，圖五，表二）13 表表2、糖發(fā)酵試驗和半固體培養(yǎng)基實驗結(jié)果、糖發(fā)酵試驗和半固體培養(yǎng)基實驗結(jié)果細(xì)菌種類葡萄糖乳糖半固體紫黑色菌 +粉紅色菌+- 由實驗

10、結(jié)果可知：說明紫黑色細(xì)菌均能分解葡萄糖和乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，粉色菌能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能分解乳糖，不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。紫黑色菌有鞭毛，粉紅色菌無鞭毛。14 2.4藥敏試驗。藥敏試驗。 使用紙片瓊脂擴散法，觀察抑菌圈的大小，由此判斷兩種菌的藥物敏感性（現(xiàn)象見圖六，圖七。結(jié)果見表3）15 2.5痢疾血清玻片凝集實驗。痢疾血清玻片凝集實驗。 紫黑色菌與痢疾血清混合不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，而粉紅色菌與痢疾血清混合出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，說明紫黑色菌不是引起痢疾的致病菌，粉紅色菌是引起痢疾的致病菌。16 在制備好培養(yǎng)基后，采用是平板劃線分離法，將糞便標(biāo)本接種于伊紅美藍(lán)平板，從中分離出兩種不同的細(xì)菌：紫黑色具有金屬光澤的菌落

11、和粉紅色半透明菌落。在顯微鏡下觀察時，這兩種菌均為G桿菌，排列不規(guī)則，從形態(tài)上不能鑒別是什么細(xì)菌。經(jīng)糖發(fā)酵試驗，可以觀察到，紫黑色的細(xì)菌使能使葡萄糖和乳糖的試管變色和產(chǎn)生氣體，粉紅色的細(xì)菌只能使葡萄糖的試管變色而無氣體，對乳糖無反應(yīng)；經(jīng)半固體動力試驗，觀察到紫黑色的細(xì)菌使半固體培養(yǎng)基成渾濁狀態(tài)，粉紅色的細(xì)菌只在接種針插入的方向聚集。由此初步推斷，紫黑色的細(xì)菌可能為大腸埃希菌，粉紅色的為痢疾志賀菌（參見表四和表五）。進(jìn)行痢疾血清玻片凝集實驗，紫黑色菌無凝集現(xiàn)象，粉色菌有凝集現(xiàn)象，因此可以斷定粉色菌為痢疾志賀菌，紫黑色菌極可能為大腸埃希菌。做藥敏試驗時，發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌和痢疾志賀菌均對青霉素不敏感，對慶大霉素和鏈霉素都敏感。17 THEEND!謝謝觀賞！謝謝觀賞！181920圖一21圖