高溫聯(lián)合輻射影響胚胎神經(jīng)發(fā)育探討論文

1、高溫聯(lián)合輻射影響胚胎神經(jīng)發(fā)育探討論文 【關(guān)鍵詞】高溫；輻射；孕鼠胚胎；神經(jīng)發(fā)育；腦熱應(yīng)激蛋白質(zhì)【摘要】目的探討高溫聯(lián)合輻射致胚胎神經(jīng)發(fā)育與早期胚胎腦蛋白質(zhì)和HSPs表達(dá)的關(guān)系。方法將130只孕鼠按隨機(jī)抽簽分為13組，每組10只。在鼠妊娠第8d，第9d分別接受60Co及-射線全身照射各1次,照射劑量1.0Gy；第10d各置溫箱中,分別使其肛溫保持在370.5，410.5，420.5,并持續(xù)3，4，5min。移出溫箱2h后，每組每時段隨機(jī)取5只脫頸法處死，采用Westerndotblot和lowry方法定量分析胚胎腦HSP70和蛋白質(zhì)含量與胚胎神經(jīng)系統(tǒng)畸形。結(jié)果高溫聯(lián)合輻射對胚胎神經(jīng)毒性明顯增加，

2、并與高溫強(qiáng)度及作用時間呈正相關(guān)；高溫聯(lián)合輻射作用于胚胎早期對胚胎腦蛋白質(zhì)降低有復(fù)合作用（P0.01），并可誘導(dǎo)腦HSP70合成。結(jié)論高溫與輻射聯(lián)合致神經(jīng)發(fā)育與胚胎腦蛋白質(zhì)合成及熱應(yīng)激蛋白的誘導(dǎo)有一定的相關(guān)性?！娟P(guān)鍵詞】高溫；輻射；孕鼠胚胎；神經(jīng)發(fā)育；腦熱應(yīng)激蛋白質(zhì)Effectsofhyperthermiacombinedwithradiationonembryonicnervousdevelopmentandheatshockproteinofbrain【Abstract】ObjectiveToexploretherelationbetweentheembryonicnervousdevelo

3、pmentinducedbyhyperthermiacombinedwithradiationandearlyembryonicbrainproteinsorHSPsexpression.Methods130pregnantmicewererandomlydividedinto13groups(eachn=13).Onthe8thand9thdayofpregnance,themicereceivedonetimeofgeneralirradiationof60Coandrayrespectively,thedosageofirradiationwas1.0Gy;onthe10thday,th

4、emicewereputinhotboxeskeepingtheirrectaltemperatureat370.5,410.5and420.5persistingfor3,4and5mins,respectively.Aftertwohoursofthemiceleaveingwarmingboxes,5micerandomlyselectedfromeachgrouppertimesectionwereexecutedbycervicalvertebraluxation.TheHSP70ofembryonicbrain,proteincontentanddeformationsofembr

5、yonicnervoussystemswerequantitativelyanalyzedwiththeWesterndotblotandLowrymethod.ResultsThetoxicityofhyperthermiacombinedwithirradiationtoembryosmarkedlyincreasedandwaspositivelyrelatedtohyperthermiaintensityandduration;hyperthermiawithirradiationhadcompoundactiononreducementofembryonicbrainproteins

6、inearlyembryo(P0.01)andinducedthesynthesisofbrainHSP70.ConclusionTherewascertainrelativityofnervousdevelopmentinducedbyhyperthermiacombinedwithirradiationandsynthesisofembryonicbrainproteinsorinductionofHSP70.【Keywords】Hyperthermia;radiation;embryoofpregnantmice;nervousdevelopment;theHSPs胚胎、組織器官和細(xì)胞對

7、各種異常生理環(huán)境做出應(yīng)答反應(yīng)的主要產(chǎn)物之一是熱休克蛋白基因編碼的熱應(yīng)激蛋白(heatshockprotein,HSPs)合成增多,HSPs和腦蛋白質(zhì)含量變化能準(zhǔn)確反映腦分化和腦損傷程度，文獻(xiàn)報(bào)道多為單一的高熱或電離輻射可能對胚胎和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生效應(yīng)。本研究試圖探討高溫與輻射聯(lián)合對胚胎神經(jīng)系統(tǒng)畸形的影響，為人類的優(yōu)生優(yōu)育提供科學(xué)依據(jù)。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)對象選取由河南省實(shí)驗(yàn)動物中心繁育提供的健康未生育的SD雌性大鼠(體重190210g)和雄性大鼠(225275g)為實(shí)驗(yàn)對象。1.2妊娠確定動情期雌雄鼠按2:1合籠過夜，次日晨檢查雌鼠，以發(fā)現(xiàn)陰栓為妊娠依據(jù)，并定為懷孕第0d。確定入組孕鼠130

8、只。1.3分組與處理將130只孕鼠按隨機(jī)抽簽分成13組，每組10只。于妊娠第8，9d分別接受60Co及-射線全身照射各1次，劑量1.0Gy；第10d每組各置溫箱中,分別使其肛溫保持370.5，410.5，420.5,并持續(xù)3，4，5min。孕鼠移出溫箱2h后，每組隨機(jī)取5只，脫頸法處死，取出胎鼠，取全腦組織制備勻漿1，測量HSP70和蛋白質(zhì)；18d后每組隨機(jī)取5只，脫頸法處死，消毒后剖腹，解剖鏡下依次剝離蛻膜、Reicherts膜、卵黃膜和羊膜，然后將分離的胚胎置于光鏡下觀察胚胎神經(jīng)系統(tǒng)畸形狀況。1.4腦蛋白質(zhì)與HSP70檢測1.4.1腦蛋白質(zhì)檢測取勻漿上清液5L按Lowry氏法2測定總蛋白含

9、量。1.4.2HSP70檢測以Westerndotbot方法3，用已知HSP70300mgL-1配成100mgL-1、50mgL-1、25mgL-1、12.5mgL-1、6.25mgL-1參照系列，與樣品同步點(diǎn)樣于同一個定量型硝酸纖維素濾膜（浙江省黃巖市四清生化材料廠產(chǎn)）上，制成免疫印漬膜。用兔抗人HSP70單克隆抗體及辣根過氧化物酶二氨基聯(lián)苯胺法顯色，終止反應(yīng)后迅速照相和掃描（CS930掃描儀，460nm波長），根據(jù)參照系列HSP70濃度的光密度計(jì)算每毫克腦組織蛋白HSP70含量(t)。1.5統(tǒng)計(jì)方法所有數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理,以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示,組間各時斷

10、數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1高溫聯(lián)合輻射對孕鼠胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響，見表1。表1高溫、輻射對孕鼠胚胎神經(jīng)系統(tǒng)的影響（略）注：*與37溫度組比較P0.01；*與單獨(dú)高溫組比較P0.01表2高溫與輻射對鼠妊娠胚胎腦蛋白質(zhì)及HSP70的影響（略）注：*與單獨(dú)高溫組比較P0.01表1顯示，在鼠妊娠第8，9d，高溫聯(lián)合輻射對胚胎神經(jīng)系統(tǒng)毒性明顯增加，并與高溫強(qiáng)度及作用時間呈正相關(guān)，神經(jīng)管未閉、體位異常、腦形態(tài)異常因子差異有極顯著性（P0.01）。2.2高溫與輻射對鼠妊娠胚胎腦蛋白質(zhì)及HSP70含量的影響，見表2。表2顯示，鼠妊娠在高溫及高溫聯(lián)合輻射可導(dǎo)致胎腦蛋白質(zhì)含量下降,誘導(dǎo)HSP70大量合成；42

11、組與37組比較誘導(dǎo)HSP70合成差異有極顯著性（P0.01)；高溫聯(lián)合輻射組胎腦蛋白質(zhì)含量下降有明顯變化,并與溫度呈正相關(guān),差異有極顯著性（P0.01)。3討論高溫在自然環(huán)境與勞動環(huán)境中頻繁出現(xiàn)，某些疾病也常伴有發(fā)熱，而隨著放射性元素在醫(yī)學(xué)和工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用以及核能事業(yè)的發(fā)展，懷孕早期的婦女在工作、生活以及疾病等情況下經(jīng)常會暴露于高溫、輻射，或兩者復(fù)合作用之下，處于分化中的神經(jīng)器官對致畸因子最敏感。流行病學(xué)調(diào)查推測，高溫可能是引起人類神經(jīng)系統(tǒng)畸形的重要環(huán)境因素。發(fā)育中的大腦對輻射具有特殊的敏感性，正常的大腦發(fā)育中大量地存在程序化細(xì)胞死亡，其可被電離輻射加速或改變4。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道5，6熱處理孕8.

12、510.5d的大鼠畸胎發(fā)生率明顯高于熱處理8.5d或10.5d的大鼠的畸胎發(fā)生率。本研究顯示，在鼠妊娠第8，9d，高溫聯(lián)合輻射對胚胎神經(jīng)毒性明顯增加，并與高溫強(qiáng)度及作用時間呈正相關(guān)，神經(jīng)管未閉、體位異常、腦形態(tài)異常因子差異有極顯著性（P0.01）。提示胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育對高溫與輻射聯(lián)合的敏感性提高。大腦是體內(nèi)最復(fù)雜，對環(huán)境最敏感的器官，其神經(jīng)元不能再生，腦蛋白質(zhì)含量的變化能及時反映細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞分化和功能情況，同時HSP70的合成與早期胚胎大腦的生長發(fā)育和異常的發(fā)生存在著內(nèi)在聯(lián)系7，測量胎腦蛋白質(zhì)及HSP70的變化是了解環(huán)境因素對早期胚胎大腦損傷程度的有效手段。本研究表明，鼠妊娠在高溫及高溫聯(lián)合

13、輻射可導(dǎo)致胎腦蛋白質(zhì)含量下降,誘導(dǎo)HSP70大量合成；42高溫組與37組比較HSP70的合成有明顯差異，說明高溫對大腦有一定刺激，誘導(dǎo)合成HSP70對腦12細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)；42高溫(3min)聯(lián)合輻射與37組比較，二項(xiàng)指標(biāo)均有顯著差異，與單獨(dú)42比較蛋白質(zhì)含量明顯下降，誘導(dǎo)HSP70合成并無明顯增加，提示輻射聯(lián)合高溫42(3min)對胎腦蛋白質(zhì)降低有復(fù)合作用，胎腦HSP70的合成水平?jīng)]有明顯變化。輻射可以誘導(dǎo)胎腦HSP70表達(dá)，但其誘導(dǎo)作用不如高溫明顯，高溫聯(lián)合輻射并不能增加單獨(dú)高溫或單獨(dú)輻射作用下誘導(dǎo)HSP70合成水平。表明應(yīng)激達(dá)到一定強(qiáng)度后，增加刺激并不能提高胎腦HSP70的合成水平，與文獻(xiàn)

14、報(bào)道5，6結(jié)果相一致。提示上述因素影響胎腦蛋白質(zhì)合成而引起腦細(xì)胞損傷嚴(yán)重，一方面誘導(dǎo)HSP70合成，同時又因結(jié)構(gòu)破壞使合成受抑制，HSP70對細(xì)胞保護(hù)程度不夠而導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育不良，機(jī)體表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常。胎腦蛋白質(zhì)含量的下降和誘導(dǎo)HSP70的合成的變化規(guī)律與高溫變化，持續(xù)時間，輻射及二因素聯(lián)合所致神經(jīng)發(fā)育結(jié)果基本一致，在胚胎發(fā)育過程外界環(huán)境因素引起的胎腦抗損傷與損傷受相關(guān)基因協(xié)調(diào)，如果協(xié)調(diào)出軌，HSP70對胚胎細(xì)胞保護(hù)強(qiáng)度不夠，導(dǎo)致胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞發(fā)育異常，機(jī)體表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常。參考文獻(xiàn)1蘆春林，KimmeCAKmelGL,等.高溫致胚胎發(fā)育毒性機(jī)理的研究J.北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)

15、報(bào)，1993，25(6)：4352SunXQ,LIJS,WuXY.Theexpressofheatshockprotein70inratbrainafterGZexposureJ.JGravitphysio，2002，9(1)：233FisherBR,BrownNT,Heredia,DJ.etal.OccipotalencepaloceleandearlygestationalhyperthemiaJ.Teratology，1995，52：904高衛(wèi)民，周湘艷.出生前氚水照射對仔代大鼠生長發(fā)育及神經(jīng)行為的影響J.中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志，1998，18（6）：3815NoveyL，ScharrfKD.HeatstressproteinsandtranscriptionfactorscellJ.Mol.Lifesci，1997，53：806ChenH,LiuZ,ZhouZ,JiangM,QianL,WuS.Theregulatoryeffectofmemantineonexpressionandsynthesisofheat