ELISA灰區(qū)的設(shè)置及質(zhì)控方法

1、elisa 灰區(qū)的設(shè)置及質(zhì)控方法elisa 測定的陽性判斷值，通常是將大量陰性和陽性人群的測定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析后確定 的， 其確定依據(jù)為判斷結(jié)果的假陽性和假陰性率最低。 在陽性判斷值周圍一定范圍內(nèi)之外的 測定結(jié)果可歸為可疑，亦即elisa 測定的 “灰區(qū) ”。 “灰區(qū) ”的大小可用統(tǒng)計學(xué)方法確定。測定結(jié)果處于 “灰區(qū) ”的樣本，可通過確認(rèn)試驗或追蹤檢測來確定到底是陽性還是陰性?！??！盎覅^(qū) ”的大小可用統(tǒng)計學(xué)方法確定?具體是怎么確定的，。 或者大概粗略的方法計算是怎么樣的呢？ ？高手在哪呢elisa “灰區(qū)”是把定量分析的正常值范圍引入定性分析而建立的概念。 灰區(qū)的設(shè)置有二種：(1) c.ox

2、 (1c) , c為該試劑的批內(nèi)c (一般在15-20%間)；(2 ) c.o 2s ， s 為實驗室做室內(nèi)質(zhì)控roc 的 s 。另外，個人認(rèn)為：elisa “灰區(qū)”對于不同項目和應(yīng)用的領(lǐng)域不同，其設(shè)置不能一概而論。根據(jù)美國疾病控制中心( cdc )對美國 ortho 的抗 hc 檢測的 elisa 試劑盒進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)只有檢驗結(jié)果s/c83.8時，高度預(yù)示hc抗體真陽性狀態(tài)；若檢驗結(jié)果s/co0.5 是陽性，如果測量得吸光度是0.4 的話怎么判斷，結(jié)果是陰性，但是是有很明顯顏色的。在血站系統(tǒng)這樣的血就不敢用，怎么解決呢，我 們經(jīng)常遇到測量陰性但是有顏色的標(biāo)本，用不同廠家的試劑或是同種試劑重復(fù)

3、實驗還是一 樣，又擔(dān)心存在弱抗體的問題。 怎么解決呢，萬分感激國內(nèi)試劑測 hbsag 的 cutoff 值一般不會達(dá)到 0.5 ，除非不做空白。 其 cutoff 的公式一般為 nc*2.1 。我只是舉例。別找問題以外的事情來說呀，我等答案等得 著急第三章elisa 技術(shù)的質(zhì)量控制概述engall 和 perlmann 于 1971 年 首 先 建 立 了 酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 試 驗 ( enzyme linked immunosorbent assay,elisa )。隨著科技的發(fā)展， elisa 在抗原、抗體、酶、固相載體及 包被技術(shù)等方面都有較大的進(jìn)步， 其靈敏度和特異性均大大提高。

4、 由于該技術(shù)具有簡便、 快 速、經(jīng)濟(jì)等特點，因而已被廣泛應(yīng)用于各行業(yè)。盡管如此， elisa 在應(yīng)用過程中仍然存在 著許多難點，必須嚴(yán)格控制才能保證檢測的質(zhì)量。 elisa 質(zhì)量保證是一個復(fù)雜的過程，許多重要的環(huán)節(jié)都影響到檢測的質(zhì)量?，F(xiàn)分述如下： 一、方法學(xué)的影響 elisa 測定模式包括以下幾種：雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、 igm 抗體捕捉法、 競爭抑制法， 其中競爭抑制法因受操作時差所引起的不公平競爭等因素的影響， 結(jié)果重復(fù)性 較差，質(zhì)量較難控制。 二、試劑因素 1. 試劑的選擇 免疫檢測的原理均基于抗原抗體反應(yīng)。 由于該反應(yīng)過程受多種因素的影響， 如普遍存在基質(zhì) 效應(yīng)、 交叉反

5、應(yīng)等， 因而檢測結(jié)果難以溯源， 不同方法、 不同試劑之間甚至同一試劑不同批 號間結(jié)果均缺乏可比性。 試劑質(zhì)量在很大程度上決定了檢測的水平， 因此在引入新項目之前 必須對試劑進(jìn)行嚴(yán)格的評估。 試劑的評估有以下幾個步驟： 確定開展該項目的必要性； 了解該項目現(xiàn)有的檢測方法和原理；在了解試劑的組成基礎(chǔ)上選擇多家試劑盒進(jìn)行比較， 判斷標(biāo)準(zhǔn)首選參考方法或參考物質(zhì)， 其次為臨床的滿意度及權(quán)威機(jī)構(gòu)的報告如各級室間質(zhì)量評價、cdc報告等；定期對檢測結(jié)果進(jìn)行追蹤反饋直至最終認(rèn)可該試劑。2. 試劑的準(zhǔn)備不同批次的 elisa 試劑在制作過程中很難保證質(zhì)量完全一致，即使是通過批批檢的項目其檢測結(jié)果也存在差異， 因此

6、必須選擇和訂購長批號的試劑， 并保證保存條件。 嚴(yán)格執(zhí)行這一標(biāo)準(zhǔn)可以避免因試劑批號改變而重新建立質(zhì)控體系及重新評估試劑的復(fù)雜過程， 并且能夠保證結(jié)果的穩(wěn)定性；對于效期短、 使用率低的試劑， 應(yīng)當(dāng)小量分裝， 每次使用則取分裝部分即可，避免反復(fù)凍融造成試劑的失效。試劑使用前必須平衡至室溫， 否則會影響檢測下限。 未用完的室內(nèi)質(zhì)控品及本次不需使用的試劑應(yīng)密封并及時放回冰箱保存。三、樣本因素標(biāo)本干擾因素包括內(nèi)源性干擾因素和外源性干擾因素， 前者包括類風(fēng)濕因子、 補(bǔ)體、 異嗜性抗體、自身抗體、溶菌酶等，后者包括標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存時間過長、標(biāo)本凝固不全、 冷凍標(biāo)本的反復(fù)凍融等。 其中外源性

7、干擾因素是我們在檢測過程中可以避免也是必須避免的因素， 而避免內(nèi)源性因素的干擾則主要通過選擇合適的試劑盒。 在臨床中遇到少見的疑難病例時應(yīng)當(dāng)考慮到內(nèi)源性干擾因素的存在。以下對外源性干擾因素進(jìn)行簡要說明：1. 標(biāo)本溶血 要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團(tuán)，其具有類過氧化物的活性，因此，在以辣根過氧化物酶( horseradish peroxidase,hrp )為標(biāo)記酶的 elisa 測 定中， 如果血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高， 則其就很容易在溫育過程中吸附于固相， 從而與 后面加入的底物反應(yīng)顯色。2. 標(biāo)本被細(xì)菌污染標(biāo)本的采集及血清分離要注意盡量避免細(xì)菌污染。細(xì)菌菌體中除可能含有

8、內(nèi)源酶對測定產(chǎn)生非特異性干擾外， 還可能對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用。 另外標(biāo)本在 保存中出現(xiàn)渾濁或絮狀物時，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測。3. 標(biāo)本貯存時間過長標(biāo)本在低溫下保存時間過長， igg 可聚合成多聚體，在間接法elisa測定中會導(dǎo)致本底加深、甚至出現(xiàn)假陽性結(jié)果。通常情況下血清標(biāo)本可在28c下保存l周，冷凍保存時間會更長，但對于抗體或抗原含量低的標(biāo)本而言， 則可能會因抗體掉價、抗 原分解而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。4. 標(biāo)本凝固不全血液通常在采集后半小時后開始凝固，1824h完全凝固。如果在血液未凝固時即離心分離血清， 則可因纖維蛋白原非特異吸附于微孔而造成假陽性結(jié)果。 為了縮短標(biāo)本處理時間， 可以

9、在離心前將血液標(biāo)本置于溫箱中溫育或者采用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽┮约铀傺宓姆蛛x。5. 冷凍保存標(biāo)本避免反復(fù)凍融標(biāo)本的反復(fù)凍融會因其所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力對標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用， 使抗體效價跌落從而引起假陰性結(jié)果， 所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測，宜少量分裝凍存。此外，標(biāo)本在凍存時會因蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，因此重新融解的標(biāo)本必須混勻，但不要進(jìn)行劇烈振蕩，反復(fù)顛倒即可。四、操作因素對elisa 結(jié)果的影響elisa測定一般遵循以下步驟：固相包被 -加樣品-溫育-洗滌-加酶結(jié)合物-溫育-洗 滌加底物溫育顯色終止顯色比色 目前各種形式的 elisa 自動分析儀已

10、經(jīng)進(jìn)入市場，如廣泛應(yīng)用于血站系統(tǒng)的微板式全自動酶免分析儀，其試劑為開放式的，而對于其它類型的儀器，則試劑和儀器往往是配套的。但當(dāng)前大部分醫(yī)學(xué)實驗室均采用手工操作加儀器測定的方式。 elisa 操作步驟復(fù)雜，操作不當(dāng)將引起較大的誤差。以下敘述各個步驟中的影響因素。1. 加樣加樣器是一種比較精密的工具， 其在長時間使用時會因機(jī)械磨損或者推動桿內(nèi)附著血痂等原因造成加樣不準(zhǔn)， 尤其是對于樣本量較大的臨床實驗室， 因此必須定期對加液器進(jìn)行維護(hù)和校準(zhǔn)。 每次加不同的標(biāo)本時均需更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染。加樣時速度不可太快， 避免將標(biāo)本加在孔壁上部 ，并注意不要濺出或產(chǎn)生氣泡。加樣時還應(yīng)當(dāng)注意操作時差對結(jié)果

11、的影響， 操作時差是指加入標(biāo)本、 試劑及混勻時間的差異。 操作時差在每個實驗中都存在，尤其是手工操作， 日常檢測標(biāo)本多達(dá)幾百個， 從加入第一個標(biāo)本到最后一個標(biāo)本， 需幾十分鐘，加入試劑及混勻等均存在著前后的時間差異， 使抗原抗體反應(yīng)和酶促反應(yīng)時間不一致， 操作時差對競爭法檢測的結(jié)果影響更大， 在加酶結(jié)合物和底物時可用定量多道加液器， 使加液過程迅速完成。 如果使用滴瓶除注意滴加的角度外還要注意滴加的速度， 速度太快， 容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或者加在兩孔之間， 造成非特異性吸附。 另外有些項目在檢測前需要稀釋以減低非特異性反應(yīng)， 但稀釋的方式非常重要， 如果采用手工稀釋則容易因操作者個體差異而產(chǎn)生不一

12、致的結(jié)果，尤其是吸光度處于臨界值附近的標(biāo)本，因此最佳的方式是采用振蕩器混勻。2. 溫育在 elisa 檢測中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育（incubation）。溫育常采用的溫度有43 、 37 、室溫和4 （冰箱溫度）等。 37 是實驗室中常用的溫育溫度， 也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的最適反應(yīng)溫度。 有實驗表明， 抗原抗體反應(yīng)一般在 37 經(jīng)12小時產(chǎn)物的生成可達(dá)頂峰。為加速反應(yīng)，可在一定范圍內(nèi)提高反應(yīng)的溫度并在反應(yīng)過程中連續(xù)振蕩以增加抗原抗體接觸的機(jī)會。 抗原抗體反應(yīng)在4 反應(yīng)更為徹底， 形成的產(chǎn)物更多更穩(wěn)定，但

13、因所需時間太長，在elisa 檢測中一般不予采用。溫育的方式有溫箱法、 微波輻射法、 水浴法等， 其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結(jié)果的吸光度差異（這種現(xiàn)象被稱為 “邊緣效應(yīng) ”）。若用溫箱溫育則 elisa板應(yīng)放在濕盒內(nèi)， 濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等， 在盒底墊濕的紗布， 最后將 elisa板放在濕紗布上。 采用這種溫育方式的關(guān)鍵是必須保證濕盒內(nèi)的溫度達(dá)到反應(yīng)的要求， 可在反應(yīng)前將濕盒預(yù)溫至規(guī)定的溫度，并用溫度計監(jiān)測反應(yīng)過程。采用水浴時，將elisa 板置于水浴箱中，板底貼著水面。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋或用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。

14、溫育過程中， 反應(yīng)板不宜疊放， 以保證各板的溫度都能迅速平衡。嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?elisa 試劑盒一般都規(guī)定了明確的溫育溫度，若要求室溫溫育，則一般是指2025 c。微波輻射法能縮短溫育時間，但不能解決邊緣效應(yīng)：因而較少使用。3. 洗滌洗滌是 elisa 測定過程中決定實驗成敗的一個關(guān)鍵步驟。其目的是去除反應(yīng)體系中與反應(yīng)無關(guān)的成分、 未結(jié)合的酶結(jié)合物以及反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。 由于抗原和抗體的包被通常是在堿性條件下與固相的疏水鍵相互作用而被動吸附于其上的， 因此必須注意非離子去垢劑的使用濃度， 最常用的洗滌液是含 0.05 吐溫 20 的 0.02mol/l ， ph為 7.4 的

15、 pbs 液，如果洗滌液中的吐溫20 超過 0.2 ，可使包被于固相上的抗原或抗體解吸附而影響實驗的測定下限。洗滌可采用洗板機(jī)或手工洗滌兩種方式， 手工洗板則分為浸泡式和流水沖洗式洗滌。 無論洗板方式如何， 在向板孔內(nèi)注液時應(yīng)當(dāng)避免氣泡殘留孔內(nèi)， 否則會因洗滌液難以進(jìn)入孔中而影響洗滌效果。 在采用洗板機(jī)洗板時， 一定要將板條平放于板架上， 保證洗板機(jī)上的每個吸液針都能一致地插入板孔底部將洗液完全吸凈，否則空白值將升高甚至出現(xiàn) “花板 ”現(xiàn)象（背景不干凈） ， 造成實驗失敗， 尤其是當(dāng)酶結(jié)合物非特異吸附而殘留于板孔時。 若采用手工洗板，則可在每次棄去板孔內(nèi)液體后將反應(yīng)板于布料上拍干，布料可在消毒

16、洗滌后重復(fù)使用。手工洗板一般為35次，使用洗板機(jī)洗板時，其所需次數(shù)可通過以下實驗確定：選才18x12hbsag elisa 包被板條，在每孔中平行加入相同的一份弱陽性血清，按試劑盒說明加入酶結(jié)合物并完成溫育，洗板機(jī)設(shè)置如下：第 1 次洗滌 1 排、第 2 次洗滌 2 排、第 3 次洗滌 3 排直至8次洗滌8排，每次只洗滌1遍，其結(jié)果是第1排洗滌了 8遍，第2排洗滌7 遍第8排洗滌1遍，加底物顯色后，根據(jù)吸光度值不再改變的反應(yīng)條的洗滌次數(shù)來確定最佳的洗板次數(shù)， 例如第 3 排反應(yīng)條吸光度值不再改變， 則認(rèn)為該項目最佳洗滌條件為 6 遍。 另外有三方面必須注意： 一是在使用洗板機(jī)洗板時， 通常在上

17、機(jī)前應(yīng)先將反應(yīng)液棄去并用流水快速沖洗1 遍，避免因反應(yīng)液對洗板機(jī)管道污染而造成的交叉污染和背景顏色加深，但對于粘性大的稀釋液或反應(yīng)液而言， 則需直接上機(jī)洗滌， 并增加洗板后清水沖洗管路的次數(shù)；二是對于兩步法而言第一步洗滌次數(shù)不宜太多，否則將降低結(jié)果的吸光度值。4. 顯色顯色是 elisa 中的最后一步溫育反應(yīng)，在以 hrp 作為標(biāo)記酶的 elisa 試劑盒中，主要采用 tmb 和 opd 兩種底物，其中以 tmb 最為多見， tmb 底物顯色一般要求室溫或37 反應(yīng)1530分鐘。研究表明，顯色受時間和溫度的影響，一般 37 c反應(yīng)30分鐘可使顯色充分， 如果縮短反應(yīng)時間或者降低反應(yīng)溫度均可影響

18、檢測的下限。 為了保證結(jié)果的穩(wěn)定性， 必須固定顯色時間和溫度，但不少操作者往往忽略了這一點。 tmb 顯色體系的 a 液和 b 液可 在使用前先混合然后用排槍加入反應(yīng)孔中，這樣既節(jié)省人力又縮短了操作時差對結(jié)果的影響。反應(yīng)液應(yīng)新鮮配制并且避免接觸金屬器皿，否則可因氧化等原因產(chǎn)生顏色反應(yīng)。 opd 由于其具有致癌性目前已很少使用。5. 比色elisa 顯色的結(jié)果必須通過酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，有兩個重要的原因：一是不同的個體的色覺存在差異，如果僅憑肉眼判斷，則結(jié)果重復(fù)性差， 并且難以形成統(tǒng)一的判斷標(biāo)準(zhǔn)， 尤其是對于 hbeab 、 hbcab 這樣的檢測項目 ；二是日益頻繁的醫(yī)療糾紛要求臨床實驗室必須對e

19、lisa 檢測的原始吸光度值，陰陽性判斷結(jié)果等原始數(shù)據(jù)進(jìn)行保存，否則面對醫(yī)療糾紛時將無法舉證。tmb 的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（ sds ）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止，各類酸性終止液則將藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色。有實驗表明，從終止反應(yīng)后 2 分鐘開始，樣本的吸光度值逐漸下降， 起始吸光度值越高其下降速度越快， 為保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性， 宜在終止反 應(yīng)后 2 分鐘內(nèi)讀取吸光度值。酶標(biāo)儀應(yīng)采用雙波長進(jìn)行測定， 必須包括對顏色產(chǎn)物敏感和不敏感的兩個吸收峰波長， 在非敏感波長處測定特異性顯色的吸光度值接近為零， 此時測的吸光度值為容器上的劃痕、 指印、背景等造成的光干擾。以 tmb 底物為例，其最大

20、吸收的波長為 450nm ，非敏感波長為630nm ，雙波長檢測最終得到的吸光度值為兩者之差。 雙波長測定能去除背景的干擾，一 般不設(shè)空白孔，否則會出現(xiàn)吸光度值為負(fù)值的現(xiàn)象。酶標(biāo)儀的使用需強(qiáng)調(diào)儀器的維護(hù)和保養(yǎng)， 酶標(biāo)儀首先應(yīng)放置通風(fēng)處， 避免機(jī)器內(nèi)部尤其是濾光片發(fā)霉， 在使用過程中避免酸等物質(zhì)溢出腐蝕儀器， 每半年或一年請計量局對酶標(biāo)儀進(jìn)行檢定， 并請廠商定期維護(hù)。 比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體。 酶標(biāo)儀在使用 前應(yīng)先預(yù)熱1530分鐘，測讀結(jié)果會更穩(wěn)定。五、灰區(qū)的設(shè)置通常情況下， elisa 定性實驗以 “陽性 ”和 “陰性 ”來報告結(jié)果，兩者間有一條分界線被稱為 “陽 性判斷值

21、 ”（ cut-off alue ， co 值），這是定性免疫測定結(jié)果報告的依據(jù)。由于elisa co值的設(shè)置不能區(qū)分所有正常和異常的人群，尤其是位于co 值附近的人群，并且 elisa 檢測具有以下幾個特點：檢測變異大（18%65%）;不同試劑盒co值存在差異；病毒感染存在窗口期； 病毒變異后表達(dá)產(chǎn)物含量低以及個體差異等， 因此在 co 值附近存在一個臨床意義可疑的的區(qū)域被稱之為 “灰區(qū) ”， 在國內(nèi)的傳染性病原體抗原和抗體檢測的 elisa 試劑盒中均未涉及 “灰區(qū) ”的設(shè)置，但僅僅依靠co 值來決定感染的有無，尤其是對獻(xiàn)血員的篩查具有較大的風(fēng)險。 因此對于檢測結(jié)果位于 “灰區(qū)” 的病人可

22、采用確認(rèn)實驗或追蹤檢測的辦法加以確診。 目前 灰區(qū)”的設(shè)置有二種方式： cck （1ic） , c為該試劑的批內(nèi) c （一般在15-20%）; cot 2s, s為實驗室做室內(nèi)質(zhì)控roc （常規(guī)條件下的變異）的標(biāo)準(zhǔn)差。六、標(biāo)本復(fù)查elisa 手工檢測過程復(fù)雜，影響因素較多，即使室內(nèi)質(zhì)控在控，也可能因孔間差異而造成 結(jié)果的差異，因此加大復(fù)查力度是保證結(jié)果準(zhǔn)確性的可靠方法，比如對hbsag 、 hbeag 、hc-ab 、 hi-ab 、 tp-ab 等項目的可疑、弱陽性標(biāo)本及少見模式的檢測結(jié)果進(jìn)行復(fù)查。 復(fù)查方式主要有兩種： 一是采用同一種試劑復(fù)查， 理由是市售試劑均通過國家食品藥品監(jiān)督 管理局

23、（ sfda ）認(rèn)可，嚴(yán)格按照其說明書操作，檢測結(jié)果具有法律效應(yīng)，若使用不同的試 劑（非確證試驗） 復(fù)查， 當(dāng)結(jié)果不相符合時， 則最終結(jié)果難以判斷 （免疫檢測缺乏 “金標(biāo)準(zhǔn) ”） 。 另一種復(fù)查方式是采用國外進(jìn)口試劑進(jìn)行復(fù)查，其理由是盡管進(jìn)口試劑并不是 “金標(biāo)準(zhǔn) ”，但 實驗室已經(jīng)對此高度重視， 并且使用了質(zhì)量較好， 價格較貴的試劑， 但該法對于小醫(yī)院而言 則很難實施。 七、結(jié)果判斷和報告 常用下列幾種方法表示結(jié)果： 1. 定性測定 （1）陽性判定值法（cut-off alue ， co） ：一般為陰性對照的平均a 值加一個常數(shù)，試劑制備、檢測過程必須嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)化，要先計算出陽性對照 a 值平均

24、數(shù)和陰性對照 a 值平均數(shù)。標(biāo)本 a值瑋日性判定值為陽性。陽性判定值公式中的常數(shù)是在特定的檢測系統(tǒng)中通過對大量標(biāo)本 的實驗檢測而得到的?，F(xiàn)以hi檢測試劑盒為例。nc=陰性質(zhì)控對照的 a值；pc1=抗-hi-1陽性質(zhì)控對照的 a值；pc2二抗-hi-2陽性質(zhì)控對照的 a值；nc值的要求：nc必須小于 0.250 。 去掉大于等于0.250 的陰性質(zhì)控對照。 計算留下的陰性質(zhì)控對照的平均值（ ncx ） 。nc必須在0.6ncx和1.4ncx之間。去掉nc小于0.6ncx和大于1.4ncx的陰性質(zhì)控對 照。實驗滿足下列條件有效：多于半數(shù)的陰性質(zhì)控對照符合要求（一般為1個pc, 3個nc）; pc1

25、-ncg 0.400 ; pc2-ncg 0.400（如果使用）。如果實驗有效，co=ncx+0.100, 樣品 a 值大于等于co ，判定為有活性反應(yīng)。樣品 a 值小于 co ，判定為無活性反應(yīng)。根據(jù)以上敘述可以看出，在這種方法中陰性對照和陽性對照也起到了質(zhì)控的作用，試劑變質(zhì)和操作不當(dāng)均會產(chǎn)生 “實驗無效 ”的后果。由此可以看出為了避免檢測結(jié)果受單孔陽性或者陰性對 照的影響（當(dāng)參與co 計算時），必須設(shè)立多孔對照、合理布局，并限定取舍條件。（2）s/c （待測標(biāo)本 a值/校準(zhǔn)品 a值）：s/cr1.1為陽性，s/cv0.8為陰性；s/cr0.8但 l 為陽性。 （4）抑制率法：在競爭抑制法中

26、結(jié)果可用抑制率表示。抑制率（）=（陰性對照a值-標(biāo)本a值）/陰性對照a值x100% , 一般以抑制率 a5%為陽性。 2. 半定量測定結(jié)果一般以滴度表示。將標(biāo)本連續(xù)稀釋后，進(jìn)行elisa 檢測，在陽性臨界值以上的最高稀釋度即為該標(biāo)本的 “滴度 ”。 3. 定量測定 即用已知量的標(biāo)準(zhǔn)品作一系列稀釋后進(jìn)行elisa 測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以絕對量或單位表示。在elisa 定量檢測中每一塊反應(yīng)板都必須繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。4. 結(jié)果報告灰區(qū) ”的問題， 因此引入 “可疑 ”的報“結(jié)果已經(jīng)復(fù)查，建議定期復(fù)查co 值差異及變異系數(shù)大等因素，傳統(tǒng)的 elisa 結(jié)果只報告 “陽性 ”或者 “陰性 ” ，

27、但不能解決告方式是比較合理和科學(xué)的，同時對結(jié)果做必要的說明，如或定量檢測 ”；對于 hbeab 、 hbcab 檢測，由于各試劑盒結(jié)果缺乏可比性，位于co 值附近的標(biāo)本復(fù)查結(jié)果陰陽性只是概率事件，另外hbcab 存在原倍和 1 ： 30 檢測模式及定量檢測模式，報告結(jié)果的不一致對于臨床實驗室來說是不可回 避，也是目前醫(yī)療糾紛主要集中點和 “結(jié)果互認(rèn) ”的最大障礙，因此在減小室內(nèi)變異的同時必 須引入陽性和弱陽性的報告方式。 八、原始記錄 elisa 檢測結(jié)果變異大，不同體系難以溯源，因結(jié)果不一致而引起的醫(yī)療糾紛逐日增多， 因此 elisa 檢測的原始存根必須完整而全面地保存，包括布局，原始吸光度

28、值，檢測的陰 陽結(jié)果，檢測者，試劑廠家，批號，質(zhì)控品來源及批號等。嚴(yán)禁人為修改檢測結(jié)果。 九、質(zhì)量控制 1. 室內(nèi)質(zhì)量控制（室內(nèi)質(zhì)控）elisa 定性試驗的臨床意義在于是否檢出病原體，與檢出量無關(guān)，因此質(zhì)量控制（ quality control, qc ）要保證試驗的靈敏度和重復(fù)性。目前定性實驗的質(zhì)控規(guī)則還還存在爭議，目 前有以下幾種比較流行的理論： 室內(nèi)質(zhì)控品 室內(nèi)質(zhì)控品的穩(wěn)定以及合適的濃度是運(yùn)用一切質(zhì)控規(guī)則的前提。 可選擇 s/co 值減去精密度 測定中得到的三倍批間 c% （通常的 elisa 測定批間變異（ c% ）在 15%左右）與該s/co值的乘積（意即三倍sd ）仍大于 1 的質(zhì)

29、控血清作監(jiān)測重復(fù)性的室內(nèi)質(zhì)控品用。 計算公式：s/co （1-3c% ） =s/co-3sd 。同時選擇 s/co 處于 1.5 左右的質(zhì)控血清以判斷每次測定時 試劑盒測定下限的有效性。 “即刻性 ”質(zhì)控 一些實驗室不是每天進(jìn)行elisa 項目的檢驗，而elsia 部分試劑盒效期短 ，用同一批號試劑盒連續(xù)常規(guī)測 20 次，難度較大。采用 即刻法質(zhì)控統(tǒng)計方法，只需連續(xù)測3 次，即可對第3次檢驗結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控。先將測定值從小到大排列，x1最小，xn最大；計算x和s；計算si上限值和下限值。si = （x最小-x） /s, $1下=（x最大-x） /s;對照 si表，檢查是否出控。si上、下限w規(guī)定值

30、，在控； si上或下限 規(guī)定值，失控。 leey-jennings 質(zhì)控圖結(jié)合 westgard 多規(guī)則質(zhì)控方法 leey-jennings 質(zhì)控圖以及westgard 多規(guī)則質(zhì)控方法最早應(yīng)用于生化檢測的質(zhì)量控制，在elisa檢測中仍為探索階段，一般認(rèn)為：一 次超出3sd;連續(xù)二次超出2sd ;3 5次連續(xù)處于一側(cè)的2sd之內(nèi)；57次連續(xù)偏向橫軸的一側(cè)，均為失控。目前多采用一次超過 2sd 作為 “告警 ”，一次超出 3sd 為 “失控 ” 。 另外還有 westgard 多規(guī)則質(zhì)控規(guī)則、累積和（ cusum ）質(zhì)控規(guī)則等質(zhì)控方法。 衛(wèi)生部臨床檢驗中心確定的質(zhì)控方法： 室內(nèi)質(zhì)控品： 定性測定的

31、室內(nèi)質(zhì)控品， 除了試劑盒附帶的陰陽性對照外， 實驗室還應(yīng)該選擇 至少2個室內(nèi)質(zhì)控品，其中一個為弱陽性質(zhì)控品，接近 cutoff值，s/co值應(yīng)t亥為24之 間；另一個為陰性質(zhì)控品。定量測定則至少要求一個水平的質(zhì)控品。 測定頻度：每臺儀器，每次檢測患者樣本時至少測定一次室內(nèi)質(zhì)控品； elisa 測定每塊板 都要測定室內(nèi)質(zhì)控品。 質(zhì)控圖繪制：定性測定可采用弱陽性質(zhì)控品的 s/co 值作質(zhì)控圖。定量測定參照臨床化學(xué)的 繪制方法。 質(zhì)控判斷規(guī)則： 定性測定為弱陽性的質(zhì)控品不能測定為陰性； 陰性質(zhì)控品不能測 定為陽性。重復(fù)性的判斷規(guī)則為 12s （警告限）， 13s 為失控限。定量測定參照臨床化學(xué) 的判

32、斷規(guī)則。 室內(nèi)質(zhì)控的現(xiàn)狀及應(yīng)對措施 免疫質(zhì)控品制作困難，不管是自制血清或者購于其它機(jī)構(gòu)，其穩(wěn)定性和濃度很難達(dá)到要求， 加之 elisa 影響因素較多，失控后很難找到確切的原因。因此如何開展elisa 室內(nèi)質(zhì)控一直困擾著臨床檢測者。基于此，不同實驗室采取了不同的應(yīng)對措施，舉例如下：選擇衛(wèi)生部臨床檢驗中心（ nccl ）的低值質(zhì)控血清作為室內(nèi)質(zhì)控品，儲備量以 3 個月，采用一次超過 2sd 作為 “告警 ”， 一次超出 3sd 為 “失控 ”的質(zhì)控規(guī)則， （但該法對于hbeab（ 4ncu/ml ） 、hbcab（2ncu/ml）檢測不適用，因為即使質(zhì)控在控，其結(jié)果也可能為陰性）；由于質(zhì)控品不穩(wěn)定

33、，每個月需重新設(shè)立靶值，并根據(jù)常規(guī)c設(shè)定sd （sd= xc-）；陰陽性對照正常，室內(nèi)弱陽性和陰性質(zhì)控正常，且沒有出現(xiàn) “花板 ”（洗板不干凈，背景顏色深）的情況下認(rèn)為該檢測批有效，但仍需對位于 “灰區(qū) ”和弱陽性的 hbsag 、 hbeag 結(jié)果及少見模式結(jié)果進(jìn)行復(fù)查，避免偶然因素及孔間差對結(jié)果造成影響；若陰陽性對照、陰性質(zhì)控異常，或出現(xiàn) “花板 ”的情況則必須整批復(fù)查； 在陰陽性對照、 陰性質(zhì)控正常且未出現(xiàn) “花板 ”的情況下，弱陽性質(zhì)控s/co超出-3sd時復(fù)查位于 灰區(qū)”標(biāo)本，超出+3sd時則復(fù)查弱陽性標(biāo)本；對于抗體檢測，尤其是競爭法檢測 hbeab 、 hbcab ，由于不同試劑盒

34、、不同檢測方法間 co值存在差異及變異系數(shù)大等因素， 結(jié)果缺乏可比性， 失控后的處理很難滿意地解決， 在沒有統(tǒng)一的判斷標(biāo)準(zhǔn)、 較小的變異系數(shù)及明確的臨床意義的情況下， 引入弱陽性報告方式在臨床實踐中證明可行； 室內(nèi)質(zhì)控的評價： 認(rèn)真分析每一次室內(nèi)質(zhì)控失控的原因， 并對各項檢測的均值， c 等進(jìn)行月與月之間的比較分析， 及時發(fā)現(xiàn)試劑盒檢出能力的變化及操作中存在的問題，并采取適當(dāng)?shù)拇胧﹣硖岣邫z測的精準(zhǔn)性。2.室間質(zhì)量評價（室間質(zhì)評）室間質(zhì)評是一種回顧性評價， 主要是控制實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性， 也是某些定量實驗量值的溯源。作為臨床實驗室應(yīng)當(dāng)積極參與各級室間質(zhì)評計劃， 其要點是保證同病人標(biāo)本一樣對待室間質(zhì)

35、評物。 必須強(qiáng)調(diào)的是室間質(zhì)量評價結(jié)果必須同室內(nèi)質(zhì)控一并分析， 查找原因以期改進(jìn)工作中的不足，同時指導(dǎo)實驗室選擇合適的試劑盒。十、免疫檢驗存在的問題hb 基因組變異對病毒 hbsag 和 hbeag 測定影響問題， 以及如何評價試劑盒對這些變異株的檢測效能； hbcab 檢測在保證輸血安全中的意義； hbeab 、 hbcab 溯源性問題； hbcab檢測模式的問題等均困擾著臨床檢測者。1 李金明 . 臨床酶免疫測定技術(shù). 第 1 版. 北京：人民軍醫(yī)出版社， 2005 ： 87-105.2 沈霞 . 臨床免疫學(xué)與免疫學(xué)檢驗新技術(shù). 第 1 版. 北京： 人民軍醫(yī)出版社， 2002 ： 12-1

36、9.3 陶義訓(xùn) .免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗.第二版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1999 ： 140.4 李金明 . 乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物測定及結(jié)果解釋的若干問題 . 中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2006 ， 29 （ 5）： 385-389.5 衛(wèi)生部臨床檢驗中心，中國醫(yī)院協(xié)會臨床檢驗管理專業(yè)委員會 . 醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實驗室管理辦法及配套文件， 2006 ： 10-11.在定性免疫測定中，確定合適的陰陽性判斷值對減少假陽性和假陰性具有重要意義。處于陽性判斷值定值域中的測定結(jié)果可歸為可疑，即elisa測定的 灰區(qū)目前國內(nèi)用做傳染性病原體抗原或抗體檢測的elisa試劑盒沒有統(tǒng)一在定性免疫測定中，確定合適的陰陽性判斷值

37、對減少假陽性和假陰性具有重要意義。處于陽性判斷值定值域中的測定結(jié)果可歸為可疑，即 elisa測定的 灰區(qū)：目前國內(nèi)用做傳染 性病原體抗原或抗體檢測的elisa試劑盒沒有統(tǒng)一的灰區(qū)”設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)，而僅僅以陽性判斷值（cut off value, co值）來判斷陰陽性結(jié)果，這就會涉及到檢測結(jié)果低于但接近co值的血液是否合格的問題。根據(jù)elisa測定的co值來判斷結(jié)果，假陽/陰性不可能完全避免，其只不過是將假陽/陰性降低到較低的比例而已。那么 灰區(qū)”范圍設(shè)置多大才比較合適，我 們就此問題進(jìn)行了初步探討，現(xiàn)報告如下。1材料與方法1.1樣本 2007年5月一9月，本中心初、復(fù)檢抗hcv結(jié)果不一致但復(fù)核結(jié)果為

38、陰性的樣本1 394份。2006年1月2007年9月抗 hcv陽性報廢的血液樣本643份，并特意收 集這期間初、復(fù)檢結(jié)果不一致且陰性結(jié)果協(xié)方差值（ cov值）0 50的樣本44份。1 ncu/ ml抗 hcv定值血清（批號0802）由衛(wèi)生部臨床檢驗中心提供。樣本采集、保存與運(yùn)輸按照 全血及成分血質(zhì)量要求（gb18469 2001）”中 全血的質(zhì)量要求”收集全血，在血液采集后 4-6 h內(nèi)以1 500 r/min , 15 min離心取上清收集血漿并分成 3份，分別用于elisa方法 抗 h cv、fq pcr方法hcv rna檢測和復(fù)核檢測。-20c下保存期為3個月、-70c下保存期 為1年，

39、運(yùn)輸采用干冰。1. 2試劑與儀器酶聯(lián)免疫試劑盒初檢試劑（廈門新創(chuàng)公司卜復(fù)檢試劑（上海科華公司）、病毒核酸擴(kuò)增熒光檢測試劑盒（達(dá)安基因股份有限公司，批號： h10762）;（上海浩 源生物科技有限公司，批號： 20070021）、復(fù)核試劑測試系統(tǒng)cobas公司 ampliscreen hcv test （v2 0）,批號：hi0762o核酸擴(kuò)增實時熒光基因分析儀（達(dá)安基因股份有限公 司，da 76qq）、核酸自動提取系統(tǒng)（ chemagen 公司，magnetic separation module i 型）、 核酸提取儀（tbg公司，ez beads 32）、pcr核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)（abi公司

40、，7500實時p cr分析系統(tǒng)）、全自動樣品處理機(jī)（tecan公司，rsp200/8型）、全自動酶免分析儀（mi crolab 公司，fame 24/20型）。1.3 實驗設(shè)計初復(fù)檢篩查實驗采用 elisa方法，對初次具反應(yīng)性的樣本用相同試劑再次雙孔復(fù)試，所有陰性樣本再用fq pcr方法檢測。對于初、復(fù)檢結(jié)果不一致的樣本用fq pcr方法和cobas /xmpliscreen hcv test （v2 0）測試系統(tǒng)檢測。各項試驗均 嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行。1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 初、復(fù)檢2遍檢測均陽性的樣本測試結(jié)果納入陽性樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計，對初、復(fù)檢2遍檢測結(jié)果不一致的，以 hcv rna檢測結(jié)果

41、和復(fù)核試劑結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，如復(fù)核結(jié) 果為陽性，elisa結(jié)果數(shù)據(jù)均歸入陽性統(tǒng)計，否則歸入陰性數(shù)據(jù)統(tǒng)計。2結(jié)果2.1常規(guī)檢測初、復(fù)檢結(jié)果結(jié)果不一致且陰性結(jié)果 cov佗0 5。的樣本44份，以30%作為灰區(qū)范圍:處于灰區(qū)范圍”的樣本共10份，elisa檢測結(jié)果見表1。對這些樣本采 用fq pcr方法和coras ainpliscreen hcv test （v2 0）測試系統(tǒng)再次檢測，其中1份h cv rna陽性樣本，而elisa抗 hcv結(jié)果不確定，cov值為0 85i 35。從而表明篩 查試驗結(jié)果處于 灰區(qū)范圍”內(nèi)的樣本有可能就是陽性樣本。由表1結(jié)果可知，處于 灰區(qū)范圍”內(nèi)的樣本共io份，占本項研

42、究全部樣本的 0 4 9% （10/2037）,這些樣本經(jīng)文中方法鑒定后的真陽性和真陰性比例分別為10 0% （1/10）和9。0% （9/10）。另外，對結(jié)果不一致的樣本，分別統(tǒng)計2種試劑陽性結(jié)果 cov平均值、s和 cov 平均值+2s,計算值分別為 2 19、0 69、3 58； 2 07、0 84、3 75?？?cov 平均值、s和cov平均值+2s分別為2 13、0 77、3 67。從而表明結(jié)果不一致的樣本多為 cov值在2 0左右的弱陽性樣本，一般情況下cov值4 0。2. 2 1394份常規(guī)檢測初、復(fù)檢抗 hcv結(jié)果結(jié)果不一致而復(fù)試結(jié)果陰性的樣本, cov值波動范圍為0 00-1

43、 55,按cov值大小順序排列，以0 q5為組距，統(tǒng)計各組段的樣本數(shù)量，計算累計頻數(shù)和累計頻率，制作抗 hcv陰性樣本cov值頻數(shù)表，結(jié)果見表2。 由表2抗 hcv陰性樣本cov值頻數(shù)表數(shù)據(jù)，計算百分位數(shù) p25=0 117、p5qr 門9、p7 5=0 268、p95=0 76b 根據(jù)表2結(jié)果，以各組段樣本數(shù)量為縱坐標(biāo)，以cov值為橫坐標(biāo)作圖可見陰性樣本 cov值呈偏態(tài)分布，見圖1。2. 3抗 hcv陽性報廢的643份血液初、復(fù)檢結(jié)果統(tǒng)計結(jié)果：cov值波動范圍在0 00-22 00,按cov值大小順序排列，以0 50為組距，統(tǒng)計各組段的樣本數(shù)量，計算累計頻數(shù)和累計頻率，制作抗 hcv陰性樣本

44、cov值頻數(shù)表，結(jié)果見表3。由表瀕數(shù)表數(shù) 據(jù)，計算百分位數(shù)，p5=o 588、p25=l 628、p50=2 780、p75=5 163、p95=19 488。根據(jù)表3數(shù)據(jù)，以各組段樣本數(shù)量為縱坐標(biāo)，以cov值為橫坐標(biāo)作圖，可見陽性標(biāo)本cov值呈偏態(tài)分布，結(jié)果見圖2。表1抗hcv初、復(fù)檢結(jié)果不一致樣本 cov值1本初檢復(fù)檢1本初檢復(fù)檢1本羊初檢復(fù)檢1+(2 84)-(0 53)16+(2 46)-(0 61)31-(0 58)+(1 24)2+(2 35)-(0 61)17-(0 59)+(1 28)32-(0 56)+(2 95)0 3+(1 86)-(0 51)18-(0 52)+(1 3

45、)33-(0 65)+(1 85)4+(3 67)-(0 56)19-(0 53)+(1 52)34-(0 67)+(2 49)v+-2-+3，土+(174)(057)0(068)(237)5(089)(155)6(2+53)(0-68)1c 2(0-57)(2+34)63，(0士72)(1+7(1+86)(0-舁)2c 2-(0 52)(1+59)73(1+35)(085)8(2+21)(0-58)3c 2(0-59)(2+55)83(081)(2+54)9(i+42)(o-52)4c 2(0-54)(i+04)93(076)(2+66)1+-c 2-+4+0(228)(059)5(066)

46、(132)0(079)(224)1+-c 2-+4+1(153)(057)6(055)(301)1(088)(492)1+-c 2-+4+2(13;)(058)7(066)(184)2(180)(073)1+-c 2-+4+3(354)(055)8(058)(198)3(319)(078)1+-c 2-+4+4(232)(066)9(053)(162)4(153)(080)51(2+03)(。-63)00(0-68)+ g23)表2抗hcv陰性樣本cov值頻數(shù)co v累計n頻數(shù)累計頻率()co v累計n頻數(shù)累計頻率()005一47224717 720s55 133895 9801。一02354

47、939 38090 5 134396 3401558280757 89095 4 134796 63020-102101772 96100 4 135196 92025-13109878 77105 一6 135797 3503067117484 2211。一3 136097 56035-34121787 30115 5 136597 9204084126590 75120-6 137198 35045-21127791 61125 4 137598 6405001128792 32130 3 137898 8505541130193 33135 5 138499 28060一8130993

48、90140 2 138699 430658131794 48145 3 138999 640706132394 91150 4 139399 93075-6132995 341551139410062圖i抗 hcv陰性樣本cov值頻數(shù)圖2抗hcv陽性樣本cov值頻數(shù)處在co定值域中的測定結(jié)果可歸為可疑，也即 elisa測定的 灰區(qū)：由表2、3 結(jié)果可知，采用百分位數(shù)法，陰性樣本以單側(cè) 95%,陽性樣本以單側(cè)5%計算，p+5=0 588、 p-9刊 761, 故由陰、陽性樣本 cov值計算的灰區(qū)范圍為 0 588-0 761。2. 4陽性結(jié)果確證采用衛(wèi)生部臨床檢驗中心 1 ncu/ml定值質(zhì)控血清以及經(jīng)確證結(jié)果呈陽