酶制劑發(fā)酵生產

1、第二章第二章 酶的發(fā)酵生產酶的發(fā)酵生產 一、酶生物合成的基本理論一、酶生物合成的基本理論v一、一、RNA的生物合成的生物合成轉錄轉錄v二、蛋白質的生物合成二、蛋白質的生物合成翻譯翻譯v三、酶生物合成的調節(jié)三、酶生物合成的調節(jié)1、RNA的生物合成的生物合成轉錄轉錄v轉錄是以轉錄是以DNA為模板，以核苷三磷為模板，以核苷三磷酸為底物，在酸為底物，在RNA聚合酶（轉錄酶）聚合酶（轉錄酶）的作用下，生成的作用下，生成RNA的過程。的過程。2、蛋白質的生物合成、蛋白質的生物合成翻譯翻譯翻譯：以翻譯：以mRNAmRNA為模板，以氨基酸為底為模板，以氨基酸為底物，在核糖體上通過各種物，在核糖體上通過各種tR

2、NAtRNA，酶和酶和輔助因子的作用，合成多肽的過程。輔助因子的作用，合成多肽的過程。第一節(jié)第一節(jié) 酶生物合成調控機制酶生物合成調控機制一、誘導酶合成調節(jié)（一、誘導酶合成調節(jié)（Induction） v操縱子學說概述：操縱子學說概述： 1 1、操縱子（、操縱子（operonoperon）：）： 基因表達和控制的一個完整單元，其中包括基因表達和控制的一個完整單元，其中包括結構基因，調節(jié)基因，操作子和啟動子。結構基因，調節(jié)基因，操作子和啟動子。Structure of a typical operon 結構基因結構基因(structural genes)(structural genes)： 決定某

3、一多肽的決定某一多肽的DNADNA模板，可根據(jù)其上的堿模板，可根據(jù)其上的堿基順序轉錄出相應的基順序轉錄出相應的mRNAmRNA，然后再可通過核，然后再可通過核糖體轉譯出相應的酶糖體轉譯出相應的酶 啟動子啟動子(promoter)(promoter)： 能被能被RNARNA聚合酶所識別的堿基順序，是聚合酶所識別的堿基順序，是RNARNA聚合聚合 酶的結合部位和轉錄起點。酶的結合部位和轉錄起點。 操縱子（操縱子（operatoroperator）： 位于啟動基因和結構基因之間的一段堿基順序，位于啟動基因和結構基因之間的一段堿基順序，是阻遏蛋白的結合位點，能通過與阻遏物相結是阻遏蛋白的結合位點，能通

4、過與阻遏物相結合來決定結構基因的轉錄是否能進行合來決定結構基因的轉錄是否能進行 調節(jié)基因（調節(jié)基因（regulator generegulator gene）： 用于編碼組成型調節(jié)蛋白的基因，用于編碼組成型調節(jié)蛋白的基因，一般遠離一般遠離操縱子操縱子, ,但在原核生物中但在原核生物中, ,可以位于操縱子旁可以位于操縱子旁邊邊, ,編碼調節(jié)蛋白。編碼調節(jié)蛋白。乳糖操縱子調控乳糖操縱子調控調節(jié)調節(jié)基因基因操縱操縱基因基因乳糖結構基因乳糖結構基因PLacZLacYLaca 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）基基 因因 關關 閉閉啟啟動動子子ORA、無乳糖存在、無乳糖存在PLacZLacYLaca調

5、節(jié)調節(jié)基因基因操縱操縱基因基因乳糖結構基因乳糖結構基因啟啟動動子子ORmRNAZmRNAYmRNAa 阻遏蛋白阻遏蛋白（無活性）（無活性） 基基 因因 表表達達B、有乳糖存在、有乳糖存在 乳糖乳糖 阻遏蛋白阻遏蛋白（有活性）（有活性）乳糖操縱子假說對指導酶生產的意義乳糖操縱子假說對指導酶生產的意義(1)(1)現(xiàn)代誘變育種技術現(xiàn)代誘變育種技術 調節(jié)基因發(fā)生突變調節(jié)基因發(fā)生突變 不能產生阻遏蛋白不能產生阻遏蛋白 誘導酶變成組成酶誘導酶變成組成酶 RNARNA聚合酶便能起作用，操縱子便能持久地聚合酶便能起作用，操縱子便能持久地“開開”，并連續(xù)產生，并連續(xù)產生-半乳糖苷酶半乳糖苷酶v(2)(2)在誘導

6、酶合成時加入誘導物以利誘導酶的在誘導酶合成時加入誘導物以利誘導酶的合成食品工業(yè)應用的酶包括淀粉酶、蛋白合成食品工業(yè)應用的酶包括淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、葡萄糖異構酶、酶、纖維素酶、葡萄糖異構酶、- - 半乳糖半乳糖苷酶等，它們均屬于誘導酶，根據(jù)上述原理，苷酶等，它們均屬于誘導酶，根據(jù)上述原理，在合成時最好的誘導物為該酶的作用底物或在合成時最好的誘導物為該酶的作用底物或其結構類似物。其結構類似物。二、酶合成的反饋阻遏二、酶合成的反饋阻遏 Repressionv反饋阻遏是指酶作用的終產物對酶合成反饋阻遏是指酶作用的終產物對酶合成產生阻遏作用產生阻遏作用 阻遏蛋白阻遏蛋白操縱基因操縱基因結構基因結構

7、基因調節(jié)基因調節(jié)基因mRNA酶蛋白酶蛋白阻遏蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結合，所以結構基因表達。不能與操縱基因結合，所以結構基因表達。酶代謝產物一旦大量積累酶代謝產物一旦大量積累v這一理論在實踐意義：這一理論在實踐意義：(1)(1)設法從培養(yǎng)基中除去其終產物，以消除反設法從培養(yǎng)基中除去其終產物，以消除反饋阻遏。饋阻遏。三、酶合成的分解代謝阻遏作用三、酶合成的分解代謝阻遏作用v又稱葡萄糖效應又稱葡萄糖效應 是指微生物在其培養(yǎng)基中由于葡萄糖的存在是指微生物在其培養(yǎng)基中由于葡萄糖的存在雖然能迅速生長，但明顯地抑制某些分解代雖然能迅速生長，但明顯地抑制某些分解代謝誘導酶的形成。謝誘導酶的形成。 將將E.

8、coliE.coli培養(yǎng)在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上，出現(xiàn)上，出現(xiàn)“二峰生長現(xiàn)象二峰生長現(xiàn)象” 即使有乳糖存在，也要等葡萄糖耗盡之后誘即使有乳糖存在，也要等葡萄糖耗盡之后誘導形成導形成 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 葡萄糖分解產物對葡萄糖分解產物對 - -半乳糖苷酶形成阻遏半乳糖苷酶形成阻遏葡萄糖過量存在葡萄糖過量存在放出的能量部分儲存在放出的能量部分儲存在ATPATP中中ADP+AMP ADP+AMP ATP ATP cAMP +H2O AMP cAMP +H2O AMP cAMP-CRPcAMP-CRP復合物的濃度降低復合物的濃度降低啟動基因啟動基因(P)(P)

9、上沒有上沒有cAMP-CRPcAMP-CRP復合物結合復合物結合RNARNA聚合酶無法結合到啟動基因聚合酶無法結合到啟動基因酶的生物合成無法進行。酶的生物合成無法進行。磷酸二酯酶磷酸二酯酶酶酶微生物微生物引起阻遏作用物質引起阻遏作用物質-淀粉酶淀粉酶嗜熱脂肪芽孢桿菌嗜熱脂肪芽孢桿菌果糖果糖纖維素酶纖維素酶綠色木霉綠色木霉葡萄糖、甘油、纖維二糖葡萄糖、甘油、纖維二糖蛋白酶蛋白酶巨大芽孢桿菌巨大芽孢桿菌葡萄糖葡萄糖淀粉葡萄糖苷酶淀粉葡萄糖苷酶二孢內孢酶二孢內孢酶麥芽糖、葡萄糖、甘油麥芽糖、葡萄糖、甘油分解代謝阻遏實例分解代謝阻遏實例v用甘油代替果糖培養(yǎng)嗜熱脂肪芽孢桿菌，用甘油代替果糖培養(yǎng)嗜熱脂肪芽

10、孢桿菌，- - 淀粉酶產量可提高淀粉酶產量可提高2525倍。倍。v采用甘露糖作為熒光假單胞桿菌培養(yǎng)基時，采用甘露糖作為熒光假單胞桿菌培養(yǎng)基時，纖維素酶的產量比用半乳糖作為培養(yǎng)基時要纖維素酶的產量比用半乳糖作為培養(yǎng)基時要高高15001500倍以上。倍以上。v如果微生物需要某些代謝阻遏物作為碳源，如果微生物需要某些代謝阻遏物作為碳源，在工業(yè)生產中則可采用限量流加碳源的辦法，在工業(yè)生產中則可采用限量流加碳源的辦法，便可減少或避免這種阻遏作用。便可減少或避免這種阻遏作用。第二節(jié)第二節(jié) 產酶微生物及其選育產酶微生物及其選育 動物動物 酶酶 植物植物 微生物微生物微生物易于大量培養(yǎng)，倍增時間短；微生物易于

11、大量培養(yǎng)，倍增時間短；DNADNA技術使微生物生產特殊作用的酶，并技術使微生物生產特殊作用的酶，并大大提高產量；大大提高產量；因此，微生物可以說是酶商業(yè)化生產的最佳來源。因此，微生物可以說是酶商業(yè)化生產的最佳來源。（1 1）相近菌種產生的酶在性質上一般相近或）相近菌種產生的酶在性質上一般相近或相似。相似。Exp.Exp.地衣芽胞桿菌與淀粉液化芽胞桿菌是近緣地衣芽胞桿菌與淀粉液化芽胞桿菌是近緣菌，它們產生的蛋白酶性質很相近；菌，它們產生的蛋白酶性質很相近；1 1、產酶菌的分布規(guī)律、產酶菌的分布規(guī)律（2 2）胞外酶的穩(wěn)定性和最適反應條件一般與）胞外酶的穩(wěn)定性和最適反應條件一般與菌產酶的最適生長條件

12、一致。菌產酶的最適生長條件一致。exp.exp.嗜堿芽胞桿菌來源的蛋白酶作用的最適嗜堿芽胞桿菌來源的蛋白酶作用的最適pHpH比嗜中性地衣芽胞桿菌來源的蛋白么高出幾比嗜中性地衣芽胞桿菌來源的蛋白么高出幾個單位。個單位。從耐熱凝結芽胞桿菌得到的從耐熱凝結芽胞桿菌得到的-淀粉酶比常溫淀粉酶比常溫淀粉液化芽孢桿菌來源者高出淀粉液化芽孢桿菌來源者高出1010。（3 3）為獲得能夠降解某種物質的產酶菌株，）為獲得能夠降解某種物質的產酶菌株，一般可以從該物質比較豐富的地方尋找。一般可以從該物質比較豐富的地方尋找。 Exp. Exp. 豆科植物的根系中，往往存在根瘤菌；豆科植物的根系中，往往存在根瘤菌； 油田

13、和煉油廠周圍土層中常見分解石油的微油田和煉油廠周圍土層中常見分解石油的微生物；生物； 處理降解合成物質的產酶菌則往往能在污水處理降解合成物質的產酶菌則往往能在污水處理處獲得；處理處獲得；v生產性能鑒定主要通過初篩和復篩確定。生產性能鑒定主要通過初篩和復篩確定。v初篩是從已分離出來的菌種中挑出能產生目初篩是從已分離出來的菌種中挑出能產生目標酶的菌株，要求檢出方法快捷、簡便標酶的菌株，要求檢出方法快捷、簡便v初篩多選用平板培養(yǎng)透明圈法初篩多選用平板培養(yǎng)透明圈法3 3、菌種生產性能鑒定、菌種生產性能鑒定v特定酶產生菌的篩選方法主要是依靠特定酶產生菌的篩選方法主要是依靠酶催化的反應性質、作用底物的特異

14、酶催化的反應性質、作用底物的特異性、底物和產物的特性以及酶在細胞性、底物和產物的特性以及酶在細胞中所處的位置進行設計。中所處的位置進行設計。v細胞外的水解酶細胞外的水解酶 1 1、溶解度、溶解度不溶性底物如淀粉、纖維素、酪素、不溶性底物如淀粉、纖維素、酪素、細胞壁等培養(yǎng)基中生長細胞壁等培養(yǎng)基中生長透明圈大小透明圈大小 2 2、酸堿度、酸堿度酸堿指示劑酸堿指示劑變色圈大小和顏色變色圈大小和顏色3 3、顏色、顏色合成特定底物與酶反應變色合成特定底物與酶反應變色變色變色深淺深淺v復篩是在初篩的基礎上篩選產酶量高，性能復篩是在初篩的基礎上篩選產酶量高，性能更符合要求的菌株，要求測定方法準確可靠。更符合

15、要求的菌株，要求測定方法準確可靠。v復篩多采用搖瓶培養(yǎng)的方法。將初篩出來的復篩多采用搖瓶培養(yǎng)的方法。將初篩出來的菌種移入三角瓶振蕩培養(yǎng)，對產物進行分析菌種移入三角瓶振蕩培養(yǎng)，對產物進行分析檢定，找出產酶量最高，性能符合要求的菌檢定，找出產酶量最高，性能符合要求的菌株。株。自然選育自然選育v定義：定義： 不經人工處理，利用微生物的自然突變進行不經人工處理，利用微生物的自然突變進行菌種選育的過程稱為自然選育。菌種選育的過程稱為自然選育。 自然突變一般有兩種原因自然突變一般有兩種原因 誘變育種誘變育種v 定義：定義： 誘變育種是人為的利用物理化學等因素，使誘變育種是人為的利用物理化學等因素，使誘變的

16、細胞內遺傳物質染色體或誘變的細胞內遺傳物質染色體或DNADNA的片段發(fā)的片段發(fā)生缺失、易位、倒位、重復等畸變，或生缺失、易位、倒位、重復等畸變，或DNADNA的的某一堿基對發(fā)生改變某一堿基對發(fā)生改變 ( (又稱點突變又稱點突變) )，從而使，從而使微生物的遺傳物質微生物的遺傳物質DNADNA和和RNARNA的化學結構發(fā)生的化學結構發(fā)生變化，引起微生物的遺傳變異。變化，引起微生物的遺傳變異。 誘發(fā)突變的變異幅度遠大于自然突變誘發(fā)突變的變異幅度遠大于自然突變 。常用誘變劑常用誘變劑第三節(jié)第三節(jié) 發(fā)酵條件及控制發(fā)酵條件及控制工藝流程工藝流程培養(yǎng)培養(yǎng)基制備基制備滅滅菌菌接接種種發(fā)酵發(fā)酵冷冷卻卻液體液體菌