畢業(yè)設(shè)計（論文）嶧城主栽石榴品種ISSR分子標(biāo)記引物篩選

1、 學(xué) 士 學(xué) 位 論 文嶧城主栽石榴品種issr分子標(biāo)記引物篩選姓 名：學(xué) 號：1 指導(dǎo)教師：系 別：專 業(yè)： 完成日期：學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文作者聲明本人聲明：本人呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下取得的研究成果。對前人及其他人員對本文的啟發(fā)和貢獻已在論文中作出了明確的聲明,并表示了謝意。論文中除了特別加以標(biāo)注和致謝的地方外,不包含其他人和其它機構(gòu)已經(jīng)發(fā)表或者撰寫過的研究成果。本人同意學(xué)校根據(jù)中華人民共和國學(xué)位條例暫行實施辦法等有關(guān)規(guī)定保留本人學(xué)位論文并向國家有關(guān)部門或資料庫送交論文或者電子版,允許論文被查閱和借閱；本人授權(quán)棗莊學(xué)院可以將本人學(xué)位論文的全部或者部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索,可以采用

2、影印、縮印或者其它復(fù)制手段和匯編學(xué)位論文（保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定）。 作者簽名： 日期： 年 月 日摘 要本研究以嶧城萬畝石榴園的石榴幼葉為材料,采用ctab法提取石榴基因組dna。利用電泳和紫外分光光度法分析其完整性、純度及濃度. 利用issr標(biāo)記技術(shù)對42個石榴品種遺傳關(guān)系進行了分析。篩選出多態(tài)性高的ubc811 issr引物，共擴增出29條dna條帶，其中多態(tài)性帶7條，多態(tài)性百分率為21.12%，特異條帶1條。【關(guān)鍵詞】石榴；issr；種質(zhì)資源；遺傳多樣性；親緣關(guān)系abstract 目錄第1章 引 言11.1isssr 分子標(biāo)記11.2本研究的目的與意義4第2章 材料與儀器62.1

3、 材料62.2 試劑72.3 儀器設(shè)備8第3章 實驗方法93.1 ctab法提取dna93.2 dna濃度和純度測定方法103.2.1 dna質(zhì)量檢驗方法103.2.2 dna的濃度和純度測定方法103.3 pcr擴增反應(yīng)103.4 電泳與成像113.5 數(shù)據(jù)獲取與分析11第4章 結(jié)果與分析124.1 石榴基因組dna的提取結(jié)果分析124.1.1 dna完整性分析及兩種提取方法的比較124.1.2 dna純度和濃度測定結(jié)果134.2 issr擴增結(jié)果第5章 結(jié)論與討論185.1 討論185.2結(jié)論18參考文獻19致 謝22第1章 引 言石榴（punica granatum l）為石榴科石榴屬落

4、葉灌木或小喬木，又名若榴、丹若、天漿、金罌、狂花等。石榴原產(chǎn)伊朗、阿富汗等中亞一帶，從西漢張騫出使西域?qū)⑼苛职彩褚胛覈两褚延谐^2 000 年的栽培歷史1，經(jīng)長期天然雜交及基因突變，以及采用實生、分株、嫁接等多種繁殖方法，使其產(chǎn)生了復(fù)雜多樣的品種和類型，據(jù)不完全統(tǒng)計，我國現(xiàn)有石榴品種資源約200多個，分布南北各地20多個省區(qū)。各地研究者對石榴種質(zhì)資源進行調(diào)查研究時，大多都局限于某一地區(qū)，各自從不同的角度對石榴進行了種下分類，導(dǎo)致品種混雜、同種異名、同名異種的現(xiàn)象出現(xiàn)2，長期以來，給準確進行品種資源鑒定和利用帶來了困難。我們究旨在利用issr標(biāo)記技術(shù)，對石榴的遺傳多樣性與親緣關(guān)系進行分析

5、，以期為石榴種下分類提供分子依據(jù)，為更有效地保護石榴資源及選育新品種提供遺傳信息。1.1 issr分子標(biāo)記 issr(intersimple sequences repeats)即簡單序列重復(fù)區(qū)間標(biāo)記法，是由zietkiewicz等19947年提出的一種dna標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)檢測的是2個相近ssr之間的一段短dna序列上的多態(tài)性在ssr的3端或5端加錨14個嘌呤或嘧啶堿基，并以此作為引物，通常為1618個堿基序列，對兩側(cè)具有反向排列的ssr之間的一段dna序列進行擴增，然后進行電泳、染色，根據(jù)譜帶的有無及相對位置，來分析不同樣品間issr標(biāo)記的多態(tài)性由于issr引物堿基數(shù)量多，退火溫度高，可重

6、復(fù)性好，非特異性擴增少，真核生物富含ssr序列且變異最快，故issr擴增出的條帶多且多態(tài)性要比rapd，ssr，rflp等更加豐富issr為顯性標(biāo)記，符合孟德爾遺傳規(guī)律，并且無需克隆、制備探針、分子雜交等工作，具有簡便迅速、高效、實驗成本低等優(yōu)點因此，issr技術(shù)現(xiàn)已在遺傳多樣性8、親緣關(guān)系分析9、遺傳作圖10、品種鑒定11、進化12等研究方面被廣泛應(yīng)用issr被認為是研究種群遺傳多樣性的一種非常有效的分子標(biāo)記手段13171.2本研究的目的與意義棗莊是我國的主要石榴產(chǎn)區(qū)之一,栽培面積達1.6萬公頃，具有48多個種，被譽為“冠世榴園”。近年廣泛開展了種質(zhì)資源的調(diào)查、收集、保存和良種選育工作,并在

7、此基礎(chǔ)上，對嶧城石榴的種、變種、品種的劃分、評價、利用等問題進行了分析研究6。但由于長期的引種和選擇,已很難從植物的外部形態(tài)上來確定品種的來源和品種間的親緣關(guān)系，存在著同名異種或同種異名的問題8，這給準確進行品種資源鑒定和利用帶來了困難。近年來，issr技術(shù)在石榴品種鑒定中得到了廣泛的應(yīng)用，但該技術(shù)對反應(yīng)條件要求十分嚴格,不同材料需要的引物不同，反應(yīng)條件也需各自優(yōu)化，才能提高重現(xiàn)性和穩(wěn)定4,5。引物是否有效及多態(tài)性效果會影響石榴品種的分類。本研究以石榴葉片為材料，分別采用ctab法提取石榴基因組dna。利用電泳和紫外分光光度法分析其純度，選取純度較高的dna進行試驗。第2章 材料與儀器2.1

8、材料以嫩葉期石榴葉作為實驗材料,采集于棗莊嶧城萬畝石榴園,冷凍保存于-70冰箱。研究材料的名稱、產(chǎn)地及分布見表1。表1 實驗材料一覽表編號 名稱 產(chǎn)地1 山東棗莊2 山東棗莊3 山東棗莊4 山東棗莊5 山東棗莊6 山東棗莊7 山東棗莊8 山東棗莊9 山東棗莊10 山東棗莊11 山東棗莊12 山東棗莊13 山東棗莊14 山東棗莊15 山東棗莊16 山東棗莊17 山東棗莊18 山東棗莊19 山東棗莊 20 山東棗莊21 山東棗莊22 山東棗莊23 山東棗莊24 山東棗莊25 山東棗莊26 山東棗莊27 山東棗莊28 山東棗莊29 山東棗莊30 山東棗莊31 山東棗莊32 山東棗莊33 山東棗莊34

9、 山東棗莊35 山東棗莊36 山東棗莊37 山東棗莊38 山東棗莊39 山東棗莊40 山東棗莊41 山東棗莊42 山東棗莊2.2 試劑液氮 巰基乙醇 抗壞血酸（vc） pvp ctab sds 氯仿 異戊醇 edta tris酚 異丙醇 70%乙醇 無水乙醇 eb染液 溴酚藍 瓊脂糖 tbe緩沖液 nacl 10堿基隨機引物由寶生物工程有限公司合成,見表2。10taq buffer（-mg2+）,mgcl2, taq聚合酶,dntps,100bpdna ladder marker,10loading buffer均購于寶生物工程有限公司。pcr超純水,購于生工生物工程（上海）有限公司。表2 所

10、用引物的名稱與序列2.3 儀器設(shè)備ar1140型電子分析天平 奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司hh-w42數(shù)顯三用恒溫水箱 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司kdm型控溫電熱套 山東甑城華魯儀器公司5415型離心機 made in germanygene amp pcr基因擴增儀 寧波新芝生物科技股份有限公司dycp=30dn型的電泳槽 北京市六一儀器廠dyy-2c型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京市六一儀器廠gl-200臺式暗箱微型透光儀 江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠第3章 實驗方法3.1 石榴葉片基因組dna的提取3.1.1 ctab法提取dna（1）稱取0.2g新鮮的幼嫩葉片，于研缽中，加入液氮，快速研磨到

11、粉狀(越細越好) ，把粉末轉(zhuǎn)移到有標(biāo)記的4 ml離心管中。此步操作應(yīng)戴手套，防止皮膚凍傷。（2）加入4.5ml 65 預(yù)熱的ctab 提取液（含有3 %(w/v)ctab、100mmol/l tris-hcl(ph8.0)、50 mmol/ledta(p h8. 0)、2.0 mol/lnacl、5%巰基乙醇），用力振蕩12 min，馬上放入65 水浴鍋中保溫45 min以上，其間用手輕微振蕩3或4次。（3）從水浴鍋中取出樣品管加入等體積的氯仿異戊醇(24 1) ，蓋好管蓋后緩慢上下顛倒搖動510 min，12 000 r/ min 離心15 min。（4）用移液槍緩慢吸取上層清液到做好標(biāo)記的

12、1. 5 ml離心管中。此步操作應(yīng)非常小心，注意不要吸得過多、過快，避免振蕩，以免造成蛋白質(zhì)污染；如果離心層因振蕩引起上清液渾濁，將影響提取效果，此時須要再離心。加入等體積等體積的氯仿異戊醇(24 1) ，重復(fù)上一步。（5）在獲得的上清液中加入預(yù)冷的異丙醇，加入量按吸取上清液體積的2 /3計。輕輕上下?lián)u動離心管，注意觀察dna將從溶液中析出。如溶液中dna含量較少，將會觀察到管中含有白色懸浮的dna顆粒；如樣品中dna含量較高，則可觀察到白色絮絲狀的dna懸浮于溶液中。12000 r/ min離心5min，棄上清液，取沉淀，用75%的乙醇清洗沉淀3次； （6）自然干燥后，加50l雙蒸水溶解dn

13、a16，17。保存在- 20 冰箱中備用。3.2 dna濃度和純度測定方法3.2.1 dna質(zhì)量檢驗方法將dna在含0. 5 g/m l 溴化乙錠的0.8%瓊脂糖凝膠中電泳。電泳譜帶若有拖尾，則dna降解；若電泳譜帶清晰整齊，則提取較成功18。3.2.2 dna的濃度和純度測定方法采用紫外分光光度計法檢測dna的含量，檢測260、280 nm處的od值，計算得出dna的含量。測定od260 /od280 值分析dna的純度。如od260 /od280 = 1. 8 左右， dna含量較高；od260 /od280 1. 8，則有rna污染19。3.3 pcr擴增反應(yīng)反應(yīng)體系總體積25l，其中，

14、引物ubc811(10mol/ l)1.25l ，premixce 12. 5 l，模板dna (約25 ng/ l) 1l，剩余體積用ddh2o來補齊。擴增程序為95預(yù)變性4min，94變性45s，51.2退火1min20，72延伸2min，進行30 個循環(huán)， 72延伸10 min，最后4保存。3.4 電泳與成像擴增產(chǎn)物在1.2% 瓊脂糖凝膠中電泳，以溴酚藍為指示劑。上樣10 l (含2 l 點樣緩沖液)，上樣marker(0.4 g/l )，每孔上樣10l。穩(wěn)壓60v， 當(dāng)溴酚藍電泳至凝膠尾端約1cm 時停止電泳，電泳時間約需3 h。電泳后在gl-200臺式暗箱微型透光儀上觀察、照相。3.

15、5 數(shù)據(jù)獲取與分析利用20 條10 堿基隨機引物對遺傳背景差異大的5個品種的dna進行pcr 擴增，從中篩選出品種間擴增性強、重復(fù)性好、多態(tài)性好的引物，用于石榴種質(zhì)資源遺傳多樣性研究。第4章 結(jié)果與分析4.1 石榴基因組dna的提取結(jié)果分析4.2 issr擴增結(jié)果第5章 結(jié)論與討論5.1 討論隨著生物技術(shù)迅速發(fā)展，探索石榴的基因資源和遺傳基礎(chǔ)，需要經(jīng)常提取dna。目前，提取植物dna的方法很多1。目前用于提取石榴葉中dna的方法主要有sds、ctab法，但不同研究者對這兩種方法各有偏愛，一部分學(xué)者認為sds法較好，另一些學(xué)者則認為ctab法更適用于石榴葉中dna的提取。本試驗結(jié)果表明，改良sd

16、s法提取的dna在完整性、純度及濃度方面均好于采用ctab法提取的dna，但由于試驗時間較短，加上試驗條件和技術(shù)有限，得出的結(jié)論仍需進一步的探究。rapd技術(shù)在遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育研究中被廣泛采用。但該技術(shù)對反應(yīng)條件要求嚴格，不同材料需要的引物不同，反應(yīng)條件也需各自優(yōu)化，才能提高重現(xiàn)性和穩(wěn)定4，5。引物是否有效及多態(tài)性效果會影響石榴品種的分類。關(guān)于適用于石榴rapd反應(yīng)體系的多態(tài)性引物，多數(shù)研究沒有篩選到統(tǒng)用的引物。本文在其他學(xué)者篩選的基礎(chǔ)上，選取了20對10堿基引物以5種遺傳背景差異較大的品種進行篩選，通過觀察比較rapd-pcr后的電泳結(jié)果，顯示多態(tài)性引物y34、s2144多態(tài)性較好。篩選

17、出的2條引物對其他石榴品種是否具有好的多態(tài)性，還需要進一步驗證。此外，本研究所用引物數(shù)量較少，篩選出的多態(tài)性引物較少，如果系統(tǒng)對石榴種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析還需要對更多引物進行篩選。5.2結(jié)論本研究以石榴葉片為材料，采用改良的sds和ctab法提取石榴基因組dna。實驗結(jié)果及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析表明用改良的sds法提取的dna完整性和純度較好、濃度較高。以5種遺傳背景差異大的石榴基因組dna為模板，對用于石榴rapd擴增的多態(tài)性引物進行篩選。結(jié)果表明，通過比較20條引物擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，引物y34、s2144譜帶較清晰、多態(tài)性較好，為利用rapd技術(shù)分析石榴種質(zhì)遺傳關(guān)系提供參考資料。參考文獻1 楊

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