大鼠纖溶酶原激活物抑制因子(PAI)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)

1、大鼠纖溶酶原激活物抑制劑（pai）酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說(shuō)明書(shū) 廈門(mén)慧嘉生物科技有限公司本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測(cè)定大鼠血清，血漿及相關(guān)液體樣本中纖溶酶原激活物抑制劑（pai）的含量。實(shí)驗(yàn)原理： 本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中大鼠纖溶酶原激活物抑制劑（pai）水平。用純化的大鼠纖溶酶原激活物抑制劑（pai）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入纖溶酶原激活物抑制劑（pai），再與hrp標(biāo)記的纖溶酶原激活物抑制劑（pai）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物tmb顯色。tmb在hrp酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色

2、。顏色的深淺和樣品中的pai呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（od值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品中大鼠纖溶酶原激活物抑制劑（pai）濃度。試劑盒組成：試劑盒組成48孔配置96孔配置保存說(shuō)明書(shū)1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1個(gè)1個(gè)酶標(biāo)包被板1481962-8保存標(biāo)準(zhǔn)品：900ng/l0.5ml1瓶0.5ml1瓶2-8保存標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5ml1瓶1.5ml1瓶2-8保存酶標(biāo)試劑3 ml1瓶6 ml1瓶2-8保存樣品稀釋液3 ml1瓶6 ml1瓶2-8保存顯色劑a液3 ml1瓶6 ml1瓶2-8保存顯色劑b液3 ml1瓶6 ml1瓶2-8保存終止液3ml1瓶6ml1瓶2-8

3、保存濃縮洗滌液（20ml20倍）1瓶（20ml30倍）1瓶2-8保存樣本處理及要求：1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇edta或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收

4、集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用pbs（ph7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱(chēng)取重量。加入一定量的pbs，ph7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8的溫度。加入一定量的pbs（ph7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。6. 標(biāo)本采集后盡

5、早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.7. 不能檢測(cè)含nan3的樣品，因nan3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（hrp）活性。操作步驟：1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100l，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50l，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100l分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50l，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50l棄掉，再各取50l分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六

6、孔中各取50l分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50l，混勻后從第七、第八孔中分別取50l加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50l，混勻后從第九第十孔中各取50l棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50l，濃度分別為600 ng/l，400 ng/l ，200 ng/l，100ng/l，50 ng/l）。2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40l，然后再加待測(cè)樣品10l（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。3. 溫育：用封

7、板膜封板后置37溫育30分鐘。4. 配液：將30（48t的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48t的20倍）倍稀釋后備用。5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50l，空白孔除外。7. 溫育：操作同3。8. 洗滌：操作同5。9. 顯色：每孔先加入顯色劑a50l，再加入顯色劑b50l，輕輕震蕩混勻，37避光顯色15分鐘. 10. 終止：每孔加終止液50l，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。11. 測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（od值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行。注意事項(xiàng)：1

8、試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開(kāi)封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。2 濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。3 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。4 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高（樣本od值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的od值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后乘以總稀釋倍數(shù)（n5）。5 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6 底物請(qǐng)避光保存。7 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).8 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。9 本試劑不同批號(hào)組分不得混用。10. 如與英文說(shuō)明書(shū)有異，以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，od值為縱坐標(biāo)， 在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)樣品的od 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋 倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與od值計(jì)算出標(biāo) 準(zhǔn)曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方程式，將樣品的od值 代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋