蛋白質(zhì)工程概論課件

1、蛋白質(zhì)工程概論蛋白質(zhì)工程概論蛋白質(zhì)工程概論蛋白質(zhì)工程概論前言v基因工程誕生基因工程誕生1010周年之際著名科學家周年之際著名科學家Kevin Kevin M.UlmerM.Ulmer于于19831983年在年在SCIENCE(VOL.219)SCIENCE(VOL.219)發(fā)表了論文發(fā)表了論文 Protein Engineering,該文的摘要是該文的摘要是: :vThe prospects for protein engineering ,including the roles of x-ray crystallography,chemical synthesis of DNA ,and c

2、omputer modeling of protein structure and folding,are discussed.It is now possible to attempt to modify many different properties of proteins by combining information on crystal structure and protein chemistry with artificial gene synthesis.Such techniques offer the potential for altering protein st

3、ructure and function in ways not possible by any other method.v該文的發(fā)表標志著作為生物工程三大技術之一的蛋該文的發(fā)表標志著作為生物工程三大技術之一的蛋白質(zhì)工程誕生了。白質(zhì)工程誕生了。 蛋白質(zhì)工程概論v蛋白質(zhì)工程（蛋白質(zhì)工程（protein engineeringprotein engineering）研究在過）研究在過去的去的2525年間發(fā)展迅速，已取得一批較好成果，年間發(fā)展迅速，已取得一批較好成果，并開始應用于醫(yī)學、農(nóng)業(yè)、輕工等各個領域。并開始應用于醫(yī)學、農(nóng)業(yè)、輕工等各個領域。v20002000年年6 6月月2626日，人類基因

4、組的工作草圖宣日，人類基因組的工作草圖宣告完成，并進入了后基因組時代（告完成，并進入了后基因組時代（post-post-genome eragenome era）。）。v后基因組時代，中心任務是揭示基因組及其后基因組時代，中心任務是揭示基因組及其所包含的全部基因的功能，并在此基礎上闡所包含的全部基因的功能，并在此基礎上闡明生命體的遺傳、進化、發(fā)育、生長、衰老、明生命體的遺傳、進化、發(fā)育、生長、衰老、死亡的基本生物學規(guī)律，以及與人類健康和死亡的基本生物學規(guī)律，以及與人類健康和疾病相關的生物學問題。疾病相關的生物學問題。蛋白質(zhì)工程概論一、蛋白質(zhì)工程的概念一、蛋白質(zhì)工程的概念 Protein Eng

5、ineeringProtein Engineeringv所謂蛋白質(zhì)工程，就是通過對蛋白質(zhì)已知結所謂蛋白質(zhì)工程，就是通過對蛋白質(zhì)已知結構和功能的了解，借助計算機輔助設計，利構和功能的了解，借助計算機輔助設計，利用基因定點誘變等技術，特異性地對蛋白質(zhì)用基因定點誘變等技術，特異性地對蛋白質(zhì)結構基因進行改造，產(chǎn)生具有新的特性的蛋結構基因進行改造，產(chǎn)生具有新的特性的蛋白質(zhì)的技術，并由此深入研究蛋白質(zhì)的結構白質(zhì)的技術，并由此深入研究蛋白質(zhì)的結構與功能的關系。與功能的關系。蛋白質(zhì)工程概論v蛋白質(zhì)工程是在遺傳工程取得的成就的基礎蛋白質(zhì)工程是在遺傳工程取得的成就的基礎上，融合蛋白質(zhì)結晶學、蛋白質(zhì)動力學、計上，融

6、合蛋白質(zhì)結晶學、蛋白質(zhì)動力學、計算機輔助設計和蛋白質(zhì)化學等學科而迅速發(fā)算機輔助設計和蛋白質(zhì)化學等學科而迅速發(fā)展起來的一個新興研究領域，它開創(chuàng)了按照展起來的一個新興研究領域，它開創(chuàng)了按照人類意愿設計制造符合人類需要的蛋白質(zhì)的人類意愿設計制造符合人類需要的蛋白質(zhì)的新時期，因此，被譽為第二代遺傳工程。新時期，因此，被譽為第二代遺傳工程。蛋白質(zhì)工程概論二、蛋白質(zhì)工程的基礎二、蛋白質(zhì)工程的基礎v（一）工、農(nóng)業(yè)以及醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)的高速發(fā)（一）工、農(nóng)業(yè)以及醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)的高速發(fā) 展為蛋白質(zhì)工程的開展開拓了廣闊應用前景展為蛋白質(zhì)工程的開展開拓了廣闊應用前景v（二）蛋白質(zhì)結構與功能關系研究技術的建（二）蛋白質(zhì)結構與

7、功能關系研究技術的建立推動了蛋白質(zhì)結構與功能關系的研究，從立推動了蛋白質(zhì)結構與功能關系的研究，從而為蛋白質(zhì)改造提供了理論依據(jù)而為蛋白質(zhì)改造提供了理論依據(jù)v（三）基因工程理論和技術的發(fā)展，為蛋白（三）基因工程理論和技術的發(fā)展，為蛋白質(zhì)的改造和生產(chǎn)提供了必要的技術手段質(zhì)的改造和生產(chǎn)提供了必要的技術手段蛋白質(zhì)工程概論（一）工、農(nóng)業(yè)以及醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)的高速發(fā)展（一）工、農(nóng)業(yè)以及醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)的高速發(fā)展 為蛋白質(zhì)工程的開展開拓了廣闊應用前景為蛋白質(zhì)工程的開展開拓了廣闊應用前景v1. 1.酶的開發(fā)利用依賴于蛋白質(zhì)工程的研發(fā)酶的開發(fā)利用依賴于蛋白質(zhì)工程的研發(fā)v加酶去污劑加酶去污劑: : 洗衣粉、漂白分等；洗衣粉

8、、漂白分等；蛋白質(zhì)工程概論v妨礙酶開發(fā)利用的原因主要有：妨礙酶開發(fā)利用的原因主要有：v生物材料中酶含量甚少，用傳統(tǒng)方法分離純化酶蛋生物材料中酶含量甚少，用傳統(tǒng)方法分離純化酶蛋白成本太高；白成本太高；v酶蛋白分子結構的穩(wěn)定性差，過酸、過堿、高溫、酶蛋白分子結構的穩(wěn)定性差，過酸、過堿、高溫、氧化等因素可破壞其結構，使其喪失生物活性，因氧化等因素可破壞其結構，使其喪失生物活性，因而在工業(yè)加工條件下，酶的半衰期短，利用率低；而在工業(yè)加工條件下，酶的半衰期短，利用率低；v酶催化活性的最適酶催化活性的最適pHpH值及底物專一性的范圍較窄，值及底物專一性的范圍較窄，與工業(yè)應用的要求有較大差距。與工業(yè)應用的要

9、求有較大差距。v因此，要想擴大酶蛋白的開發(fā)利用，需要建立適當因此，要想擴大酶蛋白的開發(fā)利用，需要建立適當?shù)姆椒?，以改善酶蛋白的生物特性，使之適合于工的方法，以改善酶蛋白的生物特性，使之適合于工業(yè)應用的需求，這就需要利用蛋白質(zhì)工程對蛋白質(zhì)業(yè)應用的需求，這就需要利用蛋白質(zhì)工程對蛋白質(zhì)進行改造。進行改造。蛋白質(zhì)工程概論v2.2.在多肽藥物、抗體以及其他活性蛋白質(zhì)的在多肽藥物、抗體以及其他活性蛋白質(zhì)的基礎與應用研究中，同樣存在著蛋白質(zhì)結構基礎與應用研究中，同樣存在著蛋白質(zhì)結構的改造問題的改造問題v如白細胞介素如白細胞介素-2-2（IL-2IL-2）是一種免疫反應調(diào)節(jié)）是一種免疫反應調(diào)節(jié)因子，在醫(yī)學上具

10、有廣泛的用途。結構研究因子，在醫(yī)學上具有廣泛的用途。結構研究證明，證明，IL-2IL-2是由是由133133個氨基酸殘基組成的多肽，個氨基酸殘基組成的多肽，有有3 3個半胱氨酸，個半胱氨酸，1 1個二硫鍵，而個二硫鍵，而125125位上的半位上的半胱氨酸處于游離狀態(tài)胱氨酸處于游離狀態(tài)，在分離純化，在分離純化IL-2IL-2的過程的過程中，易發(fā)生二硫鍵錯配，致使整個多肽活性中，易發(fā)生二硫鍵錯配，致使整個多肽活性降低。降低。v定點誘變將編碼鏈上編碼定點誘變將編碼鏈上編碼125125位半胱氨酸的密位半胱氨酸的密碼子碼子TGTTGT轉換成絲氨酸或丙氨酸的密碼轉換成絲氨酸或丙氨酸的密碼(TCT(TCT或

11、或GCA)GCA)，結果可以避免二硫鍵的錯配，使產(chǎn)，結果可以避免二硫鍵的錯配，使產(chǎn)品品IL-2IL-2的活性的活性提高了提高了7 7倍倍。蛋白質(zhì)工程概論v再如再如: :單克隆抗體是很有希望的疾病治療用藥單克隆抗體是很有希望的疾病治療用藥, ,但是但是, ,單克隆抗體技術建立起已有數(shù)十年單克隆抗體技術建立起已有數(shù)十年, ,并早并早已認識到其藥用價值已認識到其藥用價值, ,但至今應用不佳但至今應用不佳, ,原因是原因是鼠源單抗對人來說是異體蛋白。其人源化改鼠源單抗對人來說是異體蛋白。其人源化改造需蛋白質(zhì)工程才能完成。造需蛋白質(zhì)工程才能完成。蛋白質(zhì)工程概論（二）蛋白質(zhì)結構與功能關系研究技術的建立（二

12、）蛋白質(zhì)結構與功能關系研究技術的建立推動了蛋白質(zhì)結構與功能關系的研究，從而為推動了蛋白質(zhì)結構與功能關系的研究，從而為蛋白質(zhì)改造提供了理論依據(jù)蛋白質(zhì)改造提供了理論依據(jù)v研究表明，蛋白質(zhì)功能部位的幾個氨基酸殘研究表明，蛋白質(zhì)功能部位的幾個氨基酸殘基決定著蛋白質(zhì)的功能，但是這幾個負責功基決定著蛋白質(zhì)的功能，但是這幾個負責功能的氨基酸殘基必須處于一個極其精密的空能的氨基酸殘基必須處于一個極其精密的空間狀態(tài)下才能發(fā)揮功能。只有能維持蛋白質(zhì)間狀態(tài)下才能發(fā)揮功能。只有能維持蛋白質(zhì)結構域的必須氨基酸及其空間構象不變，其結構域的必須氨基酸及其空間構象不變，其功能域的生物學活性才會保持不變。功能域的生物學活性才會

13、保持不變。蛋白質(zhì)工程概論蛋白質(zhì)工程概論蛋白質(zhì)工程概論v因此在對蛋白質(zhì)進行改造之前必需對其結構因此在對蛋白質(zhì)進行改造之前必需對其結構與功能的關系進行充分地研究，了解影響蛋與功能的關系進行充分地研究，了解影響蛋白質(zhì)特性的氨基酸或氨基酸序列是哪些？改白質(zhì)特性的氨基酸或氨基酸序列是哪些？改變這個（些）氨基酸是否會影響蛋白質(zhì)的功變這個（些）氨基酸是否會影響蛋白質(zhì)的功能？能？v蛋白質(zhì)結構與功能關系研究技術主要包括蛋蛋白質(zhì)結構與功能關系研究技術主要包括蛋白質(zhì)晶體學、蛋白質(zhì)動力學、生物信息學等。白質(zhì)晶體學、蛋白質(zhì)動力學、生物信息學等。蛋白質(zhì)工程概論v1 1蛋白質(zhì)晶體學蛋白質(zhì)晶體學v蛋白質(zhì)晶體學（蛋白質(zhì)晶體學（

14、protein crystallographyprotein crystallography）是）是利用利用X X射線衍射法（射線衍射法（X-ray diffraction methodX-ray diffraction method）的原理解釋蛋白質(zhì)晶體中的原子在空間的位的原理解釋蛋白質(zhì)晶體中的原子在空間的位置與排列，并了解其與功能的關系。置與排列，并了解其與功能的關系。v2020世紀世紀5050年代末用年代末用X X射線晶體學方法測定了射線晶體學方法測定了第一個蛋白質(zhì)第一個蛋白質(zhì)肌紅蛋白的結構肌紅蛋白的結構. .v現(xiàn)已有現(xiàn)已有400400多種蛋白質(zhì)的三維結構被搞清。多種蛋白質(zhì)的三維結構被搞

15、清。蛋白質(zhì)工程概論v近年來又發(fā)展了近年來又發(fā)展了核磁共振（核磁共振（NMRNMR）技術）技術，它，它是確定蛋白質(zhì)分子在溶液中結構信息廣為使是確定蛋白質(zhì)分子在溶液中結構信息廣為使用的方法。核磁共振技術使用較低強度輻射用的方法。核磁共振技術使用較低強度輻射能測定蛋白質(zhì)分子在流動化液態(tài)下的三維結能測定蛋白質(zhì)分子在流動化液態(tài)下的三維結構信息，從而更真實地反映蛋白質(zhì)在生物環(huán)構信息，從而更真實地反映蛋白質(zhì)在生物環(huán)境下的結構信息，并能確定小分子與大分子境下的結構信息，并能確定小分子與大分子復合物的結構。復合物的結構。蛋白質(zhì)工程概論v2 2蛋白質(zhì)動力學蛋白質(zhì)動力學v線性多肽是如何折疊成具有三維特征的天然結構？

16、線性多肽是如何折疊成具有三維特征的天然結構？蛋白質(zhì)在與其他物質(zhì)（蛋白質(zhì)、核酸或酶的底物等）蛋白質(zhì)在與其他物質(zhì)（蛋白質(zhì)、核酸或酶的底物等）相互作用時，其三維結構又是經(jīng)歷怎樣的動態(tài)過程相互作用時，其三維結構又是經(jīng)歷怎樣的動態(tài)過程而發(fā)揮其活性？只有了解這些問題，才能預測基因而發(fā)揮其活性？只有了解這些問題，才能預測基因水平的改造最終會對蛋白質(zhì)結構與功能產(chǎn)生何種后水平的改造最終會對蛋白質(zhì)結構與功能產(chǎn)生何種后果，才能談得上具有真正意義的分子設計，才能真果，才能談得上具有真正意義的分子設計，才能真正的理解生命現(xiàn)象。蛋白質(zhì)動力學正是研究這一課正的理解生命現(xiàn)象。蛋白質(zhì)動力學正是研究這一課題的。題的。 蛋白質(zhì)工程

17、概論v3.3.生物信息學生物信息學v生物信息學生物信息學的神速發(fā)展為蛋白質(zhì)動力學的研究提供的神速發(fā)展為蛋白質(zhì)動力學的研究提供了方便有效的技術。了方便有效的技術。v生物信息學是利用計算機控制的生物信息學是利用計算機控制的圖像顯示系統(tǒng)圖像顯示系統(tǒng)，把，把所要研究蛋白質(zhì)的已知三維結構顯示在屏幕上，分所要研究蛋白質(zhì)的已知三維結構顯示在屏幕上，分析哪些殘基對析哪些殘基對分子內(nèi)分子內(nèi)相互作用可能是重要的，哪些相互作用可能是重要的，哪些殘基對殘基對分子間分子間相互作用可能是重要的。前者通常為相互作用可能是重要的。前者通常為結構的穩(wěn)定所必需，后者多系分子識別及活性重要結構的穩(wěn)定所必需，后者多系分子識別及活性重

18、要部位。部位。v然后通過計算機按預先設想替換一些側鏈基團，再然后通過計算機按預先設想替換一些側鏈基團，再用計算機尋找經(jīng)過用計算機尋找經(jīng)過“微擾微擾”后蛋白質(zhì)分子的能量趨后蛋白質(zhì)分子的能量趨于極小的狀態(tài)，預測由于這種替換可能造成的后果。于極小的狀態(tài)，預測由于這種替換可能造成的后果。蛋白質(zhì)工程概論（三）基因工程理論和技術的發(fā)展，為蛋（三）基因工程理論和技術的發(fā)展，為蛋白質(zhì)的改造和生產(chǎn)提供了必要的技術手段白質(zhì)的改造和生產(chǎn)提供了必要的技術手段v1.1.基因克隆、表達與純化技術的成熟為提高基因克隆、表達與純化技術的成熟為提高蛋白質(zhì)得率提供了重要技術策略蛋白質(zhì)得率提供了重要技術策略蛋白質(zhì)工程概論v2.2.

19、定點誘變技術的建立定點誘變技術的建立為改造蛋白質(zhì)的特性為改造蛋白質(zhì)的特性提供了技術策略提供了技術策略v穩(wěn)定蛋白質(zhì)空間構象的主要因素是蛋白質(zhì)分子眾多基團間的穩(wěn)定蛋白質(zhì)空間構象的主要因素是蛋白質(zhì)分子眾多基團間的相互作用，如相互作用，如肽鍵、氫鍵、靜電作用、肽鍵、氫鍵、靜電作用、疏水殘基間的疏水殘基間的疏水鍵疏水鍵以及以及二硫鍵二硫鍵等。等。v研究表明，上述穩(wěn)定蛋白質(zhì)空間構象的因素是由蛋白質(zhì)一級研究表明，上述穩(wěn)定蛋白質(zhì)空間構象的因素是由蛋白質(zhì)一級結構中某一個或某一段氨基酸序列決定的，人工改變或修飾結構中某一個或某一段氨基酸序列決定的，人工改變或修飾這些氨基酸殘基，有可能增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，又不影響其

20、這些氨基酸殘基，有可能增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，又不影響其生物學活性。生物學活性。蛋白質(zhì)工程概論v如野生型枯草桿菌蛋白酶的如野生型枯草桿菌蛋白酶的218218位天冬酰胺位天冬酰胺(Asn)(Asn)是酶活性部位有關的氨基酸殘基，若將是酶活性部位有關的氨基酸殘基，若將其變成其變成絲氨酸絲氨酸(Ser)(Ser)，用，用6565的失活半衰期衡的失活半衰期衡量，從量，從5959分鐘增到分鐘增到223223分鐘，酶的穩(wěn)定性顯分鐘，酶的穩(wěn)定性顯著增加。著增加。v再如氧化失活使枯草桿菌蛋白酶在工業(yè)上的再如氧化失活使枯草桿菌蛋白酶在工業(yè)上的應用受到嚴重限制。應用受到嚴重限制。v枯草桿菌蛋白酶在少量枯草桿菌蛋白酶在

21、少量H H2 2OO2 2作用下很快失活作用下很快失活是由于埋藏在催化部位是由于埋藏在催化部位Ser221Ser221鄰近的鄰近的Met222Met222氧化成硫氫化物的原因氧化成硫氫化物的原因。v19851985年年WellsWells證明若用其他氨基酸取代證明若用其他氨基酸取代Met222Met222，可以提高酶的氧化穩(wěn)定性而又保持，可以提高酶的氧化穩(wěn)定性而又保持高催化活性高催化活性。蛋白質(zhì)工程概論v所謂所謂基因定點誘變基因定點誘變（site-directed site-directed mutagenesismutagenesis），就是在），就是在DNADNA水平上，在體外水平上，在體

22、外試管中通過堿基取代、插入或缺失改變基因試管中通過堿基取代、插入或缺失改變基因DNADNA序列中任何一個（或幾個）特定的堿基，序列中任何一個（或幾個）特定的堿基，使蛋白質(zhì)結構基因中某個或某些氨基酸編碼使蛋白質(zhì)結構基因中某個或某些氨基酸編碼順序加以改變，從而改變蛋白質(zhì)結構的技術。順序加以改變，從而改變蛋白質(zhì)結構的技術。蛋白質(zhì)工程概論定點誘變原理示意圖蛋白質(zhì)工程概論蛋白質(zhì)工程概論三、蛋白質(zhì)工程的基本程序三、蛋白質(zhì)工程的基本程序v該技術綜合運用蛋白質(zhì)的三維結構，結構與功能關該技術綜合運用蛋白質(zhì)的三維結構，結構與功能關系的詳細信息，用定點誘變基因的方法直接修飾改系的詳細信息，用定點誘變基因的方法直接修

23、飾改變基因，或人工合成基因，從而定向改變蛋白質(zhì)的變基因，或人工合成基因，從而定向改變蛋白質(zhì)的結構，使其成為具有人們所希望性能的新型蛋白質(zhì)，結構，使其成為具有人們所希望性能的新型蛋白質(zhì)，或者創(chuàng)造自然界不存在的蛋白質(zhì)?；蛘邉?chuàng)造自然界不存在的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程概論 蛋白質(zhì)工程的程序蛋白質(zhì)工程的程序v分離純化分離純化0.11.0mg0.11.0mg純蛋白質(zhì)，純蛋白質(zhì)，v測定其部分肽段一段結構，根據(jù)編碼原則合成相應測定其部分肽段一段結構，根據(jù)編碼原則合成相應同位素標記的寡苷酸探針同位素標記的寡苷酸探針; ;v以此從基因庫中分離編碼該蛋白質(zhì)的克隆化基因，以此從基因庫中分離編碼該蛋白質(zhì)的克隆化基因，轉入噬菌

24、體轉入噬菌體M13M13系統(tǒng)，用雙脫氧末端終止法進行系統(tǒng)，用雙脫氧末端終止法進行DNADNA序列分析序列分析; ;v通過表達載體獲得較大量通過表達載體獲得較大量(0.11.0(0.11.0克克) )該蛋白質(zhì)用于該蛋白質(zhì)用于空間結構測定及結構與功能研究，借助計算機提出空間結構測定及結構與功能研究，借助計算機提出分子預測性質(zhì)及改造方案分子預測性質(zhì)及改造方案; ;v通過寡核苷酸通過寡核苷酸M13M13系統(tǒng)定點誘變并分離其突變體，系統(tǒng)定點誘變并分離其突變體，引入表達載體生產(chǎn)并純化多量突變性蛋白質(zhì)，分析引入表達載體生產(chǎn)并純化多量突變性蛋白質(zhì)，分析其性質(zhì)指導進一步分子設計，以最終獲得所預期性其性質(zhì)指導進一

25、步分子設計，以最終獲得所預期性質(zhì)的分子。質(zhì)的分子。蛋白質(zhì)工程概論v現(xiàn)階段蛋白質(zhì)工程急待解決的一個主要現(xiàn)階段蛋白質(zhì)工程急待解決的一個主要問題是問題是發(fā)展克隆基因的表達方法發(fā)展克隆基因的表達方法，即找，即找到理想的宿主表達系統(tǒng)。目前常用的表到理想的宿主表達系統(tǒng)。目前常用的表達系統(tǒng)有細菌表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、達系統(tǒng)有細菌表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、昆蟲表達系統(tǒng)、哺乳動物細胞等，這些昆蟲表達系統(tǒng)、哺乳動物細胞等，這些表達系統(tǒng)各有優(yōu)缺點。表達系統(tǒng)各有優(yōu)缺點。蛋白質(zhì)工程概論細菌表達系統(tǒng)細菌表達系統(tǒng)v細菌表達系統(tǒng)培養(yǎng)方法簡單、增殖快、生產(chǎn)細菌表達系統(tǒng)培養(yǎng)方法簡單、增殖快、生產(chǎn)成本低成本低; ;v但缺乏真核細胞特有的加工后處理，而且在但缺乏真核細胞特有的加工后處理，而且在菌體中表達的外源蛋白，在原核細胞中不穩(wěn)菌體中表達的外源蛋