論基因克隆的前景與應(yīng)用---本科論文

1、目錄緒論（序論）11基因、克隆的概念12 基因克隆研究的主要內(nèi)容121克隆工具的研究122 技術(shù)方法的研究. 123 研究對象目的基因的研究124過程研究13克隆研究的歷史2一、基因克隆技術(shù)21基因克隆技術(shù)的特點32基本方法與技術(shù)321傳統(tǒng)的方法322近期發(fā)展的經(jīng)典方法33基因克隆技術(shù)的基本步驟54基因克隆技術(shù)的表達(dá)系統(tǒng)6二、基因克隆技術(shù)早期開創(chuàng)性研究成就和近來的研究成果6 1微生物的基因克隆 611微生物基因克隆的工具酶612微生物基因克隆載體613微生物人為克隆載體的宿主714達(dá)載體的構(gòu)建8 1. 5融合蛋白的表達(dá)92植物的基因克隆93動物的基因克隆10 三、基因克隆技術(shù)的具體應(yīng)用及發(fā)展方

2、向111.繁殖性克隆111.1基因克隆技術(shù)與遺傳育種111.2 轉(zhuǎn)基因動植物的培育111.3 醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用1114基因克隆和DNA分析在法醫(yī)學(xué)和考古學(xué)中的應(yīng)用121. 5 特殊動物基因資源的保護(hù)121.6 建立動物模型，制備醫(yī)用實驗動物121.7 生物學(xué)基礎(chǔ)研究122. 治療性克隆12四、基因克隆技術(shù)意義與展望12五、結(jié)論12六、謝辭13參考文獻(xiàn)14 緒論（序論）1基因、克隆的概念 基因是細(xì)胞內(nèi)DNA分子上具有遺傳效應(yīng)的特定核苷酸序列的總稱，是具有遺傳效應(yīng)的DNA分子片段。基因控制蛋白質(zhì)合成，是不同物種以及同一物種的不同個體表現(xiàn)出不同的性狀的根本原因，即所謂“種瓜得瓜，種豆得豆”“龍生龍，鳳生

3、鳳，耗子生兒會打洞”?；蛲ㄟ^DNA復(fù)制及細(xì)胞分裂把遺傳信息傳遞給下一代，并通過控制蛋白質(zhì)的合成使遺傳信息得到表達(dá)。克?。╟loning）這個詞源于希臘語中clonos，即嫩枝，clonizo是砍下嫩枝的意思。許多世紀(jì)以來，克隆就廣泛地應(yīng)用與農(nóng)業(yè)方面，用這種方法不使用種子就可以把老樹的嫩枝經(jīng)插條變成樹苗。英文clone就是使用了這個意思，而克隆是clone的音譯。廣義上講，無性繁殖與克隆不同，前者指不經(jīng)雌雄兩性生殖細(xì)胞的結(jié)合，只由一個生物體產(chǎn)生后代的生殖方式，常見的有孢子生殖、出芽生殖和分裂生殖。植物的壓條或嫁接方式產(chǎn)生的新個體也叫無性生殖。后者是人工遺傳操作動物繁殖的過程。狹義上二者相同。在

4、生物的分子、細(xì)胞、個體三個不同層次上，“克隆”有不同的含義。在分子水平上，用分子生物學(xué)技術(shù)利用細(xì)菌或病毒使原來某一片段DNA形成一群DNA分子的過程，叫做分子克隆或DNA克隆，而且相同分子叫一個克隆。在生物學(xué)中，細(xì)胞克隆技術(shù)的正規(guī)名詞為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，包括微生物、動物和植物細(xì)胞以及動植物組織的培養(yǎng)，而得到大量的細(xì)胞或其代謝產(chǎn)物。自然界普遍存在植物、微生物的克隆，即使高等動物也不例外，同卵雙胞胎實際上就是一種胚胎水平上的克隆。2 基因克隆研究的主要內(nèi)容21克隆工具的研究主要的基因克隆載體：原核和真核載體、克隆和表達(dá)載體、質(zhì)粒載體、噬菌體、病毒、黏粒載體等。在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自我復(fù)制的DNA分子，就是外源

5、基因的運載體，有了它，外源DNA才能進(jìn)入受體細(xì)胞生存和繁殖，從而使基因克隆技術(shù)成為可能。 主要的工具酶：如限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接與聚合酶、單鏈核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、各種修飾酶等，它們使基因克隆操作在技術(shù)上成為可能。以上均在正文簡介。22 技術(shù)方法的研究 新的克隆方法不斷涌現(xiàn)，如以PCR為基礎(chǔ)的差異篩選技術(shù)、長片段DNA序列測定技術(shù)、高通量的基因芯片技術(shù)等。 23 研究對象目的基因的研究24過程研究241 供核細(xì)胞的來源 胚胎細(xì)胞和動物胎兒細(xì)胞是克隆動物的理想核供體來源。242細(xì)胞質(zhì)受體的來源243 重構(gòu)胚的核質(zhì)適應(yīng)機(jī)理 核移植重構(gòu)胚胎融合后核質(zhì)間細(xì)胞周期是否同期化、核重編程的能力如何和

6、核質(zhì)相適應(yīng)的機(jī)制等。 244 支持體系研究 包括了供核細(xì)胞和胞質(zhì)受體的采集技術(shù)和培養(yǎng)體系研究；核移植操作技術(shù)和有關(guān)設(shè)備研究等。245 重構(gòu)胚胎體內(nèi)和體外培養(yǎng)技術(shù) 孕育新生命的重構(gòu)胚胎需要在什么條件下培養(yǎng)發(fā)育，是提高克隆效率的關(guān)鍵。246 實用化研究研究的目的及意義：是為了用它來造福人類，為人類帶來利益。如研究（轉(zhuǎn)）基因克隆技術(shù)，以獲得更多的轉(zhuǎn)基因動物；培育動植物優(yōu)良品種及醫(yī)用實驗動物；異種動物克隆，用于珍稀瀕危動物的克隆和繁殖等等。247 應(yīng)解決的問題目前（基因）克隆在理論和技術(shù)實踐方面都還不很成熟，許多應(yīng)用還處在試驗階段，因此有賴于科學(xué)的進(jìn)步和研究者的不懈努力，爭取將它做的更好更美，早日為人

7、類利益服務(wù)。3克隆研究的歷史1932年，英國作家赫胥黎曾在他的小說美麗的新世界中預(yù)言，人類科技發(fā)展到復(fù)制人類自身時，便是世界混亂之日。明代小說家吳承恩在西游記中描寫無所不能、會七十二變的孫悟空時，特別描寫了他用來戰(zhàn)勝敵人的分身術(shù)：拔下一撮毛，吹上一口氣，就能變成無數(shù)個和他一模一樣的孫悟空人們充滿復(fù)制自我的幻想。1958年，Steward用胡蘿卜根細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生植株。1962年，Gurdon用成體細(xì)胞克隆了青蛙。1963年，我國童第周教授領(lǐng)導(dǎo)的科研組研究魚類胚胎細(xì)胞核移植獲得成功。同年，Haldane創(chuàng)造了“clone”一詞。1981年，Illmensee等人用鼠胚胎細(xì)胞培育出3只發(fā)育正常的小鼠

8、，其后許多科學(xué)家都用動物成熟胚胎細(xì)胞培育了正常的克隆羊、兔、牛等。1982年，1999年，2002年科學(xué)家們分別克隆出了帶有人類基因的轉(zhuǎn)基鼠，克隆羊、牛等。2001年，科學(xué)家將死亡的歐洲盤羊的顆粒細(xì)胞移入其卵母細(xì)胞構(gòu)建異種重構(gòu)胚，移植后獲得一個正常體細(xì)胞克隆羊，為瀕危物種保護(hù)提供了借鑒。2003年，世界上第一匹克隆騾子、馬誕生，開創(chuàng)了動物生下它自己的克隆體的先河。我國哺乳動物細(xì)胞核移植已取得成功，至1996年我國科學(xué)家已先后獲得克隆山羊、牛、豬。以上只是部分突出例子，從克隆發(fā)明至今，科學(xué)家的步伐一直在其研究領(lǐng)域上前行。一、基因克隆技術(shù) 先介紹兩個概念： 文獻(xiàn)中，基因克隆指在體外借助于能自我復(fù)制

9、的載體，將目的基因引入到受體（宿主）細(xì)胞中進(jìn)行增殖，以獲得大量的DNA片段，或以此為基礎(chǔ)，通過工程方法表達(dá)出大量相應(yīng)的基因（蛋白質(zhì)）產(chǎn)物。一般來說，此技術(shù)包括把來自不同生物的基因同有自主復(fù)制能力的載體DNA在體外人工連接，構(gòu)建成新的重組DNA，然后送入受體生物中去表達(dá)，從而產(chǎn)生遺傳物質(zhì)和狀態(tài)的轉(zhuǎn)移和重新組合。而基因工程又稱為重組DNA技術(shù)、基因克隆、遺傳工程、基因操作等。其核心技術(shù)是DNA重組，即基因克隆技術(shù)。指重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是基因重組、克隆和表達(dá)的設(shè)計與構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）；而下游技術(shù)則涉及到基因工程菌或細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)

10、以及基因產(chǎn)物的分離純化過程。它按照人們的需要，運用載體將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀或產(chǎn)生所需的基因產(chǎn)物的過程。采用重組DNA技術(shù)，將不同來源的DNA分子在體外進(jìn)行特異切割，重新連接，組裝成一個新的雜合DNA分子，在此基礎(chǔ)上，這個雜合分子能夠在一定的宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，形成大量的子代分子，此過程即為基因克隆。1 基因克隆技術(shù)的特點：是可以使一個生物體獲得與之原有形狀完全無關(guān)的新性能，從而使人們可在大量擴(kuò)增的細(xì)胞中，將控制某些新型藥物合成的目的基因克隆出來，轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞進(jìn)行高效表達(dá)，而提取純化得到大量珍貴藥物?；蚩寺〖夹g(shù)是一種嶄新的獲得生物新品種的育種技術(shù)，與其他育種技術(shù)相比，

11、具有如下特點：11 能像工程一樣可按人們的意愿來事先設(shè)計和控制。12 人工的、離體的、分子水平上所進(jìn)行的遺傳重組。13 能在動植物和微生物間進(jìn)行任意、定向的超遠(yuǎn)源雜交。2基本方法與技術(shù)21傳統(tǒng)的方法211化學(xué)合成法：指根據(jù)某種已知基因產(chǎn)物氨基酸序列，仔細(xì)選擇密碼子，可推導(dǎo)出該編碼基因的核苷酸序列，然后將核苷酸片段挨著縮合起來，成為一個個基因片段。 212物理化學(xué)法2121密度梯度離心法：利用密度梯度超離心技術(shù)可使切割成適當(dāng)片段的不同DNA按密度大小分開，進(jìn)而通過與某種放射性標(biāo)記的mRNA雜交來檢驗，分離相應(yīng)的基因。2122單鏈酶法：用加熱或變性試劑處理DNA，雙鏈上A、T配對較多的部位先變成單

12、鏈，應(yīng)用核酸酶切除，再離心，獲得無單鏈切口的DNA.2123分子雜交法：利用單鏈DNA與其互補(bǔ)的序列總有“配對成雙”的傾向進(jìn)行分離與鑒定某一基因。213 鳥槍法：又叫散彈射擊發(fā)。指利用分子雜交等技術(shù)在基因文庫中去釣取基因，并進(jìn)行基因克隆的方法。它意味著從含有較多的基因序列克隆中去獲取目的基因或序列。214 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)：又稱無細(xì)胞克隆系統(tǒng)，它可將極微量的靶DNA特異地擴(kuò)增上百萬倍。PCR技術(shù)已經(jīng)滲透到生物學(xué)的各個領(lǐng)域，在分子克隆和獲得cDNA全長方面起著重要的作用。利用PCR技術(shù)對特定條件下基因的表達(dá)進(jìn)行檢測即通過mRNA差別顯示（DDRT-PCR）可鑒定和分離出所需的目的基因

13、；通過RT-PCR克隆到目的基因的cDNA區(qū)域進(jìn)行cDNA文庫的構(gòu)建，通過錨定PCR或反向PCR可快速克隆到cDNA末端未知序列、功能基因調(diào)控區(qū)等。22近期發(fā)展的經(jīng)典方法221 逆轉(zhuǎn)錄酶促法：以目的基因的mRNA為模板，借助逆轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)的DNA,然后在DNA聚合酶的催化下合成雙鏈cDNA片段。它使用于未知序列基因或不同物種的高度保守基因的克隆。222應(yīng)用cDNA差異顯示分析法：充分發(fā)揮PCR能以指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈DNA模板，而僅以線性形式擴(kuò)增單鏈模板的特性，通過降低cDNA群體復(fù)雜性和更換其兩端接失等方法，特異性擴(kuò)增目的基因片段。另外，mRNA差別顯示法是對組織特異性表達(dá)基因進(jìn)行分離的一種快

14、速方法，是mRNA反轉(zhuǎn)錄與PCR相結(jié)合的RNA指紋圖譜技術(shù)。223 RACE(rapid amplification of CDNA ends)技術(shù)：即cDNA末端快速擴(kuò)增。是一項在已知CDNA序列的基礎(chǔ)上克隆5或3端缺失序列的技術(shù)，很大程度上依賴于RNA連接酶和寡聚帽子的快速擴(kuò)增。224基因的圖位克隆法：原理是根據(jù)功能基因在基因組中都有相對較穩(wěn)定的基因座，在利用分子標(biāo)記技術(shù)對目的基因進(jìn)行精細(xì)定位的基礎(chǔ)上，用與目的基因機(jī)密連鎖的分子標(biāo)記篩選DNA文庫，從而構(gòu)建目的基因區(qū)域的物理圖譜，在利用此物理圖譜通過染色體步移逐步逼近目的基因或通過染色體登錄的方法最終找到包含此目的基因的克隆，并通過遺傳轉(zhuǎn)化

15、實驗證實目的基因的功能。 225基因芯片法：指高密度固定在固相支持介質(zhì)（如玻片、硅片、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜等）上的生物信息分子（如寡核苷酸、基因片段、多肽、蛋白質(zhì)等）的微矩陣。列陣中每個分子的序列及位置都是已知的，并按預(yù)先設(shè)定好的順序點陣?；蛐酒巧镄酒囊环N，其上固定的是核酸類物質(zhì)，主要用于DNA、RNA分析。分為DNA芯片和微點陣兩種。分離目的基因是是指從基因組中發(fā)現(xiàn)或找出某個目的（標(biāo)）基因。其原理是應(yīng)用已知序列的核酸作為探針進(jìn)行雜交，對未知核酸序列進(jìn)行檢測。它能在同一時間內(nèi)分析大量的基因，實現(xiàn)生物基因大規(guī)模檢測。226 酵母雙雜交系統(tǒng)分離克隆基因：酵母雙雜交系統(tǒng)體系可以發(fā)現(xiàn)蛋白相互

16、作用的蛋白的編碼基因。這種方法的用途有：驗證已知基因間的相互作用；可以快速發(fā)現(xiàn)編碼蛋白與蛋白間相互作用的特定區(qū)域；通過掃描文庫與活化區(qū)域的作用可以發(fā)現(xiàn)相互所用的蛋白，只需一個質(zhì)粒就可以直接得到編碼蛋白的基因，無需制備抗體和純化蛋白。操作相對簡便、快速，不用經(jīng)過蛋白純化即可獲得編碼基因。 227功能蛋白組分離目的基因：蛋白組是指細(xì)胞內(nèi)全部蛋白的存在及活動方式，即基因組表達(dá)產(chǎn)生的總蛋白質(zhì)的統(tǒng)稱。功能蛋白質(zhì)組是指那些可能涉及到特定功能機(jī)理的蛋白質(zhì)群體。主要研究方法為蛋白質(zhì)雙向電泳。通過高效液相色譜對蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析，在借用分子生物學(xué)的手段則可以進(jìn)行目的基因的分離。如免疫篩選法分離目的基因：是通過蛋

17、白的特異抗體與目的蛋白的專一結(jié)合，從表達(dá)文庫中分離目的基因的蛋白基因。228插入突變分離克隆目的基因：獲得突變體進(jìn)行未知基因的克隆是常用的方法之一。轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法是將一株攜帶有功能性轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的植物與遺傳上有差異的同種植物雜交，因轉(zhuǎn)座因子插入到某一特定的基因序列而破壞了該基因編碼的蛋白，進(jìn)而導(dǎo)致可見的表性的破壞或改變，這樣就可以在產(chǎn)生后代中篩選出新型的突變體。 229 生物信息學(xué)在分離克隆基因中的應(yīng)用：生物信息學(xué)是在生命科學(xué)的研究中，以計算機(jī)為工具對生物信息進(jìn)行儲存、檢索、和分析的科學(xué)。基因組信息學(xué)的首要任務(wù)之一就是發(fā)現(xiàn)新的基因核心的功能，是發(fā)現(xiàn)新基因的重要手段。如利用EST數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)新基因（電腦

18、克隆）：尋找到與克隆有關(guān)的EST后，用電子cDNA文庫進(jìn)行篩選；通過生物信息學(xué)軟件進(jìn)行分析和查詢，最終獲得一個基因的全長cDNA。 除上述幾種基本的方法外，隨著生物技術(shù)的發(fā)展和傳統(tǒng)技術(shù)的改良，基因可隆的方法又有許多新的技術(shù)出現(xiàn)。如Gateway 大規(guī)模克隆技術(shù)。基因表達(dá)序列標(biāo)記分析（SAGE）；由DDRT-PCR演變而來的代表性差異分析（RDA）；抑制型差減雜交（SSH）基于反轉(zhuǎn)錄的雙接頭扣除的差異分析；轉(zhuǎn)錄活動的DNA差減雜交技術(shù)（TADSH）、利用限制性片段多態(tài)性的cDNA-AFLP等等。這些技術(shù)作為基因分離可隆的方法，較以前的技術(shù)都具有一定的優(yōu)點，又有各自的不盡相同的用途。3基因克隆技術(shù)

19、的基本步驟基因的克隆和分離是重組DNA技術(shù)中基本和重要的部分，沒有克隆化基因就無法開展基因工程研究，基因的克隆首先通過構(gòu)建文庫，使每個基因（或DNA片段）形成一個可擴(kuò)增的克隆，然后通過篩選找到目的基因?；蚩寺』静僮魇疽鈭D 31 采用各種方法從復(fù)雜的生物體基因組中分離獲得帶有目的基因的DNA片段。獲取的方法：用限制性內(nèi)切酶酶解染色體DNA，構(gòu)建基因組文庫，再從基因組文庫中篩選目的基因。分離純化細(xì)胞中的mRNA，以mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下生成cDNA第一鏈，再以cDNA第一鏈為模板在DNA聚合酶作用下生成雙鏈cDNA,構(gòu)建cDNA文庫，從中篩選所需的目的基因。人工體外合成基因：用于制備

20、小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。PCR法擴(kuò)增基因：用PCR法可選擇性擴(kuò)增基因組中所要研究的個別基因或DNA片段，或用反向PCR技術(shù)，先將特定mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈，然后再進(jìn)行擴(kuò)增。32 在體外，將它連接到具有自我復(fù)制功能及篩選標(biāo)記的載體分子上，構(gòu)建重組DNA分子（也稱重組體）。33 將重組體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞，并隨之繁殖而擴(kuò)增34 從細(xì)胞繁殖群體中篩選獲得重組體的受體細(xì)胞克隆（也叫重組子）。從不同的重組DNA分子獲得的轉(zhuǎn)化子中鑒定出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子即陽性克隆的過程就是篩選。方法有 插入失活法 PCR篩選和限制酶酶切法 核酸分子雜交法 免疫學(xué)篩選法 35再提取或篩選擴(kuò)增的目的基

21、因，以做進(jìn)一步的分析鑒定。陽性重組體的篩選可利用載體上的遺傳標(biāo)志，包括抗藥性、氨基酸合成酸系和顏色反應(yīng)等。重組DNA的鑒定有多種方法，如限制性酶切圖譜、DNA測序，Southern印跡雜交、Northern印跡雜交等，可根據(jù)情況酌情使用。36將目的基因克隆到合適的表達(dá)載體上，導(dǎo)入宿主細(xì)胞，構(gòu)建高效、穩(wěn)定的具有功能性表達(dá)能力的基因工程細(xì)胞。37利用工程技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)，獲得大量的外源基因表達(dá)產(chǎn)物。38 產(chǎn)物的分離純化，并最終獲得所需的基因工程產(chǎn)物。4 基因克隆技術(shù)的表達(dá)系統(tǒng)。利用基因克隆技術(shù)產(chǎn)生體內(nèi)用重要價值的生物產(chǎn)品（如蛋白質(zhì)），是通過將外源基因與表達(dá)載體構(gòu)成的DNA重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞中高效表達(dá)

22、實現(xiàn)的。其表達(dá)系統(tǒng)有原核和真核表達(dá)系統(tǒng)兩大類。41 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)就是使克隆的外源基因在原核細(xì)胞中以發(fā)酵的方式快速、高效地合成基因產(chǎn)物。42 在真核中的表達(dá)系統(tǒng)包括酵母、昆蟲細(xì)胞及哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)。 基因克隆技術(shù)具體操作及表達(dá)以微生物基因克隆為例簡介！二、 基因克隆技術(shù)早期開創(chuàng)性研究成就和近來的研究成果基因克隆技術(shù)包括了一系列技術(shù)，它大約建立于70年代初期。美國斯坦福大學(xué)的伯格（P.Berg）等人于1972年把一種猿猴病毒的DNA與噬菌體DNA用同一種限制性內(nèi)切酶切割后，再用DNA連接酶把這兩種DNA分子連接起來，于是產(chǎn)生了一種新的重組DNA分子，從此產(chǎn)生了基因克隆技術(shù)。19

23、73年，科亨（Cohen）和波伊爾(Boyer)發(fā)明了克隆技術(shù)，成功地將外源基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌細(xì)胞并得以表達(dá)。從那以后，便迅速發(fā)展。如大腦生長激素釋放抑制素、胰島素原前體因子、人胰島素A與B鏈基因、人生長激素、干擾素、人尿激酶基因、口蹄疫與狂犬病疫苗等基因的克隆，以及改良品種。近期的研究成果主要在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和醫(yī)藥方面取得豐碩成果：如農(nóng)業(yè)上已能培育攜帶人某些基因、抗病、蟲、逆境和高產(chǎn)量高蛋白等的轉(zhuǎn)基因植物。畜牧業(yè)上以培育轉(zhuǎn)基因動物為主。醫(yī)藥上已能生產(chǎn)各種生物制品和蛋白質(zhì)、氨基酸等。1、微生物的基因克隆自然界下，微生物大多是通過無性繁殖而形成群體的克隆。微生物基因克隆包括四大要素及其操作步驟。要素

24、： 外源目的基因、克隆載體、工具酶和宿主受體細(xì)胞。主要步驟為分離或合成基因，體外重組將基因插入載體，重組 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，基因克隆和篩選重組子，克隆的基因進(jìn)行鑒定或測序和外源基因的表達(dá)和基因產(chǎn)物的獲得。指對微生物基因進(jìn)行在基因水平上進(jìn)行遺傳改造。11微生物基因克隆的工具酶 對 DNA 片段進(jìn)行操作，必須要運用能“切斷”DNA 的得心應(yīng)手的工具。工具酶就是對不同來源的 DNA 片段進(jìn)行切割拼接組裝。在分離目的基因或切割載體時，需利用特異的限制性核酸內(nèi)切酶對 DNA 進(jìn)行準(zhǔn)確切割。在構(gòu)建重組 DNA 時，需要 DNA 連接酶催化，使目的 DNA 片段與載體 DNA 進(jìn)行連接。 111限制性核酸

25、內(nèi)切酶 限制性核酸內(nèi)切酶：是指能識別雙鏈 DNA 分子的特定序列，并在識別位點或其附近切割 DNA 的一類內(nèi)切酶。在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)限制性酶可以降解外源的 DNA 分子，而細(xì)菌 DNA 甲基化，可以避免本身 DNA 分子被酶降解。這是生物的保護(hù)機(jī)制。 112DNA 連接酶 將不同的 DNA 片段連接在一起的酶叫 DNA 連接酶。 DNA 連接酶主要來自 T 4 噬菌體和大腸桿菌。 DNA 連接酶主要有兩種：一種是 T4 DNA 連接酶，另一種是大腸桿菌 DNA 連接酶。12微生物基因克隆載體 克隆載體是把一個有用的目的 DNA 片段通過重組 DNA 技術(shù)，送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖和表達(dá)的工具叫載體。

26、目的基因如果沒有合適的載體協(xié)助，很難進(jìn)入受體細(xì)胞，即使能進(jìn)入，往往也不能進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，因為這些外源性DNA一般不帶有復(fù)制調(diào)控系統(tǒng)。為了保證目的基因或外源DNA片段能在細(xì)胞內(nèi)克隆，必須將它們與適當(dāng)?shù)妮d體連接。其基本要求是： 能進(jìn)行獨立自主復(fù)制； 具有便于外源 DNA 的插入和限制酶作用的單一切割位點； 必須具有可供選擇的遺傳標(biāo)記，例如具有對抗生素的抗性基因，便于對陽性克隆的鑒別和篩選。基因克隆中使用的載體基本上均來自微生物，主要包括七大類： 121 質(zhì)?？寺≥d體 質(zhì)粒是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，經(jīng)人工修飾改造后作為克隆載體。 大腸桿菌質(zhì)粒 pBR322 是基因克隆中最常用的代表性質(zhì)粒，是環(huán)狀

27、雙鏈DNA分子。122 噬菌體克隆載體 是基因克隆中一類有價值的克隆載體。 123 柯斯質(zhì)粒載體 即粘粒載體，是由噬菌體的粘性末端和質(zhì)粒構(gòu)建。124 M 13 噬菌體載體 M 13 是大腸桿菌絲狀噬菌體。125 噬菌體質(zhì)粒載體 是由絲狀噬菌體和質(zhì)粒載體 DNA 融合而成，在寄主細(xì)胞內(nèi)以質(zhì)粒形式存在，復(fù)制產(chǎn)生雙鏈 DNA 。 126 真核生物的克隆載體 ： 1261酵母質(zhì)粒載體 是利用酵母的 2m 質(zhì)粒和其染色體組分與細(xì)菌質(zhì)粒 pBR322 構(gòu)建而成的，能分別在細(xì)菌和酵母菌中進(jìn)行復(fù)制，所以又稱為穿梭載體。1262真核生物病毒載體 如哺乳動物、昆蟲、植物病毒載體 127 人工染色體 是一類目前能容

28、納最大外源 DNA 片段人工構(gòu)建的載體。13微生物人為克隆載體的宿主 為了保證外源基因在細(xì)胞中的大量擴(kuò)增和表達(dá)，選擇合適的克隆載體宿主就成為基因克隆的重要問題之一。 131 作為宿主的基本要求特性 一個理想的宿主的基本要求是： 能夠高效吸收外源 DNA ； 具有使外源 DNA 進(jìn)行高效復(fù)制的酶系統(tǒng)； 不具有限制修飾系統(tǒng)，不會使導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)未經(jīng)修飾的外源 DNA 發(fā)生降解； 一般為重組缺陷型菌株，使克隆載體 DNA 與宿主染色體 DNA 之間不發(fā)生同源重組； 便于進(jìn)行基因操作和篩選； 具有安全性。宿主細(xì)胞應(yīng)該對人、畜、農(nóng)作物無害或無致病性等。 原核生物的大腸桿菌及真核生物的釀酒酵母，由于它們具

29、有一些突出優(yōu)點如生長迅速、極易培養(yǎng)、能在廉價培養(yǎng)基中生長，其遺傳學(xué)及分子生物學(xué)背景十分清楚，因此已成為當(dāng)前基因克隆宿主。132 外源 DNA 導(dǎo)入宿主細(xì)胞 1321外源 DNA 導(dǎo)入原核微生物細(xì)胞 外源 DNA 通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染以及感染等方式被導(dǎo)入原核生物細(xì)胞。 1322外源 DNA 導(dǎo)入真核微生物細(xì)胞 外源 DNA 導(dǎo)入真核微生物細(xì)胞，一般利用蝸牛酶除去酵母細(xì)胞壁形成原生質(zhì)體，再用 CaCl2 和聚乙二醇處理，重組 DNA 以轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入酵母細(xì)胞的原生質(zhì)體，最后將轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體置于再生培養(yǎng)基的平板中培養(yǎng)，使原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁形成完整酵母細(xì)胞。 133 基因文庫與 cDNA 文庫的構(gòu)建 利用

30、重組 DNA 技術(shù)，可將某一原核微生物或真核微生物染色體基因組的全部遺傳信息貯存在由重組體群體（如重組噬菌體群體）構(gòu)成的基因文庫（ genomic library ）或 cDNA 文庫（ cDNA library ）之中，以供長期貯存和隨時調(diào)取克隆基因使用。 1331基因文庫的構(gòu)建 所謂基因文庫是指生物染色體基因組各 DNA 片段的克隆總體。文庫中的每一個克隆只含基因組中某一特定的 DNA 片段。一個理想的基因文庫應(yīng)包括該生物染色體基因組全部遺傳信息即全部 DNA 序列。 構(gòu)建的簡單步驟： 從組織或細(xì)胞提取基因組 DNA ； 用限制性酶部分水解或機(jī)械剪切成適當(dāng)長度的 DNA 片段，經(jīng)分級分離選

31、出一定大小合適克隆的 DNA 片段； 通常采用噬菌體或柯斯質(zhì)粒載體等容載量較大的克隆載體，在適當(dāng)位點將載體切開； 將基因組 DNA 片段與載體進(jìn)行體外連接； 重組體 DNA 直接轉(zhuǎn)化細(xì)菌或用體外包裝的重組噬菌體顆粒感染敏感細(xì)菌細(xì)胞。最后得到攜帶重組 DNA 的細(xì)菌群體或噬菌體群體即構(gòu)成基因文庫。 1332 cDNA 文庫的構(gòu)建 所謂 cDNA 文庫是指生物體全部 mRNA 的 cDNA 克隆總體。 其每一個克隆只含一種 mRNA 信息。 構(gòu)建步驟： 從生物體或細(xì)胞中提取 mRNA ； 利用逆轉(zhuǎn)錄酶以寡聚或隨機(jī)寡聚核苷酸為引物合成 cDNA 的一條鏈； 利用 DNA 聚合酶 I ，以第一條鏈作為

32、模板，用適當(dāng)引物合成 第二條鏈，常用 RNA 酶 H 在雜交分子的 mRNA 鏈上造成切口和缺口，產(chǎn)生一系列 RNA 引物，或是除去雜交分子的 mRNA 后，加入隨機(jī)引物，即可合成第二條鏈； 與載體的體外連接； 噬菌體的體外包裝及感染或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。由于 它不含基因的啟動子和內(nèi)含子，因而序列比基因短，其克隆載體可選用質(zhì)?；虿《据d體。 134重組體的篩選與鑒定 在構(gòu)建文庫之后就需要從眾多的克隆中，篩選出含有目的基因的重組體，并鑒定其正確性。這通常有三種鑒定方法1341重組體表型特征的鑒定：抗生素平板法、 插入失活法 插入表達(dá)法 - 半乳糖苷酶顯色反應(yīng)法1342重組 DNA 分子結(jié)構(gòu)特征的鑒定 菌落

33、（或噬菌斑）原位雜交 內(nèi)切酶圖譜鑒定 PCR 鑒定 DNA 序列測定1343外源基因表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 ： 表達(dá)產(chǎn)物免疫活性測定 表達(dá)產(chǎn)物生物活性檢查 表達(dá)產(chǎn)物氨基酸序列測定14表達(dá)載體的構(gòu)建 所謂表達(dá)載體是指宿主細(xì)胞基因表達(dá)所需調(diào)節(jié)控制序列，能使克隆的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯的載體。原核生物和真核生物的表達(dá)載體有一些共同的要求，但兩者的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制有很大不同，故需要分別采用原核生物和真核生物的調(diào)控原件來構(gòu)建。 當(dāng)真核生物基因在原核細(xì)胞中表達(dá)時，表達(dá)產(chǎn)物有兩種形式：一種是非融合蛋白，另一種是融合蛋白。141 表達(dá)系統(tǒng)的要求與主要調(diào)控元件 在用原核細(xì)胞表達(dá)真核生物基因時，應(yīng)注意以下三個問題：

34、基因的編碼區(qū)必須是連續(xù)的，因此要用切除內(nèi)含子的 cDNA ； 基因必須置于原核細(xì)胞啟動子、終止子和 SD 序列的控制之下，才能被宿主的轉(zhuǎn)錄與翻譯系統(tǒng)有效識別； 產(chǎn)生的 mRNA 必須相對穩(wěn)定并能有效進(jìn)行翻譯和蛋白質(zhì)折疊。此外還要防止外源蛋白被宿主蛋白酶降解。主調(diào)控元件如下： 1411啟動子 指 RNA 聚合酶結(jié)合于 DNA 并起始合成 RNA 的一段 DNA 控制序列。原核基因啟動子位于轉(zhuǎn)錄起點上游（左側(cè)），它由兩段彼此分開且又高度保守的核心序列組成。1412核糖體結(jié)合位點 1413轉(zhuǎn)錄終止子 指一段位于基因或操縱子的末端，具有終止轉(zhuǎn)錄功能的特定 DNA 序列。1414密碼子的偏愛性 由于密碼

35、子的簡并性，一個氨基酸可有多個密碼子。142表達(dá)載體中調(diào)節(jié)開關(guān)的作用 在原核基因表達(dá)調(diào)控中，阻遏蛋白操縱基因系統(tǒng)起著重要調(diào)節(jié)開關(guān)的作用。當(dāng)阻遏蛋白與操縱基因相結(jié)合時，能夠阻止基因的轉(zhuǎn)錄。加入誘導(dǎo)物，使其與阻遏蛋白結(jié)合，解除阻遏，從而啟動基因轉(zhuǎn)錄。 143 非融合蛋白的表達(dá) 所謂非融合蛋白是指外源蛋白不與宿主蛋白融合，使其自身單獨表達(dá)。 1431非融合蛋白表達(dá)載體 為了在原核細(xì)胞中表達(dá)這非融合蛋白，可將帶有起始密碼子的真核基因插入到合適的原核啟動子和 SD 序列下游。經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯，就可在原核細(xì)胞中，表達(dá)出非融合蛋白。1432 外源蛋白的分泌表達(dá) 如果合成的外源蛋白能不斷從細(xì)胞內(nèi)分泌出來，不僅可免

36、受宿主細(xì)胞中蛋白酶的降解，而且有利分泌。1433包涵體 當(dāng)外源蛋白在大腸桿菌高水平表達(dá)時，常常在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集而形成包涵體。在于提高外源蛋白的表達(dá)水平和對產(chǎn)物的純化。15 融合蛋白的表達(dá) 所謂融合蛋白是由一條短的原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起的雜合蛋白。151融合蛋白的表達(dá)載體 為了獲得正確編碼的外源蛋白，外源基因編碼區(qū)在插入表達(dá)載體中原核基因編碼區(qū)時，閱讀框架應(yīng)保持一致，翻譯時才不會產(chǎn)生移碼突變。152表達(dá)融合蛋白的優(yōu)點 融合蛋白較易獲得高效表達(dá)。融合蛋白的 N 端總選擇天然的高效表達(dá)的宿主蛋白質(zhì)，其 mRNA 具有較強(qiáng)的翻譯能力。融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)比較穩(wěn)定。153 融合蛋白中目的蛋白的分離純化

37、酶法。 化學(xué)法微生物的基因克隆主要應(yīng)用于優(yōu)良菌種的保存和發(fā)酵工程生產(chǎn)抗生素等生物制品。將在下文介紹。2、植物的基因克隆 由于植物發(fā)育，生理生化，分子遺傳等學(xué)科的迅速發(fā)展,使人們掌握了大量有關(guān)植物優(yōu)良性狀基因的生物學(xué)和遺傳學(xué)知識，運用先進(jìn)的酶學(xué)和生物學(xué)技術(shù)及植物基因工程中的基因添加 、基因消減等方發(fā)，已經(jīng)克隆出了與植物抗病、抗蟲、抗除草劑、抗逆境、不育性、高蛋白質(zhì)及與植物發(fā)育有關(guān)的許多基因。其基本原理和微生物基因克隆大體相同。其策略與方法有：21功能克隆就是根據(jù)性狀的基本生化特性這一功能信息,在鑒定和已知基因的功能后克隆。特點是用基因表達(dá)的產(chǎn)物蛋白質(zhì)來克隆基因、雖然某一性狀的編碼基因是未知的。如

38、果對其生理生化及代謝途徑研究的比較清楚,就可以分離和純化控制該性狀的蛋白質(zhì)。因此功能克隆的關(guān)鍵是分離出一個純度很高的蛋白質(zhì)。目前已構(gòu)建了天麻cDNA文庫,制備抗體探針成功地分離了編碼天麻抗真菌蛋白基因的cDNA克隆,為抗真菌基因在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等方面的應(yīng)用打下了基礎(chǔ)22 定位克隆根據(jù)遺傳連鎖分析,染色體步移將基因定位到染色體的一個具體位置上后不斷縮小篩選區(qū)域進(jìn)而克隆該基因,研究該基因的功能或抗性的生化機(jī)制?？蓪⑴c已知的某一DNA標(biāo)記連鎖的基因在染色體上定位。用這種方法已分別克隆到擬南芥菜、番茄、水稻等植物中的有關(guān)抗病基因23轉(zhuǎn)座子標(biāo)記法轉(zhuǎn)座子是可從一個基因位置轉(zhuǎn)移到另一位置的DNA片段。通過轉(zhuǎn)座子

39、上的標(biāo)記基因(如抗藥性等)就可檢測出突變基因的位置和克隆出突變基因來。利用轉(zhuǎn)座子克隆植物基因的操作步驟主要應(yīng)是以下幾方面： 把已分離得到的轉(zhuǎn)座子與選擇標(biāo)記構(gòu)建成含轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒載體。把轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入目標(biāo)植物。利用Southern雜交等技術(shù)檢測轉(zhuǎn)座子是否從載體質(zhì)粒中轉(zhuǎn)座到目標(biāo)植物基因組中。這是轉(zhuǎn)座子定位和分離目標(biāo)基因所不可缺少的。轉(zhuǎn)座子插入突變的鑒定及其分離。目前已在玉米、煙草、番茄、亞麻等植物中克隆出抗性基因24人工合成并克隆基因蜘蛛毒素是一種小肽，它只有37個氨基酸，體外實驗表明它能殺死多種對農(nóng)作物有害的昆蟲基因?？筛鶕?jù)蜘蛛毒素的氨基酸序列，采用植物偏愛密碼子、人工合成并克隆此肽的基因。25表型克

40、隆有些植物目前并不了解它的基因產(chǎn)物，也沒有對它們進(jìn)行基因定位，但已知植物在表型上存在差異，利用表型差異或組織器官特異表達(dá)產(chǎn)生的差異來克隆植物基因就是表型克隆。表型克隆在策略上試圖將表型與基因結(jié)構(gòu)或基因表達(dá)的特征聯(lián)系起來，從而分離特定表型相關(guān)基因，力求不必事先知道基因的生化功能或圖譜定位，根據(jù)基因的表達(dá)效應(yīng)就直接分離該基因。已從擬南芥中克隆出赤霉素合成酶基因。26 mRNA差異顯示 研究基因表達(dá)差異,研究兩基因組差異表達(dá)基因的分離，為克隆復(fù)雜性狀相關(guān)基因開辟重要的途徑。目前已被成功地用來分離小麥熱激蛋白基因和水稻蔗糖調(diào)節(jié)基因。27 減法雜交 植物在生長發(fā)育過程中不同組織或同一組織的不同發(fā)育階段，

41、由于基因特異性的表達(dá)，其mRNA表現(xiàn)不同，這樣從表達(dá)特異基因的組織中提取 mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，從無特異基因表達(dá)的組織中提取mRNA，兩者雜交，在表達(dá)特異基因的組織和無特異基因表達(dá)的組織中均表達(dá)的基因產(chǎn)物形成雜交分子，而特異mRNA轉(zhuǎn)錄的cDNA仍保持單鏈狀態(tài)，把這種單鏈cDNA分離出來即為差異表達(dá)的基因。用此技術(shù)已克隆了小麥春化相關(guān)基因。28PCR擴(kuò)增克隆目前已在玉米、水稻、向日葵、巴西豆等植物中分離出富含甲硫氨酸的蛋白及其編碼基因。2 9依據(jù)序列同源性克隆基因生物的種、屬之間編碼基因序列的同源性高于非編碼區(qū)的序列。此方法的基本作法是在其它種屬的同源基因被克隆的前提下，構(gòu)建cDNA文庫

42、或基因組文庫，然后以已知的基因序列為探針來篩選目的克隆。 3、動物的基因克隆 動物基因克隆技術(shù)與微生物和植物基因克隆的基本原理與技術(shù)方法大體相同。目前主要是動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)和動物克隆技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，以培育轉(zhuǎn)基因動物和基因打靶克隆動物為主。 31 轉(zhuǎn)基因動物：指將確定的外源基因（如人的各種基因）通過生殖細(xì)胞或早期胚胎導(dǎo)入動物個體的染色體上并能穩(wěn)定遺傳給后代的動物。在其上進(jìn)行基因操作即為動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)。32 基因打靶技術(shù)。指建立在同源重組、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)上的一種綜合技術(shù)。即用人們所設(shè)計的一段DNA對準(zhǔn)靶基因，對目的基因進(jìn)行剔除、修飾，改變生物體遺傳信息，產(chǎn)生新一代

43、轉(zhuǎn)基因動物。 其中涉及動物的克隆主要有胚胎分割、人工受精與胚胎移植、胚胎干細(xì)胞核移植、動物胎兒成纖維細(xì)胞核移植、體細(xì)胞核移植、雌核生殖。其具體應(yīng)用在下文介紹三、基因克隆技術(shù)的具體應(yīng)用及發(fā)展方向基因克隆的廣闊應(yīng)用前景大致可分為兩大類：1繁殖性克?。阂垣@得克隆動物為目的的研究方向。1.1基因克隆技術(shù)與遺傳育種：主要表現(xiàn)在農(nóng)作物和動物方面。服務(wù)農(nóng)、林、漁、畜牧業(yè)：農(nóng)作物方面主要克隆培養(yǎng)能改善光合作用、充分固氮、高產(chǎn)量、高蛋白含量、維生素、延緩衰老、且抗病、害蟲、逆境（旱、寒、酸、堿、鹽等）、除草劑等抗性基因作物并改良品種，加速繁殖等，另外改善植物營養(yǎng)成分（如氨基酸、糖、脂類、維生素、微量元素等），植

44、物生物反應(yīng)器等應(yīng)用也付與實踐。動物方面加速動物繁殖及物種優(yōu)化，如近交動物、無特定病原動物、基因敲除動物等。另外，打破種間隔離，如加速魚類、騾等優(yōu)良畜種的培育。利用基因的克隆技術(shù)，可滿足人們對畜產(chǎn)品的皮、毛、肉等和實驗研究動物的需求，即利于開展對生長、發(fā)育、衰老和健康的機(jī)理及疾病預(yù)防、治療等方面的研究。1.2 轉(zhuǎn)基因動植物的培育：指在基因組中穩(wěn)定地整合了人工導(dǎo)入的外源基因的動、植物。外源（目的）基因包括各種動物的生長激素基因、人生長素基因、人胰島素基因、抗凍蛋白基因、珠蛋白基因、白血病病毒等多種基因。利用轉(zhuǎn)基因動、植物，我們可以加快家畜及作物品種的改良速度，提高肉奶蛋等食物品質(zhì)，生產(chǎn)珍貴藥用蛋白

45、等。目前，利用動物生物反應(yīng)器生產(chǎn)的藥用蛋白已逐漸增多，其中有在血液中表達(dá)人血紅蛋白的轉(zhuǎn)基因豬；在乳汁中表達(dá)抗胰蛋白酶的轉(zhuǎn)基因綿羊和表達(dá)人抗凝血酶、人組織纖溶酶原激溶劑的轉(zhuǎn)基因山羊和表達(dá)人乳鉄蛋白的轉(zhuǎn)基因牛等等。 另外，現(xiàn)已培育出能生產(chǎn)攜帶胰島素、干擾素、人血蛋白等基因的轉(zhuǎn)基因植物，轉(zhuǎn)基因植物在前文已述。1.3 醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用：主要是同種或異種器官移植、進(jìn)行生物制品和蛋白、中藥、化學(xué)藥物的生產(chǎn)以及生物遺傳疾病的預(yù)防、治療和研究等。同種發(fā)面：利用克隆技術(shù)培植人體皮膚進(jìn)行植皮手術(shù)，尤其適用于皮膚大面積受損的患者； 異種方面：先介紹基因敲除，轉(zhuǎn)基因過程中，外源基因插入到染色體中可能導(dǎo)致某內(nèi)源基因失活，形

46、成某一基因功能缺失的轉(zhuǎn)基因動物的研究基因結(jié)構(gòu)與功能的方法。將已引起人排異反應(yīng)的豬細(xì)胞膜上的一種糖（1，3半乳糖）用基因敲除方法培育基因敲除克隆豬，或?qū)⑷说幕驅(qū)肫涫荏w用于器官移植。 微生物基因克隆主要培養(yǎng)優(yōu)良菌株，用于發(fā)酵工程生產(chǎn)抗生素、干擾素、胰島素、激素類、生長因子、粒細(xì)胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子、各種疫苗、單克隆抗體（生物導(dǎo)彈）等生物制品的開發(fā)與生產(chǎn)。總之，基因克隆技術(shù)潛力巨大，將為醫(yī)學(xué)上展示無比的貢獻(xiàn)。14基因克隆和DNA分析在法醫(yī)學(xué)和考古學(xué)中的應(yīng)用 1.4.1 利用DNA分析鑒定犯罪嫌疑人 1.4.2 利用DNA指紋圖譜分析血緣關(guān)系 1.4.3 通過DNA分析進(jìn)行性別鑒定 1.4.4 古遺傳學(xué)利用DNA研究人類進(jìn)化 1. 5 特殊動物基因資源的保護(hù)。1.5.1 珍稀動物保護(hù)如瀕危物種大象、犀牛、野生虎、大猩猩、熊、美國野黃牛、大熊貓及鳥類，若能留下已滅絕的動物的組織或細(xì)胞，就能通過克隆的技術(shù)來挽救或再生。但瀕危物種的保護(hù)更重要的是靠人類環(huán)境意識的提高，