基于葉綠體DNA+PCR-RFLP分析柿及其近緣種親緣關(guān)系

1、園藝學(xué)報(bào)，（）： 42480 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20140724；修回日期：20141031 基金項(xiàng)目：國(guó)家十二五農(nóng)村領(lǐng)域科技計(jì)劃課題（2013BAD14D0502） 基于葉綠體DNA PCR-RFLP分析柿及其近緣種親緣關(guān)系 梁晉軍，梁玉琴，傅建敏* （國(guó)家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心，鄭州 ） 摘 要：應(yīng)用5對(duì)葉綠體DNA（cpDNA）特異引物對(duì)柿及其近緣的8個(gè)種共32個(gè)基因型的cpDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用7種限制性內(nèi)切酶

2、對(duì)其擴(kuò)增產(chǎn)物酶切位點(diǎn)變異分析表明，在供試柿屬植物中存在豐富的種間多態(tài)性，但供試22個(gè)柿種內(nèi)基因型未檢測(cè)到變異位點(diǎn)。應(yīng)用NTSYS中UPGMA法聚類和主坐標(biāo)分析表明：柿與金棗柿最近緣，其次分別是油柿、云南野毛柿、浙江柿和君遷子，而與美洲柿和烏柿相距較遠(yuǎn)。野柿（浙江）為柿的變種，聚類結(jié)果也表明野柿（浙江）與柿有一定差異。 關(guān)鍵詞：柿；cpDNA；PCR-RFLP；遺傳多樣性；親緣關(guān)系 中圖分類號(hào)：S 665.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0513-353X（2014）12-2474-07 Genetic Relationships of Diospyros kaki and Related Dio

3、spyros Species Using Chloroplast DNA PCR-RFLP Markers LIANG Jin-jun，LIANG Yu-qin，and FU Jian-min* （China Paulownia Research Center，Non-timber Forest Research and Development Center，Chinese Academy of Forestry，Zhengzhou ，China） Abstract：Five special primer pairs of chloroplast genome were used to amp

4、lified chloroplast DNA （cpDNA）regions in 8 Diospyros species including 32 genotypes. The products were digested by seven restriction enzymes. The results showed high interspecific cpDNA variations within the genus Diospyros. Twenty-two D. kaki genotypes were detected no visually variation in this st

5、udy. D. kaki had closely relationship withJinzaoshi，followed by D. oleifera，D. artrotricha，D. lotus and D. glaucifolia，but distant from D. virginiana and D. cathayensis in diagram based on the UPGMA cluster analysis by NTSYSpc 2.10e program. Wild persimmon（Zhejiang）is a variety varietas of persimmon

6、. The result showed that wild persimmon（Zhejiang）is not closely similar to D. kaki. Key words：Diospyros kaki；cpDNA；PCR-RFLP；genetic diversity；genetic relationship 柿（Diospyros kaki Thunb.）品種多數(shù)為六倍體，2n = 6x = 90，但也有少量九倍體，2n = 9x = 135（Zhuang et al.，1990）。前人已經(jīng)通過各種分子標(biāo)記對(duì)柿及其近緣種親緣關(guān)系進(jìn)行研究，但結(jié)果差異較大。Yuri和Shozo（1

7、994）通過對(duì)柿及其近緣種葉綠體DNA（cpDNA）和線粒體DNA（mtDNA） * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：fjm371） 12期 梁晉軍等：基于葉綠體DNA PCR-RFLP分析柿及其近緣種親緣關(guān)系 2475 的RFLP分析，發(fā)現(xiàn)老鴉柿與柿最近緣；Keizo等（1998）對(duì)柿屬植物cpDNA PCR-RFLP分析的結(jié)果表明柿與美洲柿最近緣；Hu等（2008）、Guo和Luo（2011）分別用cpDNA PCR-RFLP和SSR分析表明柿與君遷子最近緣；Keizo等（2008）用nrDNA的ITS區(qū)和cpDNA matK序列分析的結(jié)果表明柿

8、與油柿最近緣。此外，Hu等（2008）和Tang等（2014）分別用cpDNA PCR-RFLP和ITS，matK序列變異分析證明金棗柿為一個(gè)新種。 由于柿倍性復(fù)雜，其核基因組結(jié)構(gòu)和序列也是復(fù)雜多變，從核基因組開發(fā)分子標(biāo)記有一定難度，相較于核基因，葉綠體基因組結(jié)構(gòu)和序列非常保守，所以葉綠體基因組能很好地用于種間甚至種內(nèi)系統(tǒng)進(jìn)化和親緣關(guān)系的研究（Randall et al.，1998）。目前，基于cpDNA的PCR-RFLP的分子標(biāo)記已廣泛用于遺傳多樣性、系統(tǒng)進(jìn)化和植物種類鑒定等研究（Claudia et al.，2004；Pharmawati et al.，2004；Bao et al.，20

9、05）。本研究中通過對(duì)4個(gè)柿近緣種（君遷子、浙江柿、金棗柿和油柿）cpDNA全基因組測(cè)序結(jié)果對(duì)比分析，找出變異較大的4個(gè)區(qū)段（trnH-matK、rpoB-petN、trnS-trnfM和ndhA）和1個(gè)功能基因（rbcL）片段，并設(shè)計(jì)特異引物對(duì)32份柿屬植物的5個(gè)cpDNA區(qū)域進(jìn)行PCR-RFLP分析，以期為柿及其近緣種親緣關(guān)系提供有效證據(jù)。 1 材料與方法 1.1 材料 試材為柿及其近緣種共8種，1個(gè)變種32個(gè)基因型（表1）。烏柿、美洲柿和油柿于2014年采自陜西楊陵國(guó)家柿種質(zhì)資源圃，其余于2013年采自國(guó)家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心柿種質(zhì)資源圃。 1.2 cpDNA區(qū)域選擇與引物設(shè)計(jì) 201

10、3年6月采用Kerstin等（2008）改良的蔗糖密度梯度離心分離法提取4個(gè)柿近緣種（金棗柿、君遷子、浙江柿和油柿）的葉綠體總DNA；超聲波隨機(jī)打斷DNA，電泳回收所需大小片段，加上接頭進(jìn)行文庫(kù)制備；最后用Illumina-Miseq測(cè)序儀完成規(guī)定數(shù)據(jù)的測(cè)序。采用Calera assembler組裝軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行組裝。使用DOGMA軟件對(duì)基因進(jìn)行注釋，最后經(jīng)過人工校正，用ClustalX對(duì)4個(gè)全基因組序列進(jìn)行對(duì)比，找出差異較大的4個(gè)區(qū)段（trnH-matK、rpoB-petN、trnS-trnfM和ndhA）和差異較小的1個(gè)功能基因（rbcL）片段。 針對(duì)所選5個(gè)區(qū)段上、下游，利用Prim

11、er 5.0軟件設(shè)計(jì)特異引物（表2），并用Oligo7.0軟件對(duì)引物進(jìn)行評(píng)價(jià)，選出最優(yōu)特異引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 1.3 DNA提取、PCR擴(kuò)增和限制性酶切 1.3.1 DNA提取和PCR擴(kuò)增 2013年6月采用CTAB法（Doyle & Doyle，1987）從柿幼嫩葉片中提取植物總DNA，2014年4月進(jìn)行補(bǔ)充試驗(yàn)。 2014年4月試材DNA在bio-red公司PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體積為25 L，內(nèi)含1 PCR緩沖液（含1.5 mmol L-1 Mg2+），250 mol L-1 dNTP，10 mmol L-1 Tris-HCl，50 mmol L-1

12、 KCl，0.2 mol L-1 primers，1.25 U Taq DNA polymerase，DNA 40 ng。PCR程序?yàn)?4 預(yù)熱3 min，1個(gè)循環(huán)；94 變性45 s，52.7 56 退火1 min（表2），72 延伸1 min 15 s 2 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 延伸5 min，4 保溫。PCR產(chǎn)物通過Gelred染色的2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。Bio-red公司凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄譜帶。 2476 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 表1 試驗(yàn)材料 Table 1 The materials in this study 學(xué)名 Scientific name 倍性

13、水平Ploidy level 編號(hào) Code 種/品種名 Specie/cultivar name 脫澀類型Astringent type 來源 Source Diospyros lotus 2n = 2x = 30 1 君遷子（雌）Date plum（female） 陜西 Shaanxi 2n = 2x = 30 2 君遷子（雄）Date plum（male） 陜西 Shaanxi D. glaucifolia 2n = 2x = 30 3 浙江柿Chekiang persimmon 浙江 Zhejiang D. kaki Thunb. var. silvestris 2n = 6x = 9

14、0 4 野柿（浙江）Wild persimmon（Zhejiang） 浙江 Zhejiang D. oleifera 2n = 2x = 30 5 油柿Oily persimmon 浙江 Zhejiang D. virginiana L. 2n = 6x = 90 6 美洲柿（雌）Common persimmon（female） 美國(guó) USA 2n = 6x = 90 7 美洲柿（雄）Common persimmon（male） 美國(guó) USA D. sp. 2n = 2x = 30 8 金棗柿Jinzaoshi 浙江 Zhejiang D. cathayensis 2n = 6x = 90 9

15、 烏柿Woolly-flowered Persimmon 陜西 Shaanxi D. artrotricha 2n = 2x = 30 10 云南野毛柿Yunnan Yemaoshi 云南 Yunnan D. kaki Thunb. 2n = 6x = 90 11 富有Fuyuu PCNA 日本 Japan 12 次郎Jirou PCNA 日本 Japan 13 晚御所Oku-gosho PCNA 日本 Japan 14 陽豐Youhou PCNA 日本 Japan 15 禪寺丸Zenjimaru PVNA 日本 Japan 16 湖南鳥柿Hunan Niaoshi PCA 湖南 Hunan

16、17 黑柿Blank Persimmon PCA 日本 Japan 18 斤柿Jin Persimmon PCA 日本 Japan 19 正月 Akagaki PVNA 日本 Japan 20 甜寶蓋Baogai Tianshi PCNA 湖北 Hubei 21 秋焰Qiuyan PCNA 湖北 Hubei 22 羅田甜柿Luotian Tianshi PCNA 湖北 Hubei 23 磨盤柿 Mopanshi PCA 河北 Hebei 24 長(zhǎng)安懷抱月Changan Huaibaoyue PCA 陜西 Shaanxi 25 臺(tái)灣正柿Taiwan Zhengshi PCA 臺(tái)灣 Taiwan

17、26 牛頭柿Niutoushi PCA 福建 Fujian 27 野柿1號(hào) Wild persimmon 1 湖南 Hunan 28 野柿2號(hào) Wild persimmon 2 湖北 Hubei 29 野柿3號(hào) Wild persimmon 3 湖北 Hubei 30 野柿4號(hào) Wild persimmon 4 江蘇 Jiangsu 31 野柿5號(hào) Wild persimmon 5 湖北 Hubei 2n = 9x = 135 32 平核無Hiratanenashi PVA 日本 Japan 注：PCNA：完全甜柿；PCA：完全澀柿；PVNA：不完全甜柿；PVA：不完全澀柿；：未知。 Note

18、：PCNA：Pollination-constant and non-astringent；PCA：Pollination constant astringent；PVNA：Pollination variant non-astringent；PVA：Pollination variant astringent；：Unknown. 表2 cpDNA特異引物序列及擴(kuò)增條件 Table 2 cpDNA the sequence and amplification conditions of cpDNA special primer pairs in this study 區(qū)域 Region 正向引

19、物 Squence forward（53） 反向引物 Sequence reverse（53） 退火溫度/ Annealing temperature 片段長(zhǎng)度/bp Fragment lengthtrnH-matK ATTCTTCGTCGCCGTAGTAAA GGCGGATTTGGTATTTGGA 55 2 200 rpoB-petN AAAGTTCTTCCGTCAAGC TCCCCATACTACGAGTGAAA 52.7 2 000 trnS-trnfM GCTATCAACCACTCAGCCATCT GAGGTCACGGGTTCAAATC 56 1 000 ndhA ATTCAGTTTGA

20、TAACCTGCTAC TTTGGCTATCGTCTTGTTCTA 53 1 500 rbcL GGAGGGATTTATGTCACCAC TTGTATTCGGCTCAATCCTT 55 1 500 12期 梁晉軍等：基于葉綠體DNA PCR-RFLP分析柿及其近緣種親緣關(guān)系 2477 1.3.2 酶切反應(yīng) 應(yīng)用Apo、Hinf、Taq、Mse、Mbo、Ava和Dra 7種限制性內(nèi)切酶（購(gòu)自NEB公司）對(duì)擴(kuò)增出的cpDNA片段進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)體積為15 L，內(nèi)含6 L PCR產(chǎn)物，2 4 U限制性內(nèi)切酶和1 限制性內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液，酶切時(shí)間為10 h，除Taq反應(yīng)溫度為65 外，其余均為37

21、。酶切產(chǎn)物通過Gelred染色的2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。Bio-red凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄譜帶。 根據(jù)擴(kuò)增片段酶切產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖譜上條帶的有或無標(biāo)記為1或0，建成原始矩陣。應(yīng)用NTSYS 2.10，依據(jù)UPGMA（unweighted pair group method arithmetic averages）法進(jìn)行聚類分析。 2 結(jié)果與分析 2.1 柿及其近緣種cpDNA PCR-RFLP的多態(tài)性 設(shè)計(jì)的5對(duì)特異引物均能在供試32份柿及其近緣種中擴(kuò)增出一條譜帶，通過2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)出擴(kuò)增產(chǎn)物無明顯長(zhǎng)度差異。 5個(gè)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)過Apo、Hinf、Taq、Mse、Mbo

22、、Ava和Dra 7種限制性內(nèi)切酶酶切，35對(duì)特異引物/限制性內(nèi)切酶組合中有22對(duì)（62.9%）檢測(cè)到明顯的種間差異，共獲得181個(gè)片段，其中105個(gè)片段（58%）呈現(xiàn)多態(tài)性。在rpoB-petN、trnS-trnfM、ndhA、rbcL區(qū)域均未檢測(cè)到Ava的酶切位點(diǎn)，trnH-matK、rpoB-petN、ndhA區(qū)域與其余6種限制性內(nèi)切酶組合均存在豐富的種間多態(tài)性，說明本試驗(yàn)所選區(qū)域種間存在較大變異；而rbcL區(qū)域僅有一個(gè)酶切組合存在多態(tài)性，說明在關(guān)鍵功能基因片段（rbcL）處柿近緣種存在較少變異，以此反推所選近緣種均與柿親緣關(guān)系較近。在所有35對(duì)酶切組合中未檢測(cè)到22個(gè)柿種內(nèi)試材有酶切位

23、點(diǎn)差異，表明柿種內(nèi)葉綠體基因組十分保守。 由圖1可以看出，依據(jù)trnH-matK/Dra、rpoB-petN/Mbo兩種區(qū)域/酶切組合可明確將8個(gè)種，1個(gè)變種，分為9組：1和2：君遷子；3：浙江柿；4：野柿（浙江）；5：油柿；6和7：美洲柿；8：金棗柿；16：烏柿；10：云南野毛柿；11 15：柿品種。在22對(duì)多態(tài)性酶切組合中，僅trnS-trnfM/Apo組合能檢測(cè)出君遷子（1和2）的雌雄位點(diǎn)變異（圖1，D）；僅trnH-matK/Dra（圖1，A）組合能檢測(cè)出柿變種野柿（浙江）與柿位點(diǎn)變異（圖1，A中4與11 15）。ndhA/Mbo（圖1，C）組合可能有存在柿種內(nèi)些微長(zhǎng)度差異（未記錄新條

24、帶），尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。 材料16 32全部為無差異位點(diǎn)柿種內(nèi)品種，未單獨(dú)列出。 2.2 柿及其近緣種間的親緣關(guān)系 根據(jù)所得到酶切位點(diǎn)變異數(shù)據(jù)建成的原始矩陣，利用NTSYS-pc version 2.10軟件計(jì)算SM相似指數(shù)，UPGMA法進(jìn)行聚類（圖2），柿種內(nèi)22個(gè)品種無差異歸為柿種下；同時(shí)進(jìn)行8個(gè)種種間主坐標(biāo)分析（圖3），雌雄（君遷子和美洲柿）歸為一種，柿種內(nèi)22個(gè)品種和1個(gè)變種野柿（浙江）歸為柿種下。在圖2和圖3中，六倍體柿與同為多倍體的美洲柿和烏柿相似性最差，分布位置最遠(yuǎn)，表明柿與烏柿和美洲柿親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，盡管柿與烏柿、美洲柿倍性相同，但cpDNA序列變異較大，表明兩者有不同的起源祖

25、先，這與前人研究結(jié)果（Nakasuka et al.，2002；Choi et al.，2003；Guo & Luo，2006；Guo et al.，2006；Hu et al.，2008）一致；柿與金棗柿、油柿和云南野毛柿聚為一類，且柿與二倍體金棗柿相似度最高，親緣關(guān)系最近，該結(jié)果與Hu等（2008）和Guo等（2011）關(guān)于柿與君遷子最近緣的結(jié)果不同。 2478 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 圖1 部分柿及其近緣種cpDNA PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后2.5%瓊脂糖凝膠電泳圖譜 1 16見表1，MA為DL2000，MB為50 bp ladder。 Fig. 1 Restriction pat

26、terns of amplified and digested products of chloroplast genomic DNA from Diospyros spp. 116 refer to the numbers list in Table 1. MA：DL2000；MB：50 bp ladder. 圖2 PCR-RFLP分析的UPGMA聚類圖 Fig. 2 Dendrogram of all genotypes from the UPGMA cluster analysis based on PCR-RFLP data 12期 梁晉軍等：基于葉綠體DNA PCR-RFLP分析柿及

27、其近緣種親緣關(guān)系 2479 圖3 柿屬植物種間PCR-RFLP主坐標(biāo)分析散點(diǎn)圖 Fig. 3 Diagram showing the relationships among species based on principal coordinates analysis by PCR-RFLP 3 討論 前人通過Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Southern雜交（Nakasuka et al.，2002）；檢測(cè)DNA重復(fù)位點(diǎn)序列同源性（Choi et al.，2003）；SRAP、IRAP、REMAP（Guo & Luo，2006；Guo et al.，2006）；cpDNA PCR-RFLP多

28、態(tài)性分析（Hu et al.，2008）均表明美洲柿與柿親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，本試驗(yàn)結(jié)果與之一致。但Keizo等（1998）通過對(duì)東南亞部分柿屬植物包括24個(gè)種的限制性內(nèi)切酶酶切研究，用鄰接法分析表明柿與美洲柿、君遷子聚成一組，導(dǎo)致結(jié)果不完全相同的原因是所選材料和擴(kuò)增區(qū)段不同。 有研究用cpDNA PCR-RFLP和SSR分析表明柿與君遷子親緣關(guān)系最近（Hu et al.，2008；Guo & Luo，2011）；而本試驗(yàn)結(jié)果表明柿與君遷子、浙江柿親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，柿與金棗柿、油柿、云南野毛柿聚為一類，親緣關(guān)系較與君遷子和浙江柿更近（圖2，圖3），導(dǎo)致兩種不同結(jié)果最可能的原因是選用擴(kuò)增區(qū)域和限制性內(nèi)切酶的

29、不同。Keizo等（2008）通過用nrDNA ITS區(qū)和cpDNA matK序列分析表明柿與油柿最近緣，這與本試驗(yàn)中柿與金棗柿、油柿、云南野毛柿聚為一類的結(jié)果（圖2）相一致，就柿與油柿的葉片表觀形態(tài)而言，柿也與油柿相近。本試驗(yàn)結(jié)果表明柿種內(nèi)無酶切位點(diǎn)差異與前人（Yuri & Shozo，1994；Keizo et al.，1998；Hu et al.，2008）用同一方法得到的結(jié)果一致。 金棗柿曾被學(xué)術(shù)界認(rèn)定為柿的一個(gè)二倍體品種（楊勇 等，1999），后經(jīng)Hu等（2008）和Tang等（2014）分別用cpDNA PCR-RFLP和ITS，matK序列變異分析證明金棗柿為一個(gè)新種。本試驗(yàn)中柿

30、與金棗柿能完全分開，支持金棗柿為一新種的結(jié)論。 References Bao Y，Lu B R，Ge S. 2005. Identification of genomic constitutions of Oryza species with the B and C genomes by the PCR-RFLP method. Genetic Resources and Crop Evolution，52：6976. Choi Y A，Tao R，Keizo Y，Sugiura A. 2003. Genomic distribution of three repetitive DNAs in

31、 cultivated hexaploid Diospyros spp.（D. kaki and D. virginiana）and their wild relatives. Genes Genet Syst，78：301308. Claudia C，Muhamment T，Phillip D G. 2004. Discrimination of diploid crucifer species using PCR-RFLP of chloroplast DNA. HortScience，39 (7)：15751577. Doyle J J，Doyle J L. 1987. A rapid

32、DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bul，19：1115. 2480 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 Guo D L，Luo Z R. 2006. Genetic relationships of some PCNA persimmons（Diospyros kaki Thunb.）from China and Japan revealed by SRAP analysis. Genet Res Crop Evol，53：15971603. Guo D L，Luo Z R. 2011

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