實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)常用技術(shù)課件

1、張雅為遼寧省疫控中心 2010年11月國(guó)家動(dòng)物疫情測(cè)報(bào)體系管理規(guī)范 豬：口蹄疫、豬水泡病、豬瘟、偽狂犬病、豬呼吸與繁殖障礙綜合征牛：口蹄疫、結(jié)核、布氏桿菌病、瘋牛病羊：口蹄疫、布氏桿菌病、山羊/綿羊痘、癢病馬屬動(dòng)物：馬傳貧、馬鼻疽雞：新城疫、禽流感鴨、鵝：禽流感內(nèi)容血清學(xué)檢測(cè)： 血凝抑制試驗(yàn) 凝集試驗(yàn) 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng) 聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)病原學(xué)檢測(cè)： 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)基本概念抗原：抗原是指那些能夠誘導(dǎo)機(jī)體的免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗體和致敏效應(yīng)淋巴細(xì)胞，并在體內(nèi)外與之特異性結(jié)合，發(fā)生免疫反應(yīng)的物質(zhì)?？贵w：是能與相應(yīng)的抗原特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)分子，和機(jī)體其他生物大分子一樣是細(xì)胞的產(chǎn)物，分泌到

2、體液中或表現(xiàn)在細(xì)胞表面上?？乖⒖贵w反應(yīng)：抗原和抗體在體外的反應(yīng)亦稱血清學(xué)反應(yīng)。血凝及血凝抑制試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備血凝板 0.5%-1%的紅細(xì)胞懸液 100ul微量移液器 PBS或生理鹽水 待檢病毒液或檢測(cè)抗原 待檢血清及陽(yáng)性血清血凝實(shí)驗(yàn)步驟注：第12孔為陰性對(duì)照。振蕩混勻，于室溫（20-25 ）放置40分鐘后判定結(jié)果（如果環(huán)境溫度太高，可置4環(huán)境下）。對(duì)照孔紅細(xì)胞將呈明顯的紐扣狀沉到孔底。結(jié)果判定將板傾斜，觀察紅細(xì)胞有無成淚滴狀流淌。完全血凝（不流淌）的抗原或病毒最高稀釋倍數(shù)代表一個(gè)血凝單位（HAU）。四單位抗原配置根據(jù)血凝試驗(yàn)結(jié)果配置4HAU抗原。以完全血凝的病毒最高稀釋倍數(shù)作為終點(diǎn)，終點(diǎn)稀釋倍數(shù)

3、除以4即為含4HAU抗原的稀釋倍數(shù)。如血凝終點(diǎn)滴度為1：256，則4HAU抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1：64（256/4）。四單位抗原配置四單位抗原回滴四單位抗原回滴4單位抗原(l)血凝抑制試驗(yàn)步驟 注：第11孔為陽(yáng)性對(duì)照，第12孔為陰性對(duì)照。輕輕混勻，靜置約40分鐘。結(jié)果判定以完全抑制4個(gè)HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。只有陰性對(duì)照孔血清滴度不大于2log2，陽(yáng)性對(duì)照孔血清誤差不超過1個(gè)滴度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才有效。HI價(jià)小于等于3log2判定HI試驗(yàn)陰性；HI價(jià)等于4log2為可疑，需重復(fù)試驗(yàn)；HI價(jià)大于等于5log2為陽(yáng)性。（GB/T 18936-2003）凝集實(shí)驗(yàn)概述細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原

4、，或吸附在膠乳、白陶土、離子交換樹脂和紅細(xì)胞的抗原，與相應(yīng)抗體結(jié)合，在有適當(dāng)電解質(zhì)存在下，經(jīng)過一定時(shí)間，形成肉眼可見的凝集團(tuán)塊，稱為凝集試驗(yàn)（agglutination）。凝集試驗(yàn)可用于檢測(cè)抗原或抗體，最突出的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便。凝集試驗(yàn)可根據(jù)抗原的性質(zhì)、反應(yīng)的方式分為直接凝直接凝集試驗(yàn)集試驗(yàn)（簡(jiǎn)稱凝集試驗(yàn)）和間接凝集試驗(yàn)。直接凝集試驗(yàn)顆粒性抗原與凝集素直接結(jié)合并出現(xiàn)凝集現(xiàn)象的試驗(yàn)稱作直接凝集試驗(yàn)（direct agglutination test）。直接凝集試驗(yàn)按操作方法可分為玻片法和試管法。玻片法玻片法為定性試驗(yàn)。此法簡(jiǎn)便快速，可用已知診斷抗原懸液檢測(cè)待檢血清是否存在相應(yīng)抗體。玻片法試驗(yàn)準(zhǔn)備：

5、抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、陰性血清受檢血清應(yīng)新鮮，無明顯蛋白凝塊，無溶血、無腐敗氣味潔凈的玻璃板，其上劃分成4cm2的方格吸管或分裝器，適于滴加牙簽或火柴桿，供攪拌用玻片法操作方法：將玻璃板上各格標(biāo)記受檢血清號(hào)，然后加相應(yīng)血清在受檢血清旁滴加抗原用牙簽類小棒攪動(dòng)血清和抗原使之混合每次試驗(yàn)應(yīng)設(shè)陰、陽(yáng)性血清對(duì)照玻片法判定：在陰、陽(yáng)性血清對(duì)照成立的條件下，方可對(duì)被檢血清進(jìn)行判定。受檢血清在4min內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見凝集現(xiàn)象者判為陽(yáng)性（+），無凝集現(xiàn)象，呈均勻粉紅色者判為陰性（-）。（GB/T 18646-2002）試管法材料準(zhǔn)備：稀釋液：0.5%石碳酸生理鹽水。檢驗(yàn)羊血清時(shí)用含0.5%石碳酸的10%鹽溶液，如

6、果血清稀釋用含0.5%石碳酸的10%鹽溶液，抗原的稀釋也用含0.5%石碳酸的10%鹽溶液抗原、陽(yáng)性血清和陰性血清凝集試驗(yàn)管（三分管）、試管架、吸管及溫箱試管法置3740 溫箱24h，取出檢查并記錄結(jié)果。試管法每次試驗(yàn)均應(yīng)設(shè)陽(yáng)性血清、陰性血清和抗原對(duì)照。牛、馬、鹿、駱駝血清稀釋法與上述基本一致，差異是第一管加1.2ml稀釋液和0.05ml被檢血清。大規(guī)模檢疫時(shí)也可只用2個(gè)稀釋度，即牛、馬、鹿、駱駝?dòng)?:50和1:100，豬、山羊、綿羊和狗用1:25和1:50。試管法結(jié)果判定參照比濁管，按各試管上層液體清亮度判讀 1）+菌體完全凝集，100%下沉，上層液體100%清亮； 2）+菌體幾乎完全凝集，上

7、層液體75%清亮； 3）+菌體凝集顯著，液體50%清亮； 4）+凝集物有沉淀，液體25%清亮； 5）-凝集物無沉淀，液體均勻渾濁。試管法結(jié)果判定 牛、馬、鹿、駱駝 1:100血清稀釋，豬、山羊、綿羊和狗1:50血清稀釋，出現(xiàn)“+”以上凝集現(xiàn)象時(shí)，受檢血清判定為陽(yáng)性。 牛、馬、鹿、駱駝 1:50血清稀釋，豬、山羊、綿羊和狗1:25血清稀釋，出現(xiàn)“+”以上凝集現(xiàn)象時(shí)，受檢血清判定為可疑。 （GB/T 18646-2002）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)概念補(bǔ)體（complement）是存在于正常動(dòng)物血清中，具有類似酶活性的一組蛋白質(zhì)，具有潛在的免疫活性，激活后能表現(xiàn)出一系列的免疫學(xué)活性，能協(xié)同其他免疫物質(zhì)直接殺傷靶

8、細(xì)胞和加強(qiáng)細(xì)胞免疫功能。正常情況下，補(bǔ)體成分以無活性的酶原形式存在，只有在激活物（如抗原抗體復(fù)合物）的作用下，補(bǔ)體各成分才依次被活化。實(shí)驗(yàn)原理CFT是根據(jù)任何抗原抗體復(fù)合物可激活、固定補(bǔ)體的特性，用一定量的補(bǔ)體與致敏紅細(xì)胞來檢測(cè)抗原、抗體間有無特異性結(jié)合的一類實(shí)驗(yàn)。先加入反應(yīng)系統(tǒng)和補(bǔ)體，給其以優(yōu)先結(jié)合補(bǔ)體的機(jī)會(huì)，如果反應(yīng)系統(tǒng)中存在待測(cè)的抗體（或抗原），則抗原、抗體發(fā)生反應(yīng)后可結(jié)合補(bǔ)體，再加入指示系統(tǒng)（SRBL與相應(yīng)溶血素），由于反應(yīng)中無游離的補(bǔ)體而不出現(xiàn)溶血，為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陽(yáng)性。如待測(cè)系統(tǒng)中不存在待檢的抗體或（抗原），則在液體中仍有游離的補(bǔ)體存在，當(dāng)加入指示劑時(shí)會(huì)出現(xiàn)溶血，為補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)陰性。

9、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備稀釋液：0.85%生理鹽水綿羊紅細(xì)胞懸液：采成年公綿羊血，用稀釋液洗滌3-4次，最后一次以2000r/min離心10min，以稀釋液配置成2.5%紅細(xì)胞懸液抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、陰性血清、溶血素受檢血清：用稀釋液作1:10稀釋，加熱滅能溶血素補(bǔ)體抗原操作過程血清被檢血清對(duì)照管陽(yáng)性血清陰性血清抗原溶血素補(bǔ)體血清加入量0.50.50.50.50.50.5000稀釋液00.500.500.501.51.5抗原0.500.500.50100工作量補(bǔ)體0.50.50.50.50.50.50.500.53738水浴20min二單位溶血素0.50.50.50.50.50.50.50.502.5%紅細(xì)胞

10、0.50.50.50.50.50.50.50.50.53738水浴20min判定結(jié)果舉例結(jié)果判定第一次判定要求不加抗原的，不加或加抗原的陰性血清對(duì)照管，抗原對(duì)照管呈完全溶血反應(yīng)。初判后靜置12h作第二次判定，要求溶血素對(duì)照管，補(bǔ)體對(duì)照管呈完全抑制溶血。對(duì)照正確即可對(duì)受檢血清進(jìn)行判定，受檢血清加抗原管的判定參照標(biāo)準(zhǔn)比色管記錄結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn) 0 40%溶血判為陽(yáng)性反應(yīng) 50% 90%溶血判為可疑反應(yīng) 100%溶血判為陰性反應(yīng)（GB/T 18646-2002）皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理機(jī)體受到某種抗原刺激時(shí)，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞活化、增殖分化成致敏淋巴細(xì)胞，使機(jī)體致敏，以后如再次接觸相同的抗原，致敏淋巴細(xì)胞

11、即釋放出各種淋巴因子，一方面使機(jī)體表現(xiàn)特異性的細(xì)胞免疫，另一方面則發(fā)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。結(jié)核分支桿菌PPD皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)操作注射部位及術(shù)前處理：將牛只編號(hào)后在頸側(cè)中部上三分之一處剪毛，直徑約10cm。用卡尺測(cè)量術(shù)部中央皮皺厚度，做好記錄。注射劑量：不論大小牛只，一律皮內(nèi)注射0.1ml(含2000IU)。注射方法：先以75%酒精消毒，然后皮內(nèi)注射牛型結(jié)合分支菌素PPD，注射后局部應(yīng)出現(xiàn)小皰，如對(duì)注射有疑問，應(yīng)另選15cm以外的部位或?qū)?cè)重做。皮內(nèi)注射后72h判定，仔細(xì)觀察局部有無熱痛、腫脹等炎性反應(yīng)，并以卡尺測(cè)量皮皺厚度，做好詳細(xì)記錄。對(duì)陰性牛和疑似反應(yīng)牛，于注射后96h和120h分別再觀察一次

12、。結(jié)果判定陽(yáng)性反應(yīng)：局部有明顯的炎性反應(yīng)，皮厚差大于或等于。疑似反應(yīng)：局部炎性反應(yīng)不明顯，皮厚差大于或等于，小于。陰性反應(yīng)：無炎性反應(yīng)，皮厚差在以下。凡判定為疑似反應(yīng)的牛只，于第一次檢疫60d后進(jìn)行復(fù)檢，其結(jié)果仍為疑似反應(yīng)時(shí)，經(jīng)60d再?gòu)?fù)檢，如仍為疑似反應(yīng)，應(yīng)判為陽(yáng)性。（GB/T 18645-2002）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）概述酶具有高效生物催化作用，一個(gè)酶分子在數(shù)分鐘內(nèi)可以催化幾十、幾百個(gè)底物分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生放大作用，使得原來極其微乎其微的抗原或抗體在數(shù)分鐘后就可被識(shí)別出來，這種技術(shù)被稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELI

13、SA）。本法自上世紀(jì)70年代初期由Van weemen、Schuars及Perlmarn等相繼分別報(bào)道后，現(xiàn)已引起廣泛重視。原理將已知抗體或抗原結(jié)合在某種固相載體上，并保持其免疫活性。測(cè)定時(shí)將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體或酶標(biāo)抗原按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)，用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離物成分，然后加入底物顯色，進(jìn)行定性或定量測(cè)定。ELISA可用于檢測(cè)抗體，也可用于檢測(cè)抗原。實(shí)驗(yàn)的方法類型有多種，如雙抗體夾心法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法和捕獲法等，雖然原理不盡相同，但實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)和影響因素基本一樣。酶抗抗體酶標(biāo)記抗抗體抗體抗原固相載體1.將抗原包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結(jié)合

14、為抗原抗體復(fù)合物。3.再加入酶標(biāo)記抗抗體，則結(jié)合為抗原-抗體-酶標(biāo)記抗抗體復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。間接法（抗-HCV等）示意圖雙抗體夾心法（HBsAg、HBeAg等）示意圖固相載體抗體抗原酶抗體酶標(biāo)記抗體1.將抗體包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗原，則結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物。3.再加入酶標(biāo)記抗體，則結(jié)合為抗體-抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。捕獲法（抗-HAV IgM、抗-HDV IgM等）示意圖酶抗體酶標(biāo)記 抗體抗原抗抗體固相載體抗體1.將抗抗體包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結(jié)合為抗抗體-抗體復(fù)合物。3. 加入抗原及酶標(biāo)記抗體，則結(jié)合為抗抗體-抗體-抗原-酶

15、標(biāo)記抗體復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。應(yīng)用疾病臨床診斷、疾病監(jiān)測(cè)、疾病普查、法醫(yī)檢查、獸醫(yī)及農(nóng)業(yè)上的植物病害的診斷檢定等。 檢查抗原方面：在內(nèi)分泌方面已經(jīng)用于檢測(cè)雌性激素、絨毛膜促性腺激素、黃體素、胰島素等；在血液學(xué)方面可用于檢查凝固因子、紅細(xì)胞抗原及結(jié)合球蛋白等；在腫瘤方面已試用檢查甲胎蛋白、癌胚抗原。檢查抗體方面：用間接法檢查抗體，已成功研制出多種傳染病和寄生蟲病試劑盒，廣泛應(yīng)用于免疫抗體和感染抗體的檢測(cè)。 PCR實(shí)驗(yàn)概述概述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），是指通過合成一段寡核苷酸引物，在存在4種脫氧單核苷酸（dNTP）和Mg2+

16、 的情況下，以DNA為模板，由DNA聚合酶催化的一種體外擴(kuò)增技術(shù)。PCR的早期設(shè)想的早期設(shè)想核酸的研究已經(jīng)有100年的歷史，20世紀(jì)60年代末、70年代初人們致力于基因的體外分離技術(shù)。Korana于1971年最早提出核酸的體外的擴(kuò)增的設(shè)想：DNA經(jīng)過變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷的重復(fù)該過程便可合成tRNA基因。 PCR的實(shí)現(xiàn)1985年美國(guó)的Perkin-Elmer Cetus 公司的發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）。它的原理與體內(nèi)的DNA 復(fù)制相似，在試管中給DNA合成提供一種合適的條件模板DNA、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、合適的緩沖體系、DNA變性、復(fù)

17、性及延伸的溫度和時(shí)間。1985年Saiki等將PCR技術(shù)應(yīng)用于-珠蛋白基因 的擴(kuò)增。1987年Mullis等完成了PCR自動(dòng)化操作裝置（熱循環(huán)儀），使PCR技術(shù)進(jìn)行實(shí)用階段。PCR的原理PCR的原理PCR的原理基本過程 PCR 的過程是重復(fù)性循環(huán)，其中每一循環(huán)包括3個(gè)基本步驟： 變性 退火 延伸。 隨著循環(huán)的進(jìn)行，原來的模板和新合成的目的片段均可以作為模板參與變性、退火和延伸等反應(yīng)。理論上講 ，假如擴(kuò)增效率為100，每增加一輪反應(yīng)，產(chǎn)物是前一輪的兩倍?；具^程參與反應(yīng)的各種成分 緩沖液 DNA模板 dNTP Mg2+ DNA聚合酶 引物反應(yīng)體系 以50ul反應(yīng)體系為例，介紹常規(guī)PCR反應(yīng)的反應(yīng)

18、體系 滅菌水 10buffer 5 ul（含Mg2+ ） 4dNTP 4 ul 上游引物 1 ul（1050 pmol/ul，此為使用濃度） 下游引物 1 ul（1050 pmol/ul，同上） 模板DNA 1 ul（取決于靶DNA的含量） Taq酶 （1U） 總體積 50ul操作PCR的循環(huán)參數(shù)如下的循環(huán)參數(shù)如下 94預(yù)變性 5min 94變性 1 min 56退火 1 min 共30個(gè)循環(huán) 72延伸 1 min 72延伸 10 min 4 終止反應(yīng) 具體到每一個(gè)試驗(yàn)，有與之相適的參數(shù)具體到每一個(gè)試驗(yàn)，有與之相適的參數(shù)。PCR結(jié)果的判斷將PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳，在紫外檢測(cè)儀上判斷結(jié)果。如果僅出現(xiàn)目的DNA條帶，則結(jié)果為陽(yáng)性，如果所需要的條帶沒有出現(xiàn)，則為陰性。如需進(jìn)一步確定，可進(jìn)行測(cè)序比對(duì)。臨床應(yīng)用遺傳學(xué)疾病方面腫瘤研究檢測(cè)病原體基因分型RT-PCR常規(guī)的PCR是以DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增的，而反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcripion-polymerase chain reaction，RT-PCR）則是以RNA為起始材料的PCR。由RNA（mRNA ）反轉(zhuǎn)錄后的cDNA可經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得大量的cD