細(xì)胞核的分離與鑒定

1、實(shí)驗(yàn)一：動物細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)一：動物細(xì)胞融合細(xì)胞融合是正常的生命活動細(xì)胞融合是正常的生命活動 受精作用受精作用兩個細(xì)胞正在融合兩個細(xì)胞正在融合動物細(xì)胞融合基本過程：動物細(xì)胞融合基本過程：誘導(dǎo)方法：誘導(dǎo)方法：誘導(dǎo)方式誘導(dǎo)方式物理法：物理法：化學(xué)法：化學(xué)法：生物法：生物法： 滅活的病毒滅活的病毒電刺激電刺激聚乙二醇聚乙二醇PEGPEG 聚乙二醇聚乙二醇PEG具有強(qiáng)烈的吸水性以及凝聚具有強(qiáng)烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白質(zhì)的作用，能夠有效地促進(jìn)植物原和沉淀蛋白質(zhì)的作用，能夠有效地促進(jìn)植物原生質(zhì)體和動物細(xì)胞的融合。在不同種類的動物生質(zhì)體和動物細(xì)胞的融合。在不同種類的動物細(xì)胞混合液中加入聚乙二醇，就會發(fā)生細(xì)胞細(xì)

2、胞混合液中加入聚乙二醇，就會發(fā)生細(xì)胞凝凝集作用集作用；在稀釋和除去聚乙二醇的過程中，就；在稀釋和除去聚乙二醇的過程中，就會發(fā)生細(xì)胞融合。聚乙二醇誘導(dǎo)細(xì)胞融合的機(jī)會發(fā)生細(xì)胞融合。聚乙二醇誘導(dǎo)細(xì)胞融合的機(jī)理，目前還不太清楚。聚乙二醇是化學(xué)試劑，理，目前還不太清楚。聚乙二醇是化學(xué)試劑，使用起來很方便，誘導(dǎo)細(xì)胞融合的頻率比較高，使用起來很方便，誘導(dǎo)細(xì)胞融合的頻率比較高，但是它但是它有一定毒性有一定毒性，對有些細(xì)胞，對有些細(xì)胞(如卵細(xì)胞如卵細(xì)胞)不不適用。適用。聚乙二醇聚乙二醇PEGPEG誘導(dǎo)融合誘導(dǎo)融合一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?1、了解動物細(xì)胞的融合了解動物細(xì)胞的融合 2 2、熟悉、熟悉PEGPEG誘導(dǎo)細(xì)

3、胞融合的方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法 3 3、掌握動物細(xì)胞融合的基本原理及方法、掌握動物細(xì)胞融合的基本原理及方法二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞融合（細(xì)胞融合（cell fusion）：）：由兩個或多個細(xì)胞相互由兩個或多個細(xì)胞相互接觸后，其細(xì)胞膜發(fā)生分子重排，導(dǎo)致細(xì)胞合并、接觸后，其細(xì)胞膜發(fā)生分子重排，導(dǎo)致細(xì)胞合并、染色體等遺傳物質(zhì)重組的過程稱為染色體等遺傳物質(zhì)重組的過程稱為細(xì)胞融合。細(xì)胞融合。分分為為細(xì)胞自發(fā)融合細(xì)胞自發(fā)融合和和誘導(dǎo)細(xì)胞融合。誘導(dǎo)細(xì)胞融合。誘導(dǎo)細(xì)胞融合（誘導(dǎo)細(xì)胞融合（ induced cell fusion） ：指在人指在人為誘導(dǎo)條件下所發(fā)生的細(xì)胞融合現(xiàn)象。為誘導(dǎo)條件下所發(fā)生的細(xì)胞融合

4、現(xiàn)象。 1、材料：材料：HeLaHeLa細(xì)胞、細(xì)胞、CHOCHO細(xì)胞、雞紅細(xì)胞。細(xì)胞、雞紅細(xì)胞。 2 2、試劑：聚乙二醇（、試劑：聚乙二醇（PEGPEG，MV=4000MV=4000）HanksHanks液、液、0.25%0.25%胰蛋白酶、胰蛋白酶、RPNI1640RPNI1640培養(yǎng)培養(yǎng)液（含液（含10%10%滅活小牛血清和不含血清的兩滅活小牛血清和不含血清的兩種）、種）、PBSPBS、0.2%0.2%次甲基藍(lán)染液。次甲基藍(lán)染液。 3 3、儀器設(shè)備：顯微鏡、水浴箱、普通離心、儀器設(shè)備：顯微鏡、水浴箱、普通離心機(jī)、高心管、載玻片、蓋玻片、酒精燈、機(jī)、高心管、載玻片、蓋玻片、酒精燈、試管。試管

5、。三、實(shí)驗(yàn)試劑及材料三、實(shí)驗(yàn)試劑及材料實(shí)驗(yàn)選材：實(shí)驗(yàn)選材： 本次試驗(yàn)選用雞的外周血做細(xì)胞融合材料本次試驗(yàn)選用雞的外周血做細(xì)胞融合材料, 這是因?yàn)檫@是因?yàn)? 1. 雞血細(xì)胞具有細(xì)胞核，便于對融合細(xì)胞進(jìn)行鑒雞血細(xì)胞具有細(xì)胞核，便于對融合細(xì)胞進(jìn)行鑒別；別；2. 實(shí)驗(yàn)材料便宜、易得，避免了用培養(yǎng)的細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)材料便宜、易得，避免了用培養(yǎng)的細(xì)胞株做細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)材料所耗的實(shí)驗(yàn)成本和精力；做細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)材料所耗的實(shí)驗(yàn)成本和精力；3.細(xì)胞融合與否，可通過觀察細(xì)胞內(nèi)核的數(shù)目來細(xì)胞融合與否，可通過觀察細(xì)胞內(nèi)核的數(shù)目來進(jìn)行鑒別。若細(xì)胞內(nèi)只有一個核，定為未融合細(xì)進(jìn)行鑒別。若細(xì)胞內(nèi)只有一個核，定為未融合細(xì)胞；有二至多個核

6、，定為融合細(xì)胞。胞；有二至多個核，定為融合細(xì)胞。四、實(shí)驗(yàn)步驟：四、實(shí)驗(yàn)步驟： 1、取肝素抗凝的棄血清雞血0.1ml(本實(shí)驗(yàn)是進(jìn)行同種細(xì)胞融合）。 2、將懸液移入離心管中，以800r/min離心78min，傾去上清液，加入810ml Hanks液，再次懸浮細(xì)胞，離心洗滌一次，傾去上清液后將離心管倒置與濾紙上，盡量流盡剩余液體（這一步驟很重要，因?yàn)闅埩粢后w會改變PEG的濃度）。 3、用手指輕彈離心管底壁，使沉淀物松散，然后吸取制備好的50%PEG0.4ml，在37水浴中，于90s內(nèi)逐滴加入離心管中，邊加邊振搖離心管，使之與細(xì)胞混勻，然后加入810ml Hanks 液，輕輕吸打混勻，在37水浴中靜置

7、5min 以稀釋PEG。離心棄去上清液后，加入23ml含小牛血清的1640培養(yǎng)液，在37水浴中孵育30min。加入加入8 810ml10mlHanksHanks常規(guī)方法消化常規(guī)方法消化制制細(xì)胞懸液細(xì)胞懸液離心管中離心管中 800r/min800r/min離心離心7 78min8min傾去上清液傾去上清液再次懸浮細(xì)胞再次懸浮細(xì)胞離心洗滌一次離心洗滌一次手指輕彈手指輕彈離心管離心管在在3737水浴中水浴中于于90s90s內(nèi)逐滴入內(nèi)逐滴入離心管離心管加入加入7-8ml Hanks7-8ml Hanks在在3737水浴中靜置水浴中靜置5min稀釋稀釋PEG 齊去上清液齊去上清液在在3737水浴中水浴中

8、卵育卵育3min3min加加2-3ml2-3ml含小牛的含小牛的16401640培養(yǎng)液培養(yǎng)液在在5min 10min 20min5min 10min 20min30min30min去懸液制片去懸液制片用用0.2%0.2%次甲基藍(lán)染色次甲基藍(lán)染色觀察觀察一瓶已長成一瓶已長成HelaHela細(xì)胞細(xì)胞或或CHOCHO細(xì)胞細(xì)胞傾去上清液，傾去上清液，將離心管倒置將離心管倒置于濾紙上于濾紙上吸取吸取50%PEG0.4ml50%PEG0.4ml五、預(yù)期結(jié)果：五、預(yù)期結(jié)果： （一）融合過程觀察：（一）融合過程觀察： 分別于溫育分別于溫育5min、10min、15min、20min、30min取細(xì)胞懸液一滴制

9、成臨時裝取細(xì)胞懸液一滴制成臨時裝片，以片，以0.2%次甲基藍(lán)染液染色，在顯微鏡次甲基藍(lán)染液染色，在顯微鏡下觀察細(xì)胞融合的不同階段，通常可把融下觀察細(xì)胞融合的不同階段，通?？砂讶诤线^程大致分為合過程大致分為5個階段：個階段：五個階段五個階段兩個細(xì)胞的膜相互接觸，粘連。兩個細(xì)胞的膜相互接觸，粘連。相接的兩細(xì)胞膜破口粘合形成細(xì)胞膜通道。相接的兩細(xì)胞膜破口粘合形成細(xì)胞膜通道。兩細(xì)胞之間細(xì)胞質(zhì)相遇，形成細(xì)胞質(zhì)通道。兩細(xì)胞之間細(xì)胞質(zhì)相遇，形成細(xì)胞質(zhì)通道。通道擴(kuò)大，兩細(xì)胞連成一體。通道擴(kuò)大，兩細(xì)胞連成一體。細(xì)胞合并完成，形成一個含有兩個或多個細(xì)胞合并完成，形成一個含有兩個或多個核的圓形細(xì)胞。核的圓形細(xì)胞。

10、（注：上述階段可在不同時期觀察）（注：上述階段可在不同時期觀察）細(xì)胞融合過程圖六、注意事項(xiàng)：六、注意事項(xiàng)： 1 1、制備的、制備的50%PEG50%PEG一定要保存于一定要保存于3737水浴中，水浴中，不然冷卻后結(jié)晶析出。不然冷卻后結(jié)晶析出。 2 2、在理想管中加、在理想管中加PEGPEG之前，一定要將離心之前，一定要將離心管倒置于濾紙上，流盡剩余液體，否則殘管倒置于濾紙上，流盡剩余液體，否則殘留液會改變留液會改變PEGPEG的濃度。的濃度。 3.3.操作規(guī)范，防止試劑污染。操作規(guī)范，防止試劑污染。 4.4.細(xì)胞懸液的涂片制作要輕柔。細(xì)胞懸液的涂片制作要輕柔。 5.5.使用離心機(jī)要注意平衡，轉(zhuǎn)

11、速從低到高。使用離心機(jī)要注意平衡，轉(zhuǎn)速從低到高。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康? 掌握分離細(xì)胞核的原理掌握分離細(xì)胞核的原理2 熟悉細(xì)胞核的鑒定方法熟悉細(xì)胞核的鑒定方法3 了解細(xì)胞核的分離過程了解細(xì)胞核的分離過程4 掌握離心機(jī)的正確使用方法掌握離心機(jī)的正確使用方法實(shí)驗(yàn)二：細(xì)胞核的分離和鑒定實(shí)驗(yàn)二：細(xì)胞核的分離和鑒定二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)是由核膜、染色質(zhì)、核仁和細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)是由核膜、染色質(zhì)、核仁和核基質(zhì)構(gòu)成核基質(zhì)構(gòu)成,細(xì)胞核的比重和大小與細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核的比重和大小與細(xì)胞內(nèi)其他組分不同，在同一離心場內(nèi)其沉降速其他組分不同，在同一離心場內(nèi)其沉降速度也不同，所以常用不同介質(zhì)的離心力離度也不同，所

12、以常用不同介質(zhì)的離心力離心心(差數(shù)離心），將細(xì)胞各細(xì)胞器和組分分差數(shù)離心），將細(xì)胞各細(xì)胞器和組分分級分離出來。再運(yùn)用細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)行鑒定級分離出來。再運(yùn)用細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)行鑒定.三、試驗(yàn)器材及試劑三、試驗(yàn)器材及試劑 器材：器材：光學(xué)顯微鏡、離心機(jī)、離心管、天 平、鑷子、載玻片、蓋玻片、染色盤架、紗布、解剖剪、玻璃漏斗、25ml燒杯、量筒、滴管、玻璃勻漿器 試劑：試劑：1%甲烯蘭染液 生理鹽水 緩沖液：0.25ml蔗糖 3mmolMgCl2 0.5TritonX-100 0.5TritonX-100 10mmol Tris-HCl pH=7.9 緩沖液：1mol蔗糖 3mmolMgCl2 1Trito

13、nX-100 材料：材料：家兔肝細(xì)胞四、實(shí)驗(yàn)步驟：四、實(shí)驗(yàn)步驟：1、 斷脊柱法斷脊柱法處死家兔，迅速開腹取肝，在盛有生理處死家兔，迅速開腹取肝，在盛有生理鹽水的小燒杯中反復(fù)洗滌。鹽水的小燒杯中反復(fù)洗滌。2、稱取濕重約、稱取濕重約1g的肝組織，量取的肝組織，量取8ml預(yù)冷的勻漿緩沖預(yù)冷的勻漿緩沖液（液（0.25mol/L蔗糖蔗糖-0.003mol/L氯化鈣溶液）并加氯化鈣溶液）并加入燒杯中，盡量剪碎肝組織。入燒杯中，盡量剪碎肝組織。3、勻漿徹底后，樣品夜、勻漿徹底后，樣品夜4層紗布過濾層紗布過濾（先用少量勻漿（先用少量勻漿緩沖液潤濕紗布）緩沖液潤濕紗布）后靜置后靜置5min,棄去沉渣，濾液轉(zhuǎn)棄去

14、沉渣，濾液轉(zhuǎn)移至玻璃離心管中。移至玻璃離心管中。4、平衡離心管，離心、平衡離心管，離心10min(1000r/min)后后,將上清液將上清液經(jīng)經(jīng)8層紗布過濾。再用足量的緩沖液層紗布過濾。再用足量的緩沖液懸浮沉淀。懸浮沉淀。6、取以上得到的溶液制一張涂片，自然干燥。用、取以上得到的溶液制一張涂片，自然干燥。用1甲烯蘭染液對涂片進(jìn)行染色。甲烯蘭染液對涂片進(jìn)行染色。5、在另一只離心管中先加入、在另一只離心管中先加入1/3體積的緩沖液體積的緩沖液，在家以，在家以上懸浮液加入管內(nèi)緩沖液上（不要混勻），然后將其以離上懸浮液加入管內(nèi)緩沖液上（不要混勻），然后將其以離心心10min(1000r/min)。7、